牛白血病的危害及防控策略

郭永麗，張 君，張俊峰，孫 剛，高明春

（1.黑龍江省動物疫病預防與控制中心，黑龍江哈爾濱 150069；2.東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江哈爾濱 150030）

牛白血病是牛最常見的腫瘤性疾病之一，由牛白血病病毒（bovine leukemia virus，BLV）感染引起。BLV 屬于反轉錄病毒科逆轉錄病毒屬，是1969年在天然宿主牛身上被首次分離到的一種致癌病毒[1]。BLV 可將其核酸整合到感染細胞的基因組中，因此被感染的動物會終身帶毒，并引起廣泛的免疫功能異常，從而導致產(chǎn)奶量降低、產(chǎn)肉量下降和流產(chǎn)[1]。BLV 已廣泛流行于世界各國，且很容易跨物種傳播，目前已證實除了可感染牛（包括牦牛、水牛以及野生牛類）外，還可以感染綿羊和山羊，BLV 感染宿主范圍的擴增最終增加了感染人類的可能性[2-3]。BLV 與人類逆轉錄病毒，如人類嗜T細胞病毒（human t-cell leukemia virus，HTLV）和人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的病原特征相似，并且相關研究已經(jīng)證實人類乳腺癌、肺癌組織和部分人類血液樣品中可檢出BLV[4-5]，因此有學者認為BLV 與人類腫瘤的發(fā)生有關，但尚存爭議。隨著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，BLV感染率有上升的趨勢[1，6]，對養(yǎng)牛業(yè)和人類的潛在威脅很大。本文從病原學、流行現(xiàn)狀、危害與潛在風險、診斷和防控方面概述了BLV 的研究進展，以期為牛白血病的診斷和防控提供參考。

1 病原學

BLV 基因組由兩條線狀單鏈RNA 構成。病毒中的反轉錄酶以RNA 為模板合成前病毒DNA，并將其整合到細胞基因組中，再在B 淋巴細胞中產(chǎn)生持續(xù)性感染[7]。BLV 結構蛋白主要是囊膜中的gp 蛋白和芯髓中的P 蛋白，其中gp51 和P24 兩種蛋白的抗原活性最高，臨床上通常被用作抗原進行血清學試驗，以檢測特異性抗體[7]。BLV 對外界環(huán)境抵抗力弱，對溫度較敏感，通常在56 ℃中30 min 即可失去感染力，60 ℃以上可迅速被滅活[8]。

2 全球流行狀況

澳大利亞和新西蘭分別于1983年和1996年實施了全國性的牛白血病根除和控制計劃，到2013年12 月，澳大利亞宣布99.7%的奶牛群已根除牛白血病，而新西蘭自2008年以來未在奶牛群發(fā)現(xiàn)BLV[6]。

在北美洲，美國83.9%的奶牛群和39%的肉牛群呈BLV 陽性[6]，加拿大37.2%的奶牛和89%的牛群呈BLV 陽性[13-14]。在南美洲，BLV 流行率相對較高，大多數(shù)國家存在BLV。巴西BLV 流行率因州而異，從17.1%到60.8%不等[15-16]。阿根廷個體和群體水平的BLV 患病率分別高達77.4%和90.9%[17-18]。此外，智利、秘魯、委內(nèi)瑞拉、烏拉圭、巴拉圭和哥倫比亞報告的個體感染率介于19.8%～54.7%[6]。

BLV 在我國奶牛場非常普遍，個別奶牛場的個體感染率高達49.1%，而肉牛感染率僅為1.6%[19]。此外，血清學檢測顯示，我國20.1%的牦牛呈BLV 陽性[20]。日本的流行病學研究顯示，乳牛群和肉牛群的BLV 感染率分別為40.9%和28.7%，其中2 歲以上的奶牛群和肉牛群的感染率分別達到78% 和69%[21-22]。在韓國，54.2%的奶牛呈BLV 陽性，而只有0.14%的肉牛感染了BLV[23]。在泰國，PCR 和ELISA 兩種方法檢測牛的BLV 感染率分別為5.3%～87.8%和11.0%～100%[24]。菲律賓的BLV 感染率從4.8%到9.7%不等[25]，而緬甸的BLV 感染率為9.1%[26]。

中東地區(qū)的BLV 感染率相對較低[6]。伊朗一項血清學調(diào)查顯示，該國BLV 感染率在22.1%～25.4%之間[27]。在以色列，BLV 感染率約為5%；在沙特阿拉伯，20.2%的奶牛呈BLV 陽性；土耳其有48.3%的奶牛群呈BLV 血清學陽性[6]。

3 危害及潛在風險

3.1 對牛的危害

大多數(shù)BLV 感染牛都是無癥狀的病毒攜帶者，既沒有任何臨床癥狀，也沒有任何淋巴細胞數(shù)量的變化，但會表現(xiàn)出一定程度的免疫失調(diào)，從而影響各類免疫細胞，并改變未感染細胞的正常功能，引起產(chǎn)奶量減少、疫病發(fā)病率增高等問題，可造成一定的經(jīng)濟損失[28]。約1/3 的BLV 感染牛可發(fā)展為良性B 淋巴細胞腫瘤，只有不到5%的感染牛會發(fā)生惡性B 細胞淋巴瘤。這種惡性的B 細胞淋巴瘤主要發(fā)生在4 歲以上牛，會進一步導致脾臟破裂和淋巴結顯著增大。BLV 誘導的腫瘤細胞可以擴散到皺胃、心、腸、腎、肺、肝和子宮，導致的臨床癥狀多種多樣，主要包括消化障礙、體重減輕、虛弱、產(chǎn)奶量減少、食欲不振和淋巴結腫大等[29]。此外，BLV 還會損害免疫系統(tǒng)，從而導致機會性感染。

3.2 對人類的潛在風險

目前已發(fā)現(xiàn)7種病毒會導致全球10%～15%的人類患癌癥，而在全世界奶牛中高度流行的BLV可能與人類乳腺癌有關[29-30]。1969年首次在牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)BLV 后，越來越多的人開始擔憂該病毒會感染人類并導致疾病。在發(fā)現(xiàn)BLV 后的十年內(nèi)，使用瓊脂免疫擴散和補體結合試驗的研究均未能在人血清中發(fā)現(xiàn)BLV 抗體，因此大部分人認為，人類暴露于BLV 并感染的可能性不大，該病毒不會對公共健康造成危害[30]。2003年，Buehring 等[31]用免疫印跡法檢測257 例人血清中抗BLV 衣殼抗原P24的4種同型抗體（IgG1、IgM、IgA 和IgG4），發(fā)現(xiàn)74%的人血清中至少有1種抗體可與BLV 發(fā)生反應，但此次結果并不一定意味著人類真的感染了BLV。然而，給綿羊注射來自BLV 陽性奶牛的生奶可以刺激產(chǎn)生抗體，而注射巴氏殺菌的對照奶則未產(chǎn)生抗體[32]。用原位PCR 和免疫組織化學檢測乳腺組織，發(fā)現(xiàn)BLV 定位于乳腺分泌上皮，表明BLV 有整合到人體細胞與病毒擴散的風險[33]。此外，BLV 檢出率和人乳腺癌之間存在正相關關系（36%～59%，正常組織中為29%～45%），多達37%的乳腺癌病例可能歸因于BLV 暴露[29]；進一步研究表明，乳腺癌患者乳腺上皮組織中BLV 核酸的檢出率（59%）明顯高于正常對照組（29%），在有癌前病變的婦女中，BLV 核酸的檢出率介于乳腺癌婦女和正常對照組之間（38%）[30]。在檢測乳腺癌組織或DNA 的8 項研究中，有6 項研究在乳房組織中發(fā)現(xiàn)了BLV，這有力地表明BLV 確實會感染人類，而乳房可能是感染的目標組織[34]。

4 診斷

目前已研發(fā)出多種用于診斷牛白血病的技術，并在各國應用。這些診斷方法主要分為兩大類，包括基于抗體的血清學檢測和基于前病毒DNA 的聚合酶鏈反應（PCR）檢測。

值得一提的是，《中華人民共和國食品安全法》修訂的亮點是從指導思想上把事后處理變?yōu)槭虑邦A防。新版食品安全法確立了以食品安全風險監(jiān)測和評估為基礎的科學管理制度，明確食品安全風險評估結果作為制定、修訂食品安全標準和對食品安全實施監(jiān)督管理的科學依據(jù)，這些條例都適應了新的行業(yè)時期發(fā)展需要。

4.1 血清學檢測

牛白血病的間接診斷方法，尤其是基于抗體的檢測，主要是針對由gag基因編碼的P24 衣殼蛋白以及由env-gp51編碼的gp51 胞外蛋白產(chǎn)生的抗體，最早可以在BLV 感染后2～3 周檢測到，并且可作為終身檢測的靶標[35]。此外，P24 衣殼蛋白是宿主免疫反應的主要蛋白，誘導高抗體滴度，而gp51 也可在感染動物體中激發(fā)大量特異性抗體的產(chǎn)生[36-37]。因此，使用常規(guī)血清學技術如瓊脂免疫擴散法（AGID）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、被動血凝試驗（PHA）和放射免疫分析（RIA）可以檢測牛血清、牛奶以及BLV 感染細胞培養(yǎng)上清中的抗體[6]。AGID 相對便宜，可用于同時篩查多個血清樣本，但是不夠靈敏，也不適合分析牛奶樣本。ELISA 是一種高度敏感且易于實施的程序，可用于血清和牛奶樣本的分析，然而它在感染早期的牛血清樣本中易產(chǎn)生假陰性結果，在含有母源抗體的犢牛樣本中易產(chǎn)生假陽性結果。PHA 的目的是檢測BLV 糖蛋白，但PHA 的檢測效率對pH、溫度和胰蛋白酶敏感。RIA 適用于動物短期暴露后的診斷，但不適用于大規(guī)模篩查。總體而言，由于母源抗體的存在，這些基于抗體的檢測方法并不適用于6個月以下的犢牛，因為可能會出現(xiàn)假陽性結果[6]。

4.2 前病毒DNA 檢測

BLV 可以整合到宿主基因組內(nèi)的不同位點并保留在細胞基因組中，在BLV 感染牛的整個病程中都可以檢測到1個拷貝的全長前病毒基因組[38]。BLV 誘導的腫瘤和BLV 感染的細胞均含有前病毒，基于前病毒DNA 的PCR 檢測方法可以加快BLV 檢測，因而在世界范圍內(nèi)被廣泛應用于BLV 檢測。這些PCR 檢測方法包括標準PCR、巢式PCR、實時定量PCR（QPCR）和直接基于血液的PCR[39-42]。與宿主基因相比，BLV 前病毒拷貝數(shù)通常非常低，因此大多數(shù)采用嵌套設計的巢式PCR 系統(tǒng)代替標準PCR 檢測BLV[25]，但這些套式檢測非常敏感，有時會因為DNA 污染而獲得假陽性結果。QPCR檢測需要昂貴的儀器和試劑，并且涉及復雜的樣品制備過程。直接基于血液的PCR 檢測可以在不需要DNA 分離和純化的情況下擴增目標DNA 區(qū)域，使用該方法檢測BLV 前病毒DNA 特異性高，成本低，便于及時鑒別BLV 感染的牛[42-43]。

基于篩查前病毒DNA 的PCR 方法診斷BLV感染，不僅拓寬了可使用的樣本范圍，而且提高了檢測的敏感性、特異性和效率，并且耗時較少。雖然PCR 檢測可用于早期感染的BLV 檢測[44]，但其涉及復雜的樣本制備過程，如果發(fā)生交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果。此外，PCR 檢測方法需要特定的實驗室設施，包括PCR 儀器，以及特異性引物和探針的設計。COCOMO 算法是一種用于設計簡并引物集的方法，該引物集可擴增目標區(qū)域內(nèi)的所有可用序列。最近研發(fā)的BLV-Cocomo-qPCR 方法，以極高的靈敏度測定BLV 前病毒載量，并能夠擴增已知和新產(chǎn)生的BLV 變異體[45-46]，這證明了BLV 前病毒載量不僅與BLV 感染量相關，而且與BLV 疾病進展相關[35，47]。

4.3 其他方法

除了上述兩種常見的檢測技術之外，牛白血病的診斷方法還包括Western blotting 檢測病毒蛋白，合胞體形成試驗以及間接免疫熒光檢測BLV抗原。

5 防控策略

雖然大多數(shù)歐洲國家和大洋洲國家已經(jīng)成功實施了有效的BLV 根除計劃，但全球范圍內(nèi)的BLV 感染率仍然很高。BLV 自然感染后，可形成持續(xù)感染，導致臨床結果各不相同。該病毒感染淋巴細胞，并將DNA 中間體作為前病毒整合到細胞基因組中。因此，暴露在含已感染BLV 的生物材料中可能會導致病毒的傳播。目前，BLV 感染尚無有效的疫苗和治療藥物，需要采取及時有效的防控策略才能有效阻斷BLV 的傳播。

5.1 低流行率國家凈化策略

一旦通過血液學、基因組學或血清學方法鑒定出BLV 感染陽性動物，就立即從牛群中清除，并迅速宰殺[48-49]。這種防控策略有助于在相對較短的時間內(nèi)實現(xiàn)畜群和區(qū)域范圍內(nèi)無BLV感染狀態(tài)，西歐一些國家成功根除該病也證明了這一策略的有效性[49-50]，而美國、加拿大、阿根廷和日本等國家缺乏財政補貼政策支持而未能堅持該策略的執(zhí)行導致BLV 凈化失敗[49]。由于執(zhí)行該凈化策略的經(jīng)濟成本非常高，因此適用于BLV 感染流行率低的畜群并需要國家和地方政府的財政補貼政策支持。

5.2 高流行率國家凈化策略

這一防控策略是通過隔離而不是撲殺BLV 感染的動物來降低部分凈化成本，按照程序持續(xù)對血清學陽性動物進行檢測，并將BLV 感染牛群和血清學陰性牛群嚴格限定在隔離區(qū)域[49]。隔離區(qū)域可以是單獨的牛舍或者同一牛舍的不同區(qū)域，但均需使用獨立的飼養(yǎng)設備或至少對非一次性設備進行嚴格的消毒和衛(wèi)生處理以避免BLV 的傳播。這種策略的主要優(yōu)點是減少了由于提前強制性撲殺和更替BLV 陽性動物而造成的巨大損失。雖然實施要求相當高，但這種策略有助于降低BLV 流行率甚至根除該病，缺點是在牛群中存在重新永久性引入BLV 感染動物的風險，因此，它的凈化速度可能比撲殺策略慢[49]。

5.3 通用的牧場管理與生物安全策略

此策略旨在通過加強管理，切斷血液、牛奶、分泌物、排泄物、注射器或手術器械等傳播途徑，以防止BLV 感染的擴散，主要包括以下措施：

（1）在接種疫苗或治療操作期間使用單獨的一次性針頭和注射器；

（2）使用單獨的一次性產(chǎn)科套袖或至少在檢查BLV 陽性動物和未感染的動物之間更換；

（3）在去角、植入、燒灼、閹割或打耳標等操作過程中使用一次性設備或至少對可重復使用的材料和手術器械進行清潔、消毒或滅菌；

（4）在脫角過程中使用電氣或燃氣裝置，而不是使用刨削等設備；

（5）用未受BLV 感染母牛的初乳或全脂奶、巴氏消毒BLV 感染牛的初乳或代乳粉飼喂犢牛；

（6）使用無BLV 感染的母牛和公牛進行自然和/或人工授精和胚胎移植；

（7）消滅昆蟲以盡量減少通過節(jié)肢動物作為媒介在動物之間傳播的可能性；

（8）其他有效的管理措施，包括：通過檢測和檢疫/隔離新引進的動物，防止受感染的動物進入牛群；按年齡將動物分開，以減少接觸；盡量減少動物在擠奶/喂養(yǎng)區(qū)域之間的流動；使用單獨的小牛舍飼養(yǎng)新生牛犢；限制外部訪客進入。

這種策略既不需要對設施進行大量投資，也不需要移走受感染的牛，并可持續(xù)監(jiān)測牛群的血清學狀態(tài)。其缺點是對實踐執(zhí)行力的要求非常高，容易受到環(huán)境和人為變量的影響。

5.4 切斷向人類傳播的途徑

作為一種潛在危害人類健康的病原，控制傳染源和切斷傳播途徑是最有效的預防措施。在牛群中，BLV 通過牛奶、血液（叮咬的昆蟲、受污染的獸醫(yī)/養(yǎng)殖設備、子宮內(nèi)）傳播，因此人類很可能通過同樣的途徑感染。BLV 的滅活可通過巴氏消毒牛奶和徹底烹調(diào)牛肉來進行，所以不要喝生的奶制品或吃生的牛肉可以切斷BLV 向人類傳播的途徑。第二種可能的傳播途徑是通過血液進行人與人之間傳播。目前，人類獻血時并不對BLV 進行檢測，最近對人類血庫的一項研究也表明，45%的獻血志愿者白細胞感染了BLV[50]，這表明BLV感染具有通過血液實現(xiàn)人與人之間傳播的可能性。此外，應注意BLV 還可以通過哺乳和血液暴露實現(xiàn)母嬰傳播。

6 小結

BLV 感染引起的牛白血病是流行于世界各地的一種慢性腫瘤性傳染病，發(fā)病后臨床癥狀不明顯，尚無有效的疫苗和治療措施，目前可對血清學抗體和前病毒DNA 進行檢測。越來越多的研究表明，BLV 可能是人類乳腺癌的危險因素，消除BLV 的來源及其傳播可能有助于降低人類乳腺癌的發(fā)病率和死亡率。綜上所述，BLV 感染不僅給養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失，還對人類健康存在潛在的威脅，所以在養(yǎng)殖生產(chǎn)環(huán)節(jié)，要加強牧場管理和生物安全，切斷BLV 向人類傳播的途徑，以預防為主，嚴格檢疫，做到早發(fā)現(xiàn)早處理。