基因融合介導(dǎo)EGFR-TKI獲得性耐藥

邵宜 鐘殿勝

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌的80%[1]。具有表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）敏感突變的患者對酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）具有良好反應(yīng)，一代TKIs的總反應(yīng)率為55%-80%，無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）為9個月-14個月[2,3]。一代TKIs最常見的耐藥機(jī)制是EGFRT790M突變，三代TKI藥物奧希替尼對此類突變具有良好療效[4]。隨著耐藥后再活檢的廣泛應(yīng)用，人們對于耐藥機(jī)制的理解逐漸深入，EGFR-TKIs耐藥機(jī)制除了EGFR突變（一代藥物的T790M突變，三代藥物的C797S突變），肝細(xì)胞生長因子受體MET擴(kuò)增，組織學(xué)轉(zhuǎn)化等外[5,6]，近來發(fā)現(xiàn)基因融合的出現(xiàn)也是一種少見但確切的耐藥機(jī)制。本文將EGFR-TKIs耐藥后各種基因融合現(xiàn)象綜述如下。

1 耐藥融合的發(fā)現(xiàn)和發(fā)生率

2015年，Klempner等[7]報道2例具有EGFRdel19突變的肺癌患者，分別使用厄洛替尼9個月和10個月后耐藥，對于耐藥前后的組織標(biāo)本進(jìn)行全面基因組測序（comprehensive genomic profiling, CGP），發(fā)現(xiàn)耐藥后標(biāo)本同時存在EGFRdel19突變和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白6（coiled coil domain containing 6, CCDC6）-轉(zhuǎn)染重排（rearranged during transfection,RET）原癌基因融合，而沒有EGFRT790M突變、MET擴(kuò)增等其他耐藥機(jī)制。使用EGFR-TKI之前的標(biāo)本沒有RET融合。這是最早關(guān)于基因融合可能介導(dǎo)EGFR-TKI耐藥的報道。

Piotrowska等[8]使用錨定多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）方法回顧性分析起初具有EGFR突變、使用厄洛替尼，吉非替尼或阿法替尼耐藥患者的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)1例阿法替尼耐藥患者具有CCDC6-RET融合，1例化療/奧希替尼進(jìn)展后鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF）融合，還有1例阿法替尼/西妥昔單抗進(jìn)展后二代測序（next generation sequencing, NGS）檢測到核受體共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4,NCOA4）-RET融合。

對32例使用三代EGFR-TKI奧希替尼耐藥后患者的35份組織標(biāo)本、26份循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）進(jìn)行檢測，1例患者血漿中發(fā)現(xiàn)CCDC6-RET和原肌球蛋白3（tropomyosin 3, TPM3）-神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸受體激酶1（neurotrophic receptor tyrosine kinase 1 gene,NTRK1）融合。錨定多重PCR方法對24例具有足夠組織標(biāo)本的患者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)1例CCDC6-RET融合，1例PCBP2-BRAF融合，1例甘油酯激酶（acylglycerol kinase,AGK）-BRAF融合。值得注意的是，這3例同時都伴有T790M突變的丟失，這可能表明了新出現(xiàn)的融合代表了旁路機(jī)制的活化[8]。

分析3,505例具有EGFR突變或接受過EGFRTKIs治療的NSCLC患者腫瘤或血液標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)31例（0.88%）同時具有融合：包括10例（32%）BRAF，7例（23%）間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK），6例（19%）RET，6例（19%）成纖維細(xì)胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor 1,FGFR3），1例（3.2%）EGFR，1例（3.2%）NTRK1。其中12例患者具有治療前后配對標(biāo)本，在TKI治療前不存在融合。3例使用奧希替尼耐藥者，融合出現(xiàn)的同時伴有T790M丟失，且具有獲得性融合的腫瘤，腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden, TMB）水平較低（中位，3.5突變/Mb）[9]。

3,014例具有EGFR突變的NSCLC患者進(jìn)行組織或ctDNA基因組測序，發(fā)現(xiàn)28例（0.9%）同時具有活化融合（BRAF12例，F(xiàn)GFR35例，RET5例，ALK4例，NTRK11例，EGFR1例），其中25例沒有合并其他耐藥機(jī)制，而21例可追溯病史的患者都使用過EGFRTKI治療。10例具有治療前后配對標(biāo)本發(fā)現(xiàn)TKI治療前不存在融合，因而確定為獲得性融合[FGFR3-轉(zhuǎn)化酸性含卷曲螺旋蛋白3（transforming, acidic coiled-coil containing protein 3, TACC3）4例，棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4（echinoderm microtubule-associated protein-4,EML4）-ALK 2例，CCDC6-RET 2例，AGK-BRAF 1例，TPM3-NTRK1 1例]，其中3例（2例FGFR3和1例BRAF）配對的融合伴有T790M丟失[10]。

綜上，EGFR-TKI耐藥后可出現(xiàn)RET、BRAF、ALK等多種基因融合。基因融合在EGFR-TKI獲得性耐藥機(jī)制中發(fā)生率不足1%，屬于介導(dǎo)獲得性耐藥的少見事件。現(xiàn)將各種基因融合分述如下。

2 RET融合

2.1 原發(fā)性RET融合RET基因是一種位于10號染色體長臂上的原癌基因（10q11.2），其編碼的RET蛋白是一種酪氨酸激酶受體，結(jié)合配體后刺激胞內(nèi)區(qū)域發(fā)生磷酸化，激活下游信號，進(jìn)一步參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化[11]。RET基因自身斷裂后與其他基因接合發(fā)生重組，成為一個新的融合基因，使RET酪氨酸激酶的活化脫離配體的調(diào)控，發(fā)生自我磷酸化，從而促使原癌基因的轉(zhuǎn)化，引發(fā)腫瘤生成[12]。2011年，1例肺腺癌中發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白家族成員5B（kinesin family member 5B,KIF5B）-RET融合，由KIF5B基因的第16號外顯子末端與RET的12外顯子起始端融合而成，被認(rèn)為是部分肺癌的驅(qū)動基因[13]。

RET融合在肺癌患者中陽性率為1%-2%[12]，并常與EGFR、KRAS、ALK、BRAF等其他基因改變相排斥[13,14]。Takeuchi等[15]對1,114例肺腺癌患者進(jìn)行檢測，共發(fā)現(xiàn)14例（1.2%）患者具有RET融合，這些患者女性多見，不吸煙或輕吸煙，且EGFR和KRAS陰性。與RET基因發(fā)生融合突變的基因包括KIF5B[13]、CCDC6[16]、三基序蛋白33（tripartite motif containing 33, TRIM33）[17]、NCOA4[18]，其中在NSCLC中KIF5BRET型最常見[18]。

2.2 EGFR-TKI獲得性耐藥后RET融合 對EGFR-TKIs發(fā)生獲得性耐藥后，RET融合的發(fā)生率為0.2%-4.2%[8-10]。但是基因融合出現(xiàn)的確切機(jī)制還不清楚。由于未見治療前EGFR突變和RET融合共存的報道，因此有可能在長期EGFR抑制的誘導(dǎo)下肺癌細(xì)胞出現(xiàn)了旁路機(jī)制的活化，但是也不能完全除外治療前即存在RET融合的小克隆，在EGFR抑制后此部分克隆逐漸變成優(yōu)勢的可能。

Rich等[19]分析176例使用EGFR-TKIs后出現(xiàn)RET改變患者中，發(fā)現(xiàn)del19比L858R突變患者的RET融合發(fā)生率高（0.8%vs0.2%,P=0.04），在伴有T790M和/或C797S的患者中比沒有這兩個突變的患者發(fā)生率更高（1.1%vs4.6%vs0.6%）。RET融合在奧希替尼耐藥后發(fā)生率（9/184, 4.9%）高于一二代TKI（13/1627, 0.8%,P=0.000,1）。Offin等[20]同樣發(fā)現(xiàn)三代TKI后出現(xiàn)RET融合的頻率更高。174例厄洛替尼或阿法替尼后未檢測到融合，而14例奧希替尼后檢出3例。但還不清楚是奧希替尼富集獲得性融合的潛力更強(qiáng)，還是多線EGFR抑制后反復(fù)篩選的結(jié)果。

Piotrowska等[8]檢測41例奧希替尼耐藥患者，發(fā)現(xiàn)2例獲得性CCDC6-RET融合。在PC9和MGH134細(xì)胞（含有EGFRL858R/T790M突變）中表達(dá)CCDC6-RET后，細(xì)胞對阿法替尼和奧希替尼等EGFR-TKIs耐藥，選擇性RET抑制劑BLU-667和卡博替尼則可使之敏感性恢復(fù)。2例EGFR突變陽性患者使用阿法替尼和奧希替尼后耐藥，分別獲得CCDC6-RET和NCOA4-RET融合，接受奧希替尼+BLU-667治療，耐受性良好且迅速反應(yīng)。研究在細(xì)胞和臨床層面證實(shí)RET融合介導(dǎo)EGFR抑制劑耐藥，且這個旁路可被選擇性RET抑制劑有效抑制。另有研究[20]在PC9細(xì)胞中表達(dá)CCDC6-RET和KIF5B-RET融合，RET融合可以導(dǎo)致具有EGFR突變細(xì)胞系奧希替尼耐藥，奧希替尼降低母代細(xì)胞的EGFR和ERK1/2，而不降低子代細(xì)胞的ERK1/2磷酸化。聯(lián)合卡博替尼后對奧希替尼反應(yīng)恢復(fù)。RET融合不改變奧希替尼抑制EGFR磷酸化，證實(shí)確實(shí)是旁路機(jī)制導(dǎo)致耐藥。

3,505例EGFR突變患者組織活檢，發(fā)現(xiàn)6例RET融合，包括1例阿法替尼耐藥后出現(xiàn)L858R和NCOA4-RET融合患者，使用卡博替尼+阿法替尼穩(wěn)定7個月，與前文所述細(xì)胞實(shí)驗結(jié)果一致[9]。綜上，對于EGFR-TKI耐藥后出現(xiàn)RET融合的患者，繼續(xù)EGFR-TKI聯(lián)合RET抑制劑可能是一種合理的治療選擇。

3 BRAF融合

3.1 原發(fā)性BRAF融合BRAF基因是1988年由Ikawa等[21]首先在人類尤文氏肉瘤中發(fā)現(xiàn)的，該基因位于染色體7q34，編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在惡性腫瘤形成、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。BRAF蛋白在絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases, ERK）信號通路中起著關(guān)鍵作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過程[22]。2005年，首先在甲狀腺癌中報道A型激酶錨定蛋白9（A-kinase anchoring protein9,AKAP9）-BRAF融合為一種激活MAPK信號通路的新機(jī)制[23]。而NSCLC中BRAF融合的發(fā)生率為4.3%[24]。2017年美國臨床腫瘤學(xué)會上，有報道通過NGS在17,128例NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)42例（0.25%）BRAF融合現(xiàn)象，其中32例（76.19%）為腺癌，融合伴侶以AGK最為常見，占7.14%，其他還包括TRIM24、細(xì)胞質(zhì)分裂付出蛋白4（dedicator of cytokinesis 4, DOCK4）和犰狳重復(fù)含蛋白10（armadillo repeat containing 10, ARMC10）等[25]。

未經(jīng)治療的肺癌患者同時存在BRAF融合和EGFR突變的報道不多，僅在AURA研究中報道1例使用奧希替尼前NGS發(fā)現(xiàn)BRAF融合[26]。

3.2 EGFR-TKI獲得性耐藥后BRAF融合 Yu等[27]檢測136例經(jīng)過TKI治療的具有EGFR突變患者，發(fā)現(xiàn)2例BRAF融合。對比治療前后標(biāo)本，BRAF改變分別為1%和5.1%。但研究也只能證實(shí)TKI富集了BRAF改變，不能證實(shí)融合為獲得性。

Vojnic等[28]檢測374例轉(zhuǎn)移性EGFR突變肺癌患者，其中174例為TKI治療后，其中38例有配對TKI前樣本。研究共發(fā)現(xiàn)4例患者（2例厄洛替尼后，2例厄洛替尼序貫奧希替尼后）具有BRAF融合［3例AGK-BRAF，1例泛素蛋白連接酶Praja-1（praja ring finger ubiquitin ligase 2 gene, PJA2）-BRAF］。4例患者中2例有TKI前標(biāo)本，都是BRAF融合陰性。而在200例TKI前的標(biāo)本中沒有檢出同時性BRAF融合。

基因編輯將BRAF融合基因?qū)隕GFR突變細(xì)胞系（H1975, HCC827, PC9）以及19del+PJA2-BRAF的原代細(xì)胞MSK-LX138cl后，細(xì)胞對奧希替尼耐藥，BRAF、絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase, MEK）1/2、ERK1/2和信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）的磷酸化增加，奧希替尼可以阻斷母代細(xì)胞而不阻斷子代細(xì)胞MEK1/2、ERK1/2和STAT3的磷酸化，BRAF敲除后奧希替尼敏感性恢復(fù)。MEK抑制劑曲美替尼和奧希替尼可以協(xié)同抑制細(xì)胞生長，泛RAF抑制劑單藥也可抑制具有突變EGFR和BRAF融合細(xì)胞系的生長，因而從細(xì)胞水平證實(shí)了BRAF融合是EGFR-TKI獲得性耐藥的機(jī)制，聯(lián)合EGFR和MEK抑制或BRAF抑制可能可以克服耐藥[28]。因此，對于此類患者，聯(lián)合抑制MEK和EGFR以及抑制BRAF融合可能是合適的治療方案。

4 ALK融合

4.1 原發(fā)性ALK融合ALK基因位于2p23.2，編碼屬于胰島素受體超家族的I型跨膜酪氨酸激酶蛋白。2007年，1例27歲肺癌患者中發(fā)現(xiàn)ALK-EML4基因重排，患者2號染色體短臂中存在倒位，使EML4基因和ALK基因的外顯子連接，從而形成融合基因ALK-EML4[29]。重排后融合基因編碼的嵌合蛋白含有ALK的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域的異常表達(dá)使得ALK下游信號通路異?；罨哂兄掳┬?。ALK基因重排在NSCLC的總體發(fā)生率約為4%[30]。肺癌患者中還存在其他融合伴侶，但以EML4-ALK最為常見[31]。具有ALK融合的肺癌患者，使用克唑替尼、阿來替尼等ALK-TKI治療有效[32]。

Yang等[33]對977例中國NSCLC患者進(jìn)行基因檢測，發(fā)現(xiàn)13例（1.3%）同時存在EGFR突變和ALK融合。Lee等[34]對444例韓國肺腺癌患者進(jìn)行檢測，4例（0.9%）患者同時存在EGFR突變和ALK融合。Dana-Farber癌癥研究院檢測了50例NSCLC患者，發(fā)現(xiàn)3例（6%）同時具有EGFR突變和ALK融合[35]。因此，存在原發(fā)性EGFR突變與ALK融合并存的現(xiàn)象，但非常少見。發(fā)生雙重基因改變的患者多使用一代EGFR-TKI或ALK-TKI單藥治療，各個病例報道反應(yīng)不一，有效率約為60%[36]。

4.2 EGFR-TKI獲得性耐藥后ALK融合 2016年，Liang[37]報道1例EGFRdel19突變NSCLC患者，檢測EML4-ALK陰性。先后使用厄洛替尼HY-15772兩種EGFR-TKI治療8個月后疾病進(jìn)展。行ctDNA檢測，血漿發(fā)現(xiàn)EGFR突變和EML4-ALK重排并存，對ALK抑制劑治療有反應(yīng)。

對3,505例使用EGFR-TKI治療的患者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)7例（0.20%）ALK融合[9]。新發(fā)ALK的融合伴侶包括EML4（n=4）、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（striatin,STRN）（n=1）、TRK融合基因（TRK-fused gene,TFG）（n=1）、和含普列克底物同源物域家族A成員7（pleckstrin homology domain containing A7, PLEKHA7）（n=1）。出現(xiàn)STRN-ALK融合的患者同時伴有T790M丟失，對單藥克唑替尼無反應(yīng)。而奧希替尼耐藥后出現(xiàn)新的PLEKHA7-ALK融合患者對奧希替尼聯(lián)合阿來替尼的治療有反應(yīng)。因此，對于EGFR-TKI耐藥后出現(xiàn)ALK融合的患者，繼續(xù)EGFR-TKI聯(lián)合ALK-TKI可能是一種較好的治療選擇。

5 FGFR3融合

FGFR3-TACC3融合是膀胱癌等多種腫瘤的常見驅(qū)動基因[38]，肺腺癌、肺鱗癌和未分類NSCLC中也都報道過。576例肺腺癌患者行NGS檢測，發(fā)現(xiàn)FGFR3-TACC3融合的總發(fā)生率為0.5%。FGFR3-TACC3融合導(dǎo)致Ba/F3細(xì)胞白介素-3非依賴性生長，細(xì)胞對泛FGFR和選擇性FGFR抑制劑敏感，但是對EGFR抑制劑吉非替尼耐藥[39]。

FGFR3-TACC3可能介導(dǎo)EGFR-TKI的耐藥。一項研究比較136例EGFR-TKI治療患者耐藥前后的標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)FGFR3改變在治療后更為常見（0.5%vs3.7%,P=0.042）[27]。對17,319例肺癌組織（141,701例腺癌，3,149例非特指型）行CGP分析，發(fā)現(xiàn)5例EGFR-TKI耐藥后存在FGFR3-TACC3融合并伴有原活化EGFR突變，包括1例使用厄洛替尼后，1例使用阿法替尼后，1例使用奧希替尼后和1例使用三代藥物ASP8273后[40]。

細(xì)胞和動物實(shí)驗證實(shí)，F(xiàn)GFR3-TACC3融合可以在頭頸部鱗癌移植物模型中活化ERK信號通路，逃避EGFR/紅白血病病毒癌基因同源物3（erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog 2, ERBB3）阻滯。聯(lián)合使用阻滯EGFR和ERBB3的抗體時，EGFR阻滯優(yōu)先抑制ERK活化，而ERBB3阻滯抑制蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/AKT）活化。此外，肺癌細(xì)胞系NCI-H1975中（EGFRL858R+T790M突變），引入FGFR3-TACC3可導(dǎo)致奧希替尼耐藥，而不導(dǎo)致磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3'-kinase,PI3K）突變細(xì)胞系的PI3K抑制劑耐藥[41]。但是現(xiàn)在還沒有獲批的抑制FGFR3融合的藥物，因此出現(xiàn)FGFR3-TACC3融合后的最佳治療仍在探索中。

6 NTRK1融合

之前研究報道結(jié)直腸癌和甲狀腺癌中出現(xiàn)NTRK1和肌凝蛋白磷酸酶Rho相互作用蛋白（myosin phosphatase Rho-interacting protein, MPRIP）、CD74、TPM3或TFG的融合[42]。融合導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性TRKA激酶活性增加，可作為癌基因介導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生。在3種常用于評估致癌性的非癌癥細(xì)胞系293T細(xì)胞、NIH3T3纖維母細(xì)胞和Ba/F3細(xì)胞中表達(dá)MPRIP-NTRK1和CD74-NTRK1的cDNA，發(fā)現(xiàn)表達(dá)嵌合蛋白和TRKA自身磷酸化，腫瘤發(fā)生錨定非依賴性生長，并導(dǎo)致裸鼠成瘤。而在非腫瘤細(xì)胞或?qū)φ諛颖局胁淮嬖诖朔N融合。3/91例（3.3%）沒有已知癌基因改變的肺癌患者使用NGS或熒光原位雜交檢測存在NTRK1基因融合[43]。一些靶向藥物，如拉羅替尼、恩曲替尼和Loxo-195等已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)或試驗證實(shí)對NTRK1融合有效。

3,505例具有EGFR突變的NSCLC患者，發(fā)現(xiàn)1例（0.03%）同時具有NTRK1融合，但不確定融合是使用TKI之前還是耐藥后出現(xiàn)[9]。EGFR-TKI耐藥后也可出現(xiàn)NTRK融合。32例TKI耐藥患者，1例血檢發(fā)現(xiàn)同時具有CCDC6-RET和TPM3-NTRK1融合[8]。由于報道例數(shù)較少，NTRK1介導(dǎo)EGFR的具體機(jī)制還未證實(shí)，TKI耐藥后發(fā)生NTRK1融合的最佳治療也未可知。

7 結(jié)論

之前未發(fā)現(xiàn)融合是介導(dǎo)EGFR-TKI耐藥的機(jī)制，可能是由于當(dāng)時使用的基因檢測平臺未包括融合的檢測，而易位斷裂點(diǎn)經(jīng)常發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域，聚焦的NGS只檢測外顯子，因而可能錯過這些異常。因此，推薦EGFR-TKI耐藥后再活檢和使用能夠發(fā)現(xiàn)激酶融合的基因組測序平臺。

一代TKI和三代TKI獲得性耐藥后基因融合的檢出率似有不同，三代藥物耐藥后融合的發(fā)生率高于一代藥物（二者分別是3.1%-12.5%和不足1%）[8,9,19,20]，但是不能確定是由于三代藥物對于基因融合的誘導(dǎo)能力更強(qiáng)，還是EGFR-TKIs序貫使用反復(fù)篩選的結(jié)果。大部分時候，T790M突變丟失和替代途徑耐藥機(jī)制相關(guān)，因此三代TKI耐藥后出現(xiàn)T790M丟失的患者應(yīng)格外注意融合的檢測。另外發(fā)生獲得性融合后TMB水平較低，因此免疫治療不一定具有良好效果，而無論對于一代還是三代藥物來說，聯(lián)合使用EGFR-TKI和融合抑制劑可能是合理的治療選擇，但是應(yīng)注意聯(lián)合用藥的毒性。

總之，獲得性激酶融合是EGFR-TKIs罕見但是肯定的獲得性耐藥機(jī)制。在EGFR抑制過程中，需要在進(jìn)展時使用能夠檢測包括融合在內(nèi)的各種基因變化，以明確耐藥機(jī)制，提供治療決策。