干性年齡相關(guān)性黃斑變性動(dòng)物模型研究進(jìn)展

黃潔，吳星偉

年齡相關(guān)性黃斑變性 （age-related macular degeneration，AMD）是發(fā)達(dá)國(guó)家老年人失明最主要的原因[1]，目前全球大約3000 萬(wàn)AMD 患者，每年約50 萬(wàn)人因AMD 而致盲[2]。AMD 分為干性AMD 和濕性AMD，2002 年對(duì)上海靜安區(qū)曹家渡街道進(jìn)行AMD 的調(diào)查顯示，50 歲以上人群中AMD 的發(fā)病率高達(dá)15.5%，其中干性AMD 占88.1%[3]。年齡是AMD 最大的危險(xiǎn)因素，抽煙、飲酒、陽(yáng)光暴露及高脂肪攝入都會(huì)增加AMD的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]?？寡軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在濕性AMD 的治療中取得顯著臨床療效[6]，但是對(duì)于干性AMD 目前尚無(wú)有效的治療方法。目前有多種藥物仍處于臨床試驗(yàn)當(dāng)中，包括抗氧化劑、神經(jīng)保護(hù)劑、抑制炎癥反應(yīng)類藥物、增加脈絡(luò)膜血流藥物等，但未取得突破性進(jìn)展[7-8]。合適的動(dòng)物模型對(duì)干性AMD 的研究至關(guān)重要，有助于藥物的研發(fā)。目前，有多種針對(duì)干性AMD 的不同發(fā)病機(jī)制進(jìn)行干預(yù)的動(dòng)物模型，現(xiàn)對(duì)各種動(dòng)物模型綜述如下，以期為干性AMD 的研究提供幫助。

1 與AMD 致病基因相關(guān)的轉(zhuǎn)基因鼠動(dòng)物模型

研究證明，AMD 的病理過程涉及氧化應(yīng)激、免疫炎癥、脂及碳水化合物的代謝。目前已經(jīng)篩選出一系列相關(guān)的候選基因建立相應(yīng)的AMD 小鼠模型。

1.1 單核細(xì)胞趨化因子2 及受體敲除模型

炎癥反應(yīng)是AMD 發(fā)病的主要機(jī)制之一，巨噬細(xì)胞是清除補(bǔ)體及免疫復(fù)合物的主要細(xì)胞，其功能受損導(dǎo)致免疫復(fù)合物的堆積，引起功能障礙。超過9 個(gè)月的單核細(xì)胞趨化因子2（chemokine 2，Ccl2）基因敲除（Ccl2-/-）小鼠眼底可見視網(wǎng)膜下沉積物，類似drusen 樣改變，其數(shù)量隨年齡的增長(zhǎng)而增多，視網(wǎng)膜色素上皮 （retinal pigment epithelium，PRE） 細(xì)胞出現(xiàn)水腫、空泡化及電子致密物的沉積，Bruch 膜增厚；而10～12 個(gè)月齡時(shí)出現(xiàn)膠原層及彈力層破裂，隨著小鼠的衰老視網(wǎng)膜出現(xiàn)地圖樣萎縮，RPE 持續(xù)變性及CNV 形成。20 個(gè)月齡Ccl2-/-小鼠的RPE 中開始過度表達(dá)VEGF，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管擴(kuò)張，Bruch 膜的外層出現(xiàn)斷裂[9]。該模型說(shuō)明了Ccl2 在AMD 的發(fā)病過程中具有重要作用。伴隨著Ccl2-/-小鼠模型的衰老，RPE和脈絡(luò)膜中的補(bǔ)體和IgG 沉積。由補(bǔ)體C5 和IgG 誘導(dǎo)的RPE 或脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的Ccl2 可介導(dǎo)脈絡(luò)膜巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到老化的野生型小鼠脈絡(luò)膜中，降解Ccl2-/-或單核細(xì)胞趨化因子2 受體 （chemokine receptor 2，Ccr2） 基因敲除（Ccr2-/-）小鼠眼部的補(bǔ)體C5 和IgG。Ccl2-/-及Ccr2-/-小鼠再現(xiàn)了早期干性AMD 及晚期濕性AMD 類似的病理特征，提示巨噬細(xì)胞募集功能受損是AMD 的重要發(fā)病機(jī)制。

1.2 載脂蛋白E 基因敲除模型

載脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）基因與脂代謝有關(guān)，高脂與高膽固醇飲食是AMD 發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。有研究[10]顯示，對(duì)2 個(gè)月齡的ApoE 基因敲除（ApoE-/-）鼠進(jìn)行高脂飲食喂養(yǎng)4 個(gè)月后小鼠視網(wǎng)膜光感受器及RPE 層出現(xiàn)萎縮及排列紊亂，Bruch 膜厚薄不均，出現(xiàn)drusen 沉積，符合干性AMD 的臨床特點(diǎn)。作為脂代謝模型，該模型需要高脂喂養(yǎng)，成模時(shí)間長(zhǎng)，動(dòng)物容易罹患動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致心臟病。

1.3 超氧化物歧化酶1 及超氧化物歧化酶2 基因敲除模型

氧化應(yīng)激是AMD 形成的機(jī)制之一，氧化應(yīng)激導(dǎo)致視網(wǎng)膜PRE 及感光細(xì)胞的損傷。超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase-1，Sod1）是視網(wǎng)膜抗氧化損傷的主要成員。Sod1 基因敲除（Sod1-/-）小鼠7 個(gè)月齡可觀察到眼底drusen 形成，12個(gè)月齡可觀察到RPE 細(xì)胞的空泡化及變性，17%出現(xiàn)感光細(xì)胞減少[11]。Sod2-/-小鼠模型，視網(wǎng)膜下注射腺相關(guān)病毒-核酶介導(dǎo)的Sod2 mRNA 敲除Sod2 基因的動(dòng)物模型2～4 個(gè)月可以觀察到RPE 細(xì)胞出現(xiàn)空泡，光感受器細(xì)胞層結(jié)構(gòu)紊亂，外核層變薄及Bruch 膜變厚[12]。Sod1-/-及Sod2-/-模型模擬了干性AMD 的病理過程，證實(shí)了氧化應(yīng)激在AMD 發(fā)病過程中的作用。

1.4 核因子E2 相關(guān)因子基因敲除模型

核因子E2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-derived factor2-related factor，Nrf2）與抗氧化反應(yīng)原件通路，是機(jī)體抵御各種氧化應(yīng)激的重要保護(hù)通路。Zhao 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 基因敲除（Nrf2-/-）小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)類似AMD 的病理改變，8～11個(gè)月齡的Nrf2-/-小鼠70%的眼出現(xiàn)drusen 樣改變，1 年后的小鼠出現(xiàn)RPE 細(xì)胞的萎縮，部分病變進(jìn)展成CNV。且12 月齡的Nrf2-/-小鼠的EGR 的a 波和b 波下降與野生型小鼠比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明基因敲除的小鼠視功能下降。

1.5 阿爾茨海默病5xFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠

光感受器細(xì)胞外節(jié)和Bruch 膜中的β 淀粉樣蛋白（amyloid beta，aβ）的含量隨年齡增加而增加。5xFAD 小鼠是一種研究阿爾茨海默病的動(dòng)物模型，能夠發(fā)生aβ 沉積的病理學(xué)特征，視網(wǎng)膜出現(xiàn)退行性改變，可以作為干性AMD 的小鼠模型。采用透射電鏡對(duì)5xFAD 小鼠視網(wǎng)膜RPE 的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)5xFAD 小鼠的RPE 和Bruch 膜的超微結(jié)構(gòu)變化與人類干性AMD 的主要特征相一致，包括RPE 的頂端微絨毛和基底內(nèi)陷消失、Bruch 膜厚度增加、RPE 基底部出現(xiàn)層狀及線狀沉積物、脂褐素顆粒及吞噬未消化的光感受器外節(jié)的吞噬體的聚集[14]。

2 具有AMD 特征的自然小鼠

加速衰老小鼠（senescence-accelerated mouse，SAM）是日本京都大學(xué)對(duì)AKR/J 系小鼠進(jìn)行常規(guī)近親培育時(shí)發(fā)現(xiàn)，該小鼠在早期就表現(xiàn)出老年期的各種身體功能衰退的跡象[15]。12個(gè)品系的SAM 正常生長(zhǎng)一段時(shí)間后出現(xiàn)的特征性病理表現(xiàn)包括前凸、脫發(fā)、皮損、淀粉樣變和早期死亡[16]。實(shí)驗(yàn)研究[17]發(fā)現(xiàn)，在該小鼠8 個(gè)月齡時(shí)，可觀察到眼底類似AMD 樣改變，包括Bruch 膜增厚、RPE 基底部出現(xiàn)層狀及線樣沉積物及小面積的CNV 形成；在11 個(gè)月齡以上的SAM-P8 系小鼠中，有40%出現(xiàn)了脈絡(luò)膜新生血管；12 個(gè)月齡時(shí)發(fā)展為脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮。

3 藥物誘導(dǎo)的動(dòng)物模型

3.1 碘酸鈉誘導(dǎo)的干性AMD 模型

碘酸鈉（NaIO3）是無(wú)機(jī)強(qiáng)氧化劑，研究顯示小鼠眶靜脈叢注射NaIO3后，ERG 波形明顯下降；組織學(xué)切片顯示隨注射時(shí)間的延長(zhǎng)，RPE 層出現(xiàn)色素紊亂、視網(wǎng)膜外核層逐漸變薄，視網(wǎng)膜病變的程度與NaIO3的劑量呈現(xiàn)量效關(guān)系[18]。注射NaIO33 d 時(shí)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡達(dá)到最高峰，且后極部視網(wǎng)膜的損害程度比周邊視網(wǎng)膜重。當(dāng)NaIO3的注射劑量大于20 mg/kg時(shí)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的形態(tài)和功能會(huì)發(fā)生改變，出現(xiàn)類似drusen 樣沉積物及RPE 特異性蛋白減少[19]。實(shí)驗(yàn)[20]證明碘酸鈉誘導(dǎo)的RPE 凋亡受時(shí)間及劑量影響，注射劑量為30～40 mg/kg的小鼠模型適用于研究AMD 的早期病理改變；40～75 mg/kg的劑量會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)生不可逆的損害，不適合做AMD 模型研究[21]。

3.2 聚乙二醇處理動(dòng)物模型

視網(wǎng)膜下注射0.5 mg 聚乙二醇 （polyethylene glycol，PEG）第5 d 導(dǎo)致小鼠外核層（ONL）厚度減少32%，光感受器內(nèi)外段長(zhǎng)度減少61%，ONL 核密度減少49%，RPE 細(xì)胞密度增加31%。同時(shí)檢測(cè)到ONL 層中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)最大水平（6.80±1.99）%。在PEG 注射的眼中發(fā)現(xiàn)RPE 細(xì)胞變性，與對(duì)照組相比，注射PEG 的小鼠視網(wǎng)膜中存在多種炎癥因子表達(dá)上調(diào)，如C3、基質(zhì)金屬蛋白酶9 等。PEG 注射導(dǎo)致的視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)的變化與干性AMD 一致[22]。

4 光損傷視網(wǎng)膜模型

光的氧化損傷增加了AMD 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。光照可誘發(fā)視紫紅質(zhì)、脂褐素等感光分子產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致感光細(xì)胞外節(jié)盤膜的脂質(zhì)過氧化，從而誘發(fā)感光細(xì)胞凋亡，對(duì)視網(wǎng)膜造成損傷。藍(lán)光照射大鼠6 h 后RPE 細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀改變、固縮和壞死[23]。用400 lx 或800 lx 藍(lán)光照射小鼠2 h，5 d 后出現(xiàn)視網(wǎng)膜電圖振幅下降和外核層厚度下降[24]。氧化應(yīng)激、自噬參與視網(wǎng)膜的光損傷過程。氧化應(yīng)激形成大量活性氧及脂質(zhì)過氧化物，減少光感受器外節(jié)膜盤的降解，當(dāng)自噬機(jī)制受損，活性氧的產(chǎn)生和清除不平衡導(dǎo)致RPE 細(xì)胞氧化應(yīng)激加重，發(fā)生損傷。光照產(chǎn)生的視網(wǎng)膜損傷模型與干性AMD 類似，光感受器外節(jié)最先受累。

5 小結(jié)

盡管小鼠沒有黃斑[25]，但干性AMD 小鼠模型仍然囊括了干性AMD 的病理學(xué)和遺傳學(xué)特征。在小鼠AMD 模型中，保持了與人類相同的病理學(xué)特征，如脂褐素的聚集，drusen 的形成，RPE 和光感受器的萎縮以及CNV 的形成。小鼠模型是研究干性AMD 發(fā)病機(jī)制和評(píng)估該疾病新療法的有效工具[26]，對(duì)于研究其發(fā)病機(jī)理、治療和預(yù)防有重要作用。許多模型顯示一個(gè)或多個(gè)AMD 的特點(diǎn)，很少有模型能夠呈現(xiàn)出晚期干性AMD 進(jìn)展為濕性AMD[27]的過程。期待發(fā)現(xiàn)更加接近人類的干性AMD 動(dòng)物模型，為干性AMD 不同臨床階段的研究提供幫助。