腦卒中后抑郁中醫(yī)病證結(jié)合動物模型的思考

邵樂，焦欣，劉林，佘顏*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

腦卒中是嚴(yán)重危害人類生命健康的重大心腦血管疾病之一，數(shù)據(jù)表明，全世界每年新增腦卒中患者約1 690萬人[1]。腦卒中患者極易并發(fā)抑郁癥，也是腦卒中后最常見的并發(fā)癥。腦卒中后抑郁(post-stroke-depression，PSD)屬于中醫(yī)中風(fēng)合并郁證的范疇，其發(fā)病率高達(dá)38%，抑郁使得腦卒中患者存活率下降51%，為影響患者康復(fù)、甚至輕生的第一大元兇，是全球面臨的一大難題[2]。中醫(yī)藥通過辨證論治，采用中藥復(fù)方可多成分多途徑多靶點治療PSD，而建立與臨床中醫(yī)辨證分型相符的PSD動物模型對于開展其基礎(chǔ)研究具有重要意義。目前PSD造模為采用腦卒中模型復(fù)合抑郁模型而成，現(xiàn)將PSD中醫(yī)病證結(jié)合動物模型的造模方法和相關(guān)思考闡述如下。

1 實驗動物

目前PSD模型的動物造模主要采用大鼠及小鼠，常用Wistar大鼠[3-4]、Sprague-Dawley大鼠[5]及C57BL/6J小鼠[6-7]、balb/c小鼠[8]，ICR小鼠[9]、Laca小鼠[10]，其中SD大鼠和C57BL/6J小鼠在PSD模型造模中最為普遍，其中Wistar大鼠對應(yīng)激敏感[11]，SD大鼠具有遺傳抑郁[12]。雌激素對腦血管具有保護(hù)作用[13]，故較少使用雌性動物而多采用雄性動物。

2 腦卒中中醫(yī)病證結(jié)合模型

2.1 氣虛血瘀證

氣虛血瘀為缺血性腦卒中的基本病機(jī)，“氣為血之帥，血為氣之母”，氣虛則無力推動血液運(yùn)行，導(dǎo)致血瘀出現(xiàn)，氣虛日久，必然導(dǎo)致血瘀出現(xiàn)，王鍵[14]等根據(jù)中醫(yī)“人過四十，陰氣自半”“饑則損氣”“胃不和則臥不安”“勞則耗氣”“濕傷脾，寒傷腎”“憂思傷脾，驚恐傷腎”“肥甘厚味易致高粱之疾”理論，采用“游泳+饑餓+寒濕+中年+高脂飲食”模擬氣虛血瘀模型后行動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，3h后松開恢復(fù)血流。劉超明[15]等根據(jù)“勞則氣耗”中醫(yī)理論，采用持續(xù)力竭性游泳法，氣耗日久必氣虛，氣虛則行血之力不足，血行漸緩久之成瘀，再合并大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血再灌注(MCAO-R)模型制成腦卒中氣虛血瘀型證大鼠模型。譚輝[16]等根據(jù)“氣為血之帥”理論，結(jié)合低氧環(huán)境模擬不能吸入足夠“自然界清氣”，宗氣不能生成，采用饑餓、疲勞、低氧、肥甘厚味因素模擬氣虛血瘀證合并線栓法制作MCAO-R氣虛血瘀大鼠模型。王健[17]等運(yùn)用大黃瀉下法合并MCAO建立氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型。模型評價指標(biāo)[18]以大鼠腦缺血表現(xiàn)及體征為精神萎靡，雙眼淺紅、微睜、無神，自主活動少，外界刺激反應(yīng)遲鈍，舌質(zhì)呈暗紫色、毛發(fā)粗糙易掉等癥狀即造模成功。

2.2 腎虛證

腎為先天之本，腎藏精，上通于腦，腦為髓海，“人始生成精，精成而腦髓生”，國內(nèi)學(xué)者依據(jù)以上理論，建構(gòu)腎虛型腦缺血大鼠模型。張雨薇等[19]根據(jù)缺血性腦血管病的發(fā)生與“腎精虧虛”密切相關(guān)，制備pMCAO大鼠模型后每日肌注氫化可的松注射液15 mg/kg制備腎陽虛腦缺血大鼠模型，造模評價指標(biāo)以其除腦缺血癥狀外，出現(xiàn)活動減少、畏寒喜暖、弓背蜷縮、食欲降低、遲鈍、四肢消瘦、脫毛、多尿及體質(zhì)量降低等即為造模成功。劉宏等[20]根據(jù)“腎通于腦”及“恐傷腎”理論，在MCAO手術(shù)前，用“貓嚇鼠”法，以活鼠喂貓示眾，增加恐嚇氛圍，建立腎虛模型或采用雙側(cè)性腺摘除法制備腎虛模型，評價以方測證判斷其為腎虛模型造模成功。

2.3 痰瘀互結(jié)證

脾為生痰之源，脾失健運(yùn)，聚濕成痰，痰濁內(nèi)生，痰瘀互結(jié)，壅滯經(jīng)脈，上蒙清竅，發(fā)為中風(fēng)。張令霖等[21]采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合大腦中動脈栓塞法制作痰瘀互結(jié)腦缺血再灌注大鼠模型，通過高脂、高糖、高蛋白飼料喂養(yǎng)，形成動脈粥樣硬化病理特點模擬“痰”證，MCAO法模擬“瘀”證，評價以出現(xiàn)肢體偏癱，眼瞼下垂，舌苔厚膩，舌質(zhì)紫暗等表現(xiàn)及血脂升高表明造模成功。劉抒雯等[22]采用脂肪乳劑灌胃合并線栓法制作痰瘀互結(jié)證腦缺血大鼠模型，以大鼠一般情況及血液流變學(xué)、血脂指標(biāo)進(jìn)行驗證其造模成功。

2.4 火熱證

火熱證是《中風(fēng)病辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)》依據(jù)中風(fēng)病臨床癥狀量化診斷研究分出的風(fēng)證、火熱證、痰濕證、血瘀證、氣虛證及陰虛陽亢證六大證候之一，火毒證動物模型符合臨床火熱證型，采用腹腔注射角叉菜膠復(fù)合MCAO建立急性腦梗死火毒證大鼠模型[23-24]，以爪甲腫脹紅紫、尾部血栓明顯，出現(xiàn)黑尾現(xiàn)象、耳廓邊緣發(fā)紅、舌底脈絡(luò)青紫粗長以及細(xì)絡(luò)瘀血、肛溫增高、體重?zé)o明顯下降為火毒證模型納入實驗。瘀血阻絡(luò)為腦缺血的根本病因，瘀熱證亦屬火熱證，蔣寶平等[25]采用間隔24 h，分2次給予LPS，每次50 μg/kg，第二次給予LPS后2 h，再合并MCAO復(fù)制瘀熱證，采用炎癥因子及血液流變學(xué)的變化以驗證模型。

3 抑郁中醫(yī)病證結(jié)合模型

包祖曉[26]等采用注射利血平和氫化可的松建立肝腎陽虛型抑郁癥病證結(jié)合模型，依據(jù)利血平為制作陽氣虧虛證常用模型，糖皮質(zhì)激素模型為制作腎陽虛證經(jīng)典動物模型，且均可出現(xiàn)類似抑郁癥病理變化制作肝腎陽虛型抑郁癥模型。采用一般四診指標(biāo)及四診計量化檢測與計量辨證方法檢測大鼠陽熱、氣虛、陰虛、血虛程度評價驗證模型。

4 PSD造模方法及評價

PSD基本病因為“瘀”“郁”，其中醫(yī)病證結(jié)合模型文獻(xiàn)報道較少，可采用腦缺血中醫(yī)病證模型合并抑郁模型制作而成，PSD造模多在腦缺血模型的基礎(chǔ)上采用以下方法。

4.1 PSD造模方法

4.1.1 慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(CUMS)合并孤養(yǎng)法

CUMS合并孤養(yǎng)法是目前國內(nèi)外常用的PSD造模方法，CUMS模式作為經(jīng)典的抑郁模型制備方法，可模仿臨床病人在日常生活中遇到的物理生理刺激，導(dǎo)致其快感缺失以及對各種外界刺激反應(yīng)降低等核心癥狀，其具有高度有效性、穩(wěn)定性，基本符合抑郁模型要求，但造模過程較為復(fù)雜，工作量較大。主要采取禁食24 h，禁飲18～24 h，晝夜顛倒、冰水游泳(4 ℃，5～6 min)，夾尾(1～2 min)，籠傾斜(40°～45°，15～24 h)等[27]。孤養(yǎng)法采用單籠飼養(yǎng)，其模擬抑郁性障礙的孤獨，社會隔離，社會交往減少及異常。

4.1.2 束縛應(yīng)激法

在腦卒中術(shù)后1周，將動物置于體積限制、通風(fēng)良好的圓柱體塑料管內(nèi)，或?qū)⒋笫笙拗圃谑`架上，2 h 1次/d，持續(xù)1～2周，予以每日2 h的行為限制，其通過嚴(yán)格限制動物活動而誘發(fā)類似人類抑郁障礙的核心癥狀,屬于不可逃避性或強(qiáng)制性心理應(yīng)激模型[28]。

4.1.3 懸尾和強(qiáng)迫游泳實驗

卒中造模后每天進(jìn)行強(qiáng)迫游泳和懸尾應(yīng)激，強(qiáng)迫游泳實驗[29]：將動物放入一定水深的桶內(nèi)，水溫(25±2)℃。實驗前預(yù)測6 min,選取靜止不動時間70～160 s的動物實驗用。游泳時間為6 min,累計后4 min內(nèi)的不動時間。不動時間是指小鼠在水中停止掙扎,或呈漂浮狀態(tài),僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動以保持頭部浮在水面的持續(xù)時間；懸尾實驗[29]：將動物尾部距末端用夾子固定,倒懸于的箱內(nèi)，懸掛時間為6 min,累計后4 min內(nèi)的不動時間。其屬于絕望模型，可誘導(dǎo)抑郁，亦可作為抑郁評價指標(biāo)，造模方法簡單，易于觀察。

4.1.4 利血平法

卒中后合并孤養(yǎng)加利血平法法制備PSD模型，采用腹腔注射利血平0.2 mg/kg，每日1次，共14 d[30]。利血平可引起抑郁樣癥狀，其造模時間短，機(jī)理明確，可使腦中生物胺(去甲腎上腺素、5-HT、多巴胺) 耗竭，誘導(dǎo)大鼠及小鼠體溫降低、眼瞼下垂、腹瀉、運(yùn)動能力下降等現(xiàn)象，抑郁藥理學(xué)模型的首選，可用于藥物篩選[31]。

4.2 PSD模型評價

4.2.1 神經(jīng)功能評價

卒中后神經(jīng)功能主要采用Longa 5分法[32]、Bederson5分法[33]等進(jìn)行神經(jīng)功能評價。Longa5分法：0分：沒有神經(jīng)功能損傷癥狀；1分：左側(cè)肢體不能完全伸直；2分：行走不穩(wěn)，向左側(cè)打轉(zhuǎn)；3分：站立不穩(wěn)，行走時向左側(cè)傾斜；4分：意識昏迷。Bederson5分法：0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

4.2.2 行為學(xué)評價

抑郁主要采用行為學(xué)檢查，糖水偏好實驗[34]檢測其快感缺失情況，可作為抑郁評價的金標(biāo)準(zhǔn)。曠場實驗、明暗穿梭實驗及Morris水迷宮測定[35]驗檢模型動物的活動情況，可檢測其焦慮樣行為；強(qiáng)迫游泳實驗及懸尾實驗檢測[29]動物絕望行為。具體方法如下：

①糖水偏好實驗：每籠兩瓶水，1瓶糖水，1瓶純水，記錄各自重量,24 h后再稱量剩余水重量。計算糖水偏好指數(shù)：糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

②曠場實驗：將鼠置于場箱底面的中心，用實時視頻圖像跟蹤分析系統(tǒng)記錄鼠在3～5 min內(nèi)的活動情況。測試安排在暗室中，每次測定結(jié)束將排泄物清除干凈，每只僅測定1次。分析指標(biāo)包括：移動距離、平均速度(不包含休息時間)。

③明暗穿梭實驗：把鼠放進(jìn)穿梭箱內(nèi)的任何一個空間，先進(jìn)行主動回避反應(yīng)訓(xùn)練，20 s后開始出現(xiàn)燈光或和蜂鳴音，該刺激持續(xù)15 s，其中后10 s內(nèi)再加上電刺激。最初動物只對電刺激出現(xiàn)反應(yīng)，即逃至箱子對側(cè)空間躲避電擊。20 s后再次出現(xiàn)燈光或蜂鳴音，并同時在其所在側(cè)施加電刺激，迫使其跳至另一側(cè)，反復(fù)進(jìn)行穿梭訓(xùn)練，出現(xiàn)主動回避反應(yīng)。記錄動物反應(yīng)次數(shù)及受到刺激后穿梭到另一空間的時間。

④Morris水迷宮測定：適應(yīng)性訓(xùn)練后，將鼠置于逃生平臺，隨后將其放入離平臺最遠(yuǎn)象限，開始計時，直至鼠登上逃生平臺后5 s停止計時，允許游泳時間為60 s。如此將鼠依次放入其余3個象限,分析指標(biāo)包括：逃避潛伏期、軌跡(路徑)、總路程、總時間、平均速度、搜索策略、各象限游泳路程等。

⑤強(qiáng)迫游泳實驗及懸尾實驗同4.1.3實驗操作。

5 討論

辨證論治是中醫(yī)藥臨床治療疾病的優(yōu)勢所在，而符合中醫(yī)病證結(jié)合的動物模型是中醫(yī)藥進(jìn)行基礎(chǔ)研究的根本，其要求動物在復(fù)制疾病的模型時，必須考慮到相應(yīng)的中醫(yī)證型。

綜上所述，目前PSD的造模以腦缺血模型復(fù)合抑郁模型而成，其中腦缺血病證結(jié)合模型以氣虛血瘀證、腎虛證、痰瘀互結(jié)證、火熱證最為常見，然而抑郁癥病證結(jié)合模型研究較少。根據(jù)現(xiàn)有抑郁造模方法分析CUMS合并孤養(yǎng)法、束縛應(yīng)激法、懸尾和強(qiáng)迫游泳實驗均屬于情志不良所致肝失疏泄之肝氣郁結(jié)證，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)利血平法屬于陽氣虧虛證候類造模法，而中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教材將郁證的辨證分為肝氣郁結(jié)、氣郁化火、血行郁滯、痰氣郁結(jié)、心神惑亂、心脾兩虛、心陰虧虛及肝陰虧虛，除肝氣郁結(jié)證外，其余證型的抑郁中醫(yī)病證結(jié)合模型研究少見。但是，采用腦卒中病證結(jié)合模型復(fù)合抑郁模型建立PSD病證結(jié)合模型后仍難以保證其證型一致，也很有可能會發(fā)生改變。故應(yīng)在PSD疾病模型已建立的基礎(chǔ)上復(fù)合中醫(yī)證型造模，是獲得PSD中醫(yī)病證結(jié)合動物模型的有效途徑，其具體研究方法還有待進(jìn)一步探討與驗證。因此，建立穩(wěn)定、可重復(fù)、操作簡單的PSD中醫(yī)病證結(jié)合動物模型是進(jìn)行中醫(yī)藥防治PSD基礎(chǔ)研究的當(dāng)務(wù)之急，仍是廣大中醫(yī)藥專家和學(xué)者研究的重中之重。