預(yù)處理策略促進間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)急性腎損傷的機制研究進展

李雯婕，鄧旖婷，謝天蔚，姜大朋

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是指48 h內(nèi)腎功能急劇下降，血清肌酐(serum creatinine,Scr)上升，大于26.5 μmol/L或增加≥50%(達到基線值的1.5 倍)，尿量<0.5 mL/(kg·h)持續(xù)超過6 h[1]。一旦發(fā)生AKI，患者在重癥監(jiān)護室停留的時間和住院時間明顯延長，病死率顯著增加。AKI病因眾多，病理生理學(xué)機制十分復(fù)雜。目前，AKI的治療方案仍局限于透析和腎移植，高昂的費用和供體器官的短缺限制了這2種治療方案的臨床應(yīng)用。而近幾十年干細(xì)胞治療領(lǐng)域的突破性進展為數(shù)百萬AKI患者帶來希望。研究表明，干細(xì)胞可以通過多種機制促進腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其免疫原性低、多能分化能力高、隔離侵入并且分布廣泛，在AKI治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。

雖然MSCs在動物模型中作用顯著，但其與臨床應(yīng)用之間依然存在著巨大差距。2017年，Swaminathan等[3]選取心臟手術(shù)后發(fā)生AKI的患者，使用MSCs療法進行了隨機、雙盲、多中心的2期臨床試驗(NCT01602328)。對隨機選取的156名受試者進行研究后，發(fā)現(xiàn)兩組患者的腎功能恢復(fù)所需要的時間、需要透析的比率和30 d死亡率均相近。為什么MSCs無法體現(xiàn)其優(yōu)越性？Silva等[4]認(rèn)為，MSCs臨床作用局限性可能與植入量不足、存活率低、旁分泌能力受損有關(guān)。為解決這一問題，近年來研究者們探索出一系列提高MSCs作用的方法。作者就提高AKI中MSCs作用的方法進行總結(jié)，并分析影響MSCs療效的各種因素。

1 提高MSCs存活率的措施

MSCs的低存活率使MSCs的治療受到了很大影響，原因有移植后失巢凋亡、缺血、炎癥、活性氧與抗氧化劑之間的失衡等[5,6]。以下預(yù)處理措施能夠保護MSCs免受有害環(huán)境的干擾,提高MSCs的存活率。

1.1 與細(xì)胞因子或化合物一起培養(yǎng) 實驗證明，多種細(xì)胞因子或化合物有細(xì)胞保護作用，通過一系列細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提高細(xì)胞存活率來改善MSCs在AKI中的治療效果。

1.1.1 細(xì)胞因子 研究表明，用胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)預(yù)處理MSCs能促進其增殖，減少凋亡。Xinaris等[7]用IGF-1預(yù)處理MSCs發(fā)現(xiàn)，在AKI模型中，腎內(nèi)移植IGF-1預(yù)處理MSCs的數(shù)量在第1天顯著增多，至第4天仍然維持較高水平，其部分原因是預(yù)處理MSCs對H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷具有更強的抵抗力。

1.1.2 使用藥物聯(lián)合培養(yǎng)MSCs Cai等[8]發(fā)現(xiàn)，用阿托伐他汀預(yù)處理MSCs，通過抑制Toll樣受體4信號的表達，植入MSCs的存活率顯著提高。Mias等[5]向缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)誘導(dǎo)的AKI大鼠的腎實質(zhì)內(nèi)注射用褪黑素預(yù)處理的MSCs，其存活率顯著提升，并通過誘導(dǎo)血管生成和腎細(xì)胞增殖，加快了腎功能的恢復(fù)。

1.2 改善微環(huán)境 體外擴增期間，一系列細(xì)胞表面分子的缺失使細(xì)胞間粘附能力下降[9]。Xu等[10]發(fā)現(xiàn)三維球體培養(yǎng)的MSCs能產(chǎn)生更多細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular material,ECM)，將其輸入I/R誘導(dǎo)的AKI大鼠模型后，MSCs的存活率以及MSCs治療AKI的效果均提高。

1.3 熱敏水凝膠 移植后，失去與ECM錨定連接的MSCs在惡劣的細(xì)胞微環(huán)境中很容易發(fā)生失巢凋亡[11]。熱敏水凝膠能改善微環(huán)境，提高移植細(xì)胞的存活率[12]。Gao等[13]用殼聚糖氯化物水凝膠作為細(xì)胞載體，將MSCs運送入I/R誘導(dǎo)的AKI大鼠體內(nèi)，觀察到水凝膠支架可以提高移植MSCs的存活率。

1.4 基因修飾 與其他處理措施相比，基因修飾是一個提高MSCs存活率更精確的方法。通過基因改造，使MSCs過表達細(xì)胞因子或抗細(xì)胞凋亡基因，提高其在受損組織中的存活率[14]。Liu等[15]構(gòu)建了血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells-BMSCs)，發(fā)現(xiàn)HO-1-BMSCs在I/R誘導(dǎo)的AKI腎勻漿上清液(模擬AKI微環(huán)境)中存活率提高。

2 提高MSCs的旁分泌能力

分泌旁分泌介質(zhì)是受損組織中MSCs再生的主要機制。MSCs可以分泌各種細(xì)胞因子、生長因子和蛋白質(zhì)，發(fā)揮抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和促進血管再生的作用[16-18]。

2.1 低氧 實驗證明，低氧預(yù)處理后的BMSCs移植能更有效改善I/R大鼠腎功能、修復(fù)腎臟組織損傷，其作用機制可能與低氧預(yù)處理促進BMSCs旁分泌肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)和堿性成纖維母細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等有關(guān)。Liu等[19]用200 μm/L氯化鈷低氧預(yù)處理BMSCs 24 h，發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)處理BMSCs移植組中，HGF和bFGF的水平相較于常氧培養(yǎng)BMSCs移植組均顯著升高。目前研究認(rèn)為，HGF、bFGF等細(xì)胞因子通過旁分泌作用，下調(diào)腎臟局部促炎細(xì)胞數(shù)量，上調(diào)抗炎細(xì)胞數(shù)量，降低局部促炎因子表達，從而抑制AKI相關(guān)炎癥反應(yīng)，促進腎損傷修復(fù)。

2.2 加入細(xì)胞因子或化合物聯(lián)合培養(yǎng) 加入細(xì)胞因子或化合物聯(lián)合培養(yǎng)也能提高MSCs的旁分泌能力。Bai等[20]用細(xì)胞因子白介素-17A預(yù)處理MSCs后，將其導(dǎo)入AKI大鼠體內(nèi)，該組大鼠急性腎小管壞死評分、Scr和血尿素氮水平均顯著下降。

2.3 改善培養(yǎng)條件 改善培養(yǎng)環(huán)境有助于提高MSCs的旁分泌能力。3D球狀體培養(yǎng)MSCs促進了bFGF、HGF、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和腫瘤壞死因子誘導(dǎo)基因-6(tumor necrosis factor-inducible gene 6,TSG-6)的分泌[10]。

2.4 熱敏水凝膠 熱敏水凝膠不僅提高了MSCs的存活率，而且提高了其旁分泌能力。Feng等[21]表示，使用IGF-1C結(jié)構(gòu)域(IGF-1C-domain,IGF-1C)修飾的殼聚糖水凝膠促進了IGF-1C、HGF和EGF的表達。

2.5 基因修飾 使用慢病毒載體使BMSCs中CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor,CXCR4)過表達，可以提高HGF、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7和白介素-10的表達水平，體內(nèi)實驗中也觀察到腎功能明顯改善[22]。此外，脂質(zhì)運載蛋白-2(lipocalin 2,Lcn-2)在腎小管上皮細(xì)胞再生與增殖中發(fā)揮著重要作用，是對抗AKI的保護因子[23]。Roudkenar等[24]通過修飾MSCs基因上調(diào)Lcn-2的表達，促進HGF、IGF-1、VEGF和成纖維母細(xì)胞生長因子的分泌。

3 影響MSCs治療AKI療效的因素分析

由于MSCs的高度異質(zhì)性和AKI的病理生理復(fù)雜性，MSCs最佳組織來源、細(xì)胞類型、AKI治療劑量和時間等因素的變化，都能影響MSCs治療AKI的療效。

3.1 MSCs的類型與療效 直至目前，BMSCs仍然是各種動物AKI模型中使用最廣泛的一種MSCs，也是目前臨床研究中唯一證實有效的MSCs。但BMSCs有其自身局限性，如相對侵襲性和數(shù)量限制[25]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的MSCs(induced pluripotent stem cell-derived MSCs,iPSC-MSCs)是單克隆細(xì)胞系MSCs從iPSC分離出來的分支，iPSC的自我更新能力成為MSCs無限、無創(chuàng)的來源。iPSC-MSCs的應(yīng)用可以解決一些臨床“瓶頸”，如獲得性MSCs的異質(zhì)性、與供體細(xì)胞衰老相關(guān)的疾病等[26]。雖然研究人員已經(jīng)研發(fā)出不使用病毒載體的誘導(dǎo)方法，但仍存在致癌風(fēng)險。因此，需要更多的研究來證明何為AKI患者最好的選擇。

3.2 MSCs的不同輸送方式與療效 在動物模型中，靜脈注射、動脈注射、腹腔內(nèi)注射和腎內(nèi)注射是4個主要的輸送方式。2013年的一項Meta分析證明，與腹腔內(nèi)注射、靜脈注射相比，動脈注射MSCs能使Scr明顯下降[27]。由于Meta分析的局限性，很難明確哪一條輸送途徑對AKI的治療是最好的。因此，作者需要更多的研究來解決這一問題。

3.3 異體和自體MSCs的療效比較 截至目前，僅一項研究比較了AKI中異體和自體MSCs的安全性和有效性。給I/R誘導(dǎo)的AKI大鼠不同劑量的同種異體和自體MSCs，它們均發(fā)揮腎臟保護作用。此外，同種異體組中一系列纖維化相關(guān)基因表達減少，這或許提示異源MSCs的潛在療效更好[28]。

4 總結(jié)和展望

總之，在臨床AKI治療中MSCs需要量取決于其存活率和旁分泌能力。各種預(yù)處理措施均提高了MSCs的存活率和旁分泌能力，但鑒于不同MSCs治療方案之間的巨大差異性，很難證明哪一種預(yù)處理措施是最好的。根據(jù)MSCs的捐贈者、來源、路線時間和移植所需劑量的不同，需要調(diào)整相應(yīng)的預(yù)處理措施。一個理想的AKI治療方案不僅能提高MSCs的存活率和旁分泌能力，而且還要規(guī)避潛在的毒副作用。隨著這一領(lǐng)域研究的不斷深入，作者期待著MSCs治療AKI的光明前景。