鼻咽癌患者放療后血清玻連蛋白的變化研究*

何奮軍 劉少玲 張同韓 鄭巧儀 朱玉亮 孔祥波

放射性頜骨壞死（osteoradionecrosis of the jaws，ORNJ）是鼻咽癌放射治療后的嚴(yán)重并發(fā)癥，其發(fā)病率為1%～37%[1]，其臨床表現(xiàn)為頜面部軟、硬組織壞死潰爛，且伴有明顯的疼痛癥狀，給患者的健康和生活質(zhì)量帶來(lái)嚴(yán)重危害[1-3]。目前，對(duì)這種并發(fā)癥的治療不管是手術(shù)還是保守治療，效果均不盡人意。X 線和CT 等影像學(xué)檢查方法是目前診斷ORNJ 的主要臨床手段。但是，臨床上ORNJ 患者出現(xiàn)疼痛等不適、影像學(xué)檢查方法發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)有改變時(shí)，已經(jīng)意味著ORNJ 處于病情快速發(fā)展的階段。因此，ORNJ 的早期診斷是目前臨床上的一個(gè)難題，其原因主要就是由于缺乏對(duì)ORNJ 早期發(fā)現(xiàn)和靈敏監(jiān)測(cè)的手段。通過(guò)對(duì)比及查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在機(jī)體炎癥發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，血清中VN 的濃度有了變化[4-5]。那么，在頜骨放射性炎癥甚至骨壞死方面其是否也會(huì)發(fā)生變化呢？本文將利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)其在鼻咽癌放療后未發(fā)生ORNJ及ORNJ 患者血清的變化規(guī)律進(jìn)行初步分析，探求其作為預(yù)測(cè)ORNJ 發(fā)生的潛在血清標(biāo)志物的可能性，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011 年10 月-2020 年9 月中山市人民醫(yī)院發(fā)生鼻咽癌放療后ORNJ 患者與放療后未發(fā)生ORNJ 患者血清各20 份標(biāo)本，以及20例來(lái)自中山市人民醫(yī)院體檢中心正常人的20 份血清標(biāo)本，分別作為試驗(yàn)組、試驗(yàn)對(duì)照組、空白對(duì)照組。ORNJ 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床診斷為ORNJ 的未經(jīng)過(guò)治療的鼻咽癌患者；（2）無(wú)化療史；（3）既往有鼻咽癌放療病史；（4）既往無(wú)器質(zhì)性疾病史；（5）未接受血制品輸注者。未發(fā)生ORNJ 患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床診斷為放療結(jié)束10 年以上且未發(fā)生ORNJ 的鼻咽癌患者；（2）無(wú)化療史；（3）既往鼻咽癌病史；（4）既往無(wú)器質(zhì)性疾病史；（5）未接受血制品輸注者。所有患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：半年內(nèi)服用氟化物、降鈣素等影響骨代謝藥物的患者。所有患者依從性好，放療后定期在?？崎T(mén)診就診且每年至少兩次在口腔門(mén)診行牙齒潔治等治療，無(wú)拔牙等高危因素發(fā)生?？瞻讓?duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）健康的正常人；（2）無(wú)放化療史；（3）既往無(wú)器質(zhì)性疾病史；（4）無(wú)接受血制品輸注者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）曾服用氟化物、降鈣素等影響骨代謝的藥物；（2）有鼻咽癌家族史。所有患者的放療及后續(xù)回訪、放療后治療均在中山市人民醫(yī)院完成，且適用并接受國(guó)際抗癌聯(lián)盟指引的規(guī)范化鼻咽癌放療方案。該研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 所有病例均無(wú)手術(shù)治療史，且采用70 Gy 根治劑量。試驗(yàn)組和試對(duì)照組病例均采用調(diào)強(qiáng)適形放療。

1.2.2 血清標(biāo)本采集及處理 血清是在清晨空腹抽取血樣，標(biāo)本于室溫下凝固1～2 h 后離心（2 500 g，10 min），血清200 μL 分裝，-80 ℃保存。所有標(biāo)本均在中山市人民醫(yī)院以統(tǒng)一的條件和方法分離所得。試驗(yàn)血清均僅一次凍融。

1.2.3 主要的實(shí)驗(yàn)試劑、耗材和儀器 ELISA 試劑盒（美國(guó)GenWay Biotech 公司原產(chǎn)），0412-2 型低速離心機(jī)（產(chǎn)地：廣州），酶標(biāo)分析儀（型號(hào)：FC，產(chǎn)地：美國(guó)）等。

1.2.4 血清VN 的濃度 采用固相、單克隆抗體酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測(cè)法檢測(cè)血清VN 的濃度。（1）按照說(shuō)明進(jìn)行試劑的稀釋以及保存。（2）按照說(shuō)明進(jìn)行VN 標(biāo)準(zhǔn)液的配置。（3）提前30 min從4 ℃冰箱中取出試劑盒至室溫（25 ℃）；輕震蕩試劑盒2 min，打開(kāi)鋁箔袋，取出酶標(biāo)板，將標(biāo)記孔條放置于酶標(biāo)板框內(nèi)。（4）吸取100 μL 抗體-POD 結(jié)合物（樣品瓶1）至基板的對(duì)應(yīng)孔，隨后依次加50 μL 樣品、標(biāo)準(zhǔn)品（樣品瓶2）及質(zhì)控液至相應(yīng)微孔?；旌?，用鋁箔密封微孔板后室溫20～30 ℃孵育2 h。（5）用洗滌緩沖液400 μL 吸收、洗凈每孔內(nèi)容物，重復(fù)4 次，每次洗滌步驟之間保證微孔內(nèi)容物盡量被紙巾吸凈，特別是在最后一次洗滌以后。（6）基板的孵育：每孔加入100 μL 的底物溶液（樣品瓶5），在室溫20～30 ℃下孵育15 min。（7）按照同樣的順序在每個(gè)孔中依次添加100 μL終止液（樣品瓶3），輕輕點(diǎn)叩板混合均勻。（8）立即將所測(cè)得樣本置于波長(zhǎng)為450 nm 可見(jiàn)光處進(jìn)行測(cè)量，得到VN 標(biāo)準(zhǔn)液的OD 值和濃度。為減少誤差，每個(gè)標(biāo)本都重復(fù)檢測(cè)2 次，得出結(jié)果后取平均值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作均采用four-parameter logistic 方法進(jìn)行分析及必要的轉(zhuǎn)換、補(bǔ)充運(yùn)算。將標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品的OD450 值利用計(jì)算機(jī)軟件作相關(guān)分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控液OD 值來(lái)計(jì)算質(zhì)控液濃度。然后據(jù)VN 標(biāo)準(zhǔn)品OD 值和標(biāo)準(zhǔn)液濃度，通過(guò)計(jì)算機(jī)four-parameter logistic 軟件計(jì)算分析得到血清VN 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出曲線的擬合方程：y=（A-D）/[1+（x/C）B]+D，A=4.041 9，B=-1.001 1，C=290.553 2，D=0.038 3，r2=0.999 6。然后，根據(jù)血清VN 標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)各組血清標(biāo)本的OD 值，利用four-parameter logistic 軟件計(jì)算出試驗(yàn)組、試驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組各血清樣本的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料用（）表示，多組間比較采用方差分析；不滿足正態(tài)性分布的采用M（P25，P75）表示，且三組試驗(yàn)數(shù)據(jù)不滿足方差齊性分布，比較采用非參數(shù)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較 試驗(yàn)組20 例，其中男12 例，女8 例；年齡36～64 歲，平均（49.3±3.8）歲；試驗(yàn)對(duì)照組20 例，其中男13 例，女7 例；年齡31～78 歲，平均（47.5±4.2）歲；空白對(duì)照組20例，其中男10 例，女10 例；年齡33～67 歲，平均（46.9±3.4）歲。三組患者的性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 三組VN 濃度比較 試驗(yàn)組為19.62（8.97，27.71）ng/mL，試驗(yàn)對(duì)照組為2.34（1.34，5.21）ng/mL，空白對(duì)照組為19.24（8.49，22.68）ng/mL，試驗(yàn)對(duì)照組的VN 濃度低于試驗(yàn)組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的VN 濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

關(guān)于ORNJ 發(fā)生的機(jī)制目前還不是很明了。早在1970 年，Meyer[6]就提出了放療、感染和創(chuàng)傷“三要素”學(xué)說(shuō)，并認(rèn)為ORNJ 是由于放療所引起的頜骨組織活力喪失，然后細(xì)菌侵入并造成廣泛組織破壞的感染性疾病。但文獻(xiàn)[7]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，ORNJ局部病灶細(xì)菌譜分布廣泛，呈現(xiàn)出菌群多樣性，且部分患者為無(wú)菌性壞死，這些也說(shuō)明“感染學(xué)說(shuō)”雖然可解釋大部分的病例，但卻不一定是ORNJ 發(fā)生的機(jī)制。此后，Marx[8]提出了“三低”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為ORNJ 的發(fā)生是由于放療對(duì)骨組織的直接殺傷導(dǎo)致輻照組織內(nèi)低氧、低血管密度以及低細(xì)胞。2004年，Delanian 等[9]提出了放射誘導(dǎo)組織纖維萎縮的觀點(diǎn)，認(rèn)為放療導(dǎo)致局部損傷組織細(xì)胞釋放大量的氧自由基從而誘發(fā)血管內(nèi)皮急性炎癥性反應(yīng)，引起局部微血管栓塞，結(jié)果導(dǎo)致組織細(xì)胞缺血缺氧壞死。在大量的氧自由基的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、腫瘤壞死因子-α、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-β 等的釋放，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞異常增殖，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)并不斷沉積從而吞噬周圍組織，最終的結(jié)果是頜骨壞死的發(fā)生。文獻(xiàn)[10]研究也認(rèn)為，放射誘導(dǎo)的纖維萎縮機(jī)制可能在ORNJ 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。王松靈[11]通過(guò)建立小型豬下頜骨放射性骨壞死模型，認(rèn)為放療對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷導(dǎo)致局部血流的減少，是引起ORNJ 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。也有觀點(diǎn)認(rèn)為，ORNJ 主要病理過(guò)程是骨組織的代謝和自身調(diào)節(jié)產(chǎn)生障礙，在這一過(guò)程中，影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞增殖、凋亡的各種因素均可對(duì)骨代謝產(chǎn)生調(diào)控作用[12]?？紫椴ǖ萚13]采用X射線照射可引起人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的電離輻射損傷，成功建立了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞放射損傷的細(xì)胞模型，提示ORNJ 發(fā)病機(jī)制可能和電離輻射有關(guān)。葛雅平等[14]對(duì)30 余例頭頸部腫瘤患者放療前、放療30 Gy 后、放療50 Gy 后的血、尿標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，以了解放療對(duì)頜骨骨代謝的影響。結(jié)果表明電離輻射能夠引起骨代謝特異性生化指標(biāo)的改變并且這種改變能夠在血清中得到較好地反映。

但這些方法主觀性很強(qiáng)，所選取的蛋白質(zhì)不一定能客觀反映兩者的差異。蛋白組學(xué)技術(shù)是分離ORNJ 患者血清和正常人群差異蛋白的一種方法。早在2006 年，Menard 等[15]應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)研究放療后患者血清中與放療相關(guān)的標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)碎片或肽類等與放療相關(guān)。孫先閣[16]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)通過(guò)分析ORNJ 患者與未發(fā)生ORNJ患者血清蛋白質(zhì)譜的差異表達(dá)，尋找到包括VN 在內(nèi)的ORNJ 患者反映頜骨電力輻射骨代謝的多個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，這些差異蛋白可能是反映ORNJ 骨代謝的血清標(biāo)志物。李潔等[17]建立大鼠下頜骨體放射模型，于照射前在大鼠下頜骨體部局部注射特定蛋白質(zhì)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察證實(shí)了X 線照射前注射其對(duì)下頜骨ORNJ 的發(fā)生具有較好的預(yù)防作用，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，從另一個(gè)方面說(shuō)明ORNJ 發(fā)生發(fā)展可能存在血清標(biāo)志物。

人類玻連蛋白是一種多功能的糖蛋白，存在于血漿中，具有黏附功能。其相對(duì)分子量為75 000，由一條單鏈組成。關(guān)于VN 在機(jī)體感染方面的研究，張春麗[18]認(rèn)為：膿毒癥及膿毒癥凝血功能障礙患者血漿標(biāo)本中VN 水平明顯低于正常健康人及社區(qū)獲得性肺炎患者，VN 水平與膿毒癥凝血功能障礙患者PTA 具有顯著相關(guān)性。VN 在膿毒癥凝血功能障礙中發(fā)揮重要的作用，且其不同亞型其功能不同。另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈疾病患者血清VN 表達(dá)水平高于對(duì)照組；且隨著疾病程度加重，其表達(dá)水平呈逐漸升高趨勢(shì)，提示VN 可能參與了冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病過(guò)程[19]。究其發(fā)生的機(jī)制，文獻(xiàn)[20]研究認(rèn)為VN 參與動(dòng)靜脈血栓形成過(guò)程，例如冠心病患者血清中VN 水平高于正常人，且3 支病變者血清中VN 含量顯著高于2 支病變者。孫飛等[21]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VN 在PTE 中國(guó)白兔肺動(dòng)脈內(nèi)皮中表達(dá)明顯上調(diào)，VN 可能參與了肺血栓栓塞病程中的血栓形成過(guò)程，VN 與PAI-1 或血小板等分子的結(jié)合位點(diǎn)或許可成為阻斷血栓形成的靶點(diǎn)。這或許是VN參與機(jī)體血栓形成導(dǎo)致組織缺血缺氧而壞的原因之一。VN 羧基末端區(qū)域包含纖溶酶原結(jié)合位點(diǎn)，此區(qū)域下游則是由一群堿性氨基酸序列組成的2 個(gè)共有肝素結(jié)合位點(diǎn)，VN 形成多聚體時(shí)暴露此位點(diǎn)，參與Ⅰ型膠原、骨鈣素的特異性結(jié)合[22]，這可能是VN 參與骨代謝的機(jī)制之一。但關(guān)于VN 在破骨還是成骨方面的作用或變化趨勢(shì)的報(bào)道不盡相同。葛銀林等[4]研究發(fā)現(xiàn)VN 具有誘導(dǎo)體外分離純化培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rMSC）向成骨方向分化的作用。Schvartz 等[5]指出VN 含有RGD 序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽序列），通過(guò)這段序列VN 可以與αvβ3 受體結(jié)合來(lái)參與細(xì)胞的黏附擴(kuò)散以及遷移，并已證明能夠抑制在體外、內(nèi)破骨細(xì)胞吸收。而玻連蛋白受體也有較多的和破骨相關(guān)的基礎(chǔ)研究。Horton 等[23]在1985 年就指出玻連蛋白受體（αvβ3）可以作為一種抗體來(lái)鑒別組織中的破骨細(xì)胞。Chen 等[22]研究雌激素對(duì)破骨細(xì)胞影響的體外實(shí)驗(yàn)：在28 d 對(duì)單核細(xì)胞和人成骨細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD11b 和CD14 的表達(dá)下調(diào)，玻連蛋白受體上調(diào)。破骨細(xì)胞培養(yǎng)28 d 后，17β-estradiol 加入培養(yǎng)細(xì)胞中會(huì)引起玻連蛋白受體（αvβ3）的明顯下降。由此可見(jiàn)，VN 及其受體可能在成骨、破骨方面有著獨(dú)特的作用。云帆等[24]認(rèn)為，玻連蛋白對(duì)破骨細(xì)胞的激活有重要的作用，破骨細(xì)胞是一種巨大的多核細(xì)胞，起源于單核巨噬細(xì)胞/單核系造血前體細(xì)胞，在骨吸收過(guò)程中發(fā)揮重要作用。破骨細(xì)胞的形成和活性異?？蓪?dǎo)致骨質(zhì)疏松、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)置換后假體無(wú)菌性松動(dòng)等許多疾病，因此破骨細(xì)胞是治療這些疾病的靶點(diǎn)之一。骨鹽被認(rèn)為是破骨細(xì)胞識(shí)別的重要成分，但是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)骨基質(zhì)不是破骨細(xì)胞激活的必需成分，玻連蛋白包被的培養(yǎng)皿也能使破骨細(xì)胞出現(xiàn)骨吸收的特有形態(tài)，因此，玻連蛋白對(duì)破骨細(xì)胞的激活有重要的作用。

雖然VN 在ORNJ 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的機(jī)制尚不明確，但在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)了VN 在試驗(yàn)組試驗(yàn)對(duì)照組的VN 濃度低于試驗(yàn)組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）這可能預(yù)示在接受電離輻射及發(fā)生頜骨壞死后，其頜骨組織中的破骨細(xì)胞活性和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收活動(dòng)以及成骨細(xì)胞活性和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成活動(dòng)在一定時(shí)期內(nèi)的變化規(guī)律、方向，進(jìn)而造成了骨組織的壞死。如果掌握了血清中VN 的變化規(guī)律，將有利于對(duì)鼻咽癌放療后ORNJ 的發(fā)生有較為準(zhǔn)確的預(yù)判，從而實(shí)施一定的措施，阻止其發(fā)生。結(jié)合文獻(xiàn)，可以初步認(rèn)為VN 在ORNJ 中起到一定作用，可能是ORNJ發(fā)生的血清標(biāo)志物。

本試驗(yàn)樣本量小極有可能導(dǎo)致檢驗(yàn)功效偏低，仍然有可能導(dǎo)致假陽(yáng)性假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。后續(xù)的研究需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、嚴(yán)格入組條件，減少臨床個(gè)體差異對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的影響和偏差，建立和完善ORNJ 相關(guān)的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。另外，對(duì)選定更多數(shù)量的鼻咽癌患者進(jìn)行跟蹤檢查，以獲得其血清標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)從而有效預(yù)測(cè)鼻咽癌放療后ORNJ 的發(fā)生。