糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯窟M(jìn)展

樊煒靜，柳國(guó)斌

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200032； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200032)

糖尿病難愈性創(chuàng)面是目前糖尿病較為常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致截肢的發(fā)生[1]。研究調(diào)查顯示有30%的糖尿病患者會(huì)繼發(fā)皮膚潰瘍，且80%以上的患者在創(chuàng)面愈合后會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[2-4]。周圍神經(jīng)病變、周圍血管病變和感染是糖尿病難愈性創(chuàng)面常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素。近年來(lái)，糖尿病難愈性創(chuàng)面的發(fā)生率明顯升高，不僅給許多患者和家庭帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也給國(guó)家?guī)?lái)了巨額的醫(yī)療花費(fèi)[5-6]。

隨著臨床研究者和患者對(duì)健康的重視和對(duì)生活質(zhì)量要求的提高，糖尿病難愈性創(chuàng)面的治療已經(jīng)成為一項(xiàng)迫在眉睫的工作，而建立正確合理的動(dòng)物模型有利于研究者對(duì)糖尿病難愈性創(chuàng)面進(jìn)行更加深入的研究，為疾病的治療、藥物的研發(fā)提供便利。目前已經(jīng)有較多類型的糖尿病難愈性創(chuàng)面動(dòng)物模型被建立[7-8]。相對(duì)于兔、豬、狗等動(dòng)物模型[9-10]，大鼠在研究中最容易獲得，易于飼養(yǎng)和管理。本文就國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯窟M(jìn)行總結(jié)，歸納各模型的優(yōu)勢(shì)和不足，從而為后續(xù)研究者對(duì)糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯刻峁┧悸贰?/p>

1 糖尿病常規(guī)創(chuàng)面模型

糖尿病常規(guī)創(chuàng)面模型的構(gòu)建主要以臨床特征，即糖尿病場(chǎng)面外在形態(tài)的構(gòu)建為主，通常方法較為簡(jiǎn)單，可復(fù)制性較強(qiáng)[11]。一般分為糖尿病模型的構(gòu)建和創(chuàng)面模型的構(gòu)建兩部分，其創(chuàng)面模型的構(gòu)建多為外部破壞，其用時(shí)較短，易于觀察，但與真實(shí)的糖尿病創(chuàng)面差距較大，在臨床中僅適合單一因素的觀察，應(yīng)用范圍較窄。

1.1 全層皮膚切除法

李友山等[12]使用高脂飼料聯(lián)合STZ方法建立2型糖尿病大鼠模型，在大鼠背部標(biāo)記創(chuàng)面面積后直接剪除標(biāo)記區(qū)域皮膚，深達(dá)筋膜，這種方法操作簡(jiǎn)單，易于復(fù)制，創(chuàng)面面積可控，應(yīng)用最為廣泛。李巧芬等[13]使用Wistar大鼠注射STZ建立糖尿病大鼠模型，在大鼠背部使用打孔器打孔，深入筋膜層，3 d后創(chuàng)面出現(xiàn)肉芽生長(zhǎng)視為建模成功。打孔器的使用使創(chuàng)面面積和創(chuàng)面深度的量化更為準(zhǔn)確。

1.2 低溫誘導(dǎo)法

任萍萍等[14]使用STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型建立慢性創(chuàng)面模型，使用冰塊模擬冬季環(huán)境，將大鼠放置于泡沫保鮮箱中，大鼠足部隔塑料板接觸冰袋，前三天使箱內(nèi)溫度保持在6 ℃，后7天保持在10 ℃左右，觀察大鼠足部變化，出現(xiàn)潰瘍即為造模成功。陳群力等[15]則采用控制室溫，逐漸降溫的方式制造大鼠皮膚創(chuàng)面。這種方法使用低溫誘導(dǎo)的方法造成大鼠足部缺血缺氧，繼而出現(xiàn)紅腫、出血、潰瘍，貼合糖尿病創(chuàng)面的臨床發(fā)展過(guò)程，但操作難度較大，大鼠死亡率較高，創(chuàng)面情況不可控，難以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，臨床推廣性較低。

1.3 高溫燙傷法

TIAN等[16]使用STZ方法建立糖尿病大鼠模型，6周后將大鼠置于燙傷板，大鼠皮膚出現(xiàn)紅腫、滲出的創(chuàng)面則為造模成功。TAKHTFOOLADIM等[17]則利用電子燙傷儀對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行燙傷創(chuàng)面的造模，HE染色可觀察到深Ⅲ度燙傷則代表造模成功。黃仁燕等[18]使用恒溫恒壓燙傷儀進(jìn)行創(chuàng)面的造模，不僅糾正了之前燙傷方法造成的創(chuàng)面形狀、面積不固定的問(wèn)題，也使得定量測(cè)評(píng)分析變得更方便。

2 糖尿病缺血性創(chuàng)面模型

糖尿病性周圍血管病變導(dǎo)致的組織缺氧、營(yíng)養(yǎng)障礙是糖尿病創(chuàng)面出現(xiàn)的直接原因，對(duì)于缺血模型的建立主要有直接血管阻斷和間接壓迫兩種方式[19]，同時(shí)通過(guò)激光多普勒進(jìn)行下肢血流測(cè)定，對(duì)創(chuàng)面周圍缺血的狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估和監(jiān)測(cè)，也使得缺血性創(chuàng)面模型的建立更加精準(zhǔn)。

2.1 皮膚磁片壓迫法

葛良鵬等[20]利用STZ誘導(dǎo)后的糖尿病大鼠模型，將磁片植入大鼠前肢皮下，將外源磁片放置于對(duì)應(yīng)位置皮外，利用磁片之間吸引力形成的壓力制造皮膚缺血，每次2 h后恢復(fù)血流30 min，循環(huán)4 d，以皮膚變黑變硬、針刺不出血為造模成功的標(biāo)志。這種方法建立的創(chuàng)面模型創(chuàng)面面積基本可控，與磁片面積保持一致，利于進(jìn)行定量分析，但皮下植入的操作易造成感染，一方面增加造模操作難度，另一方面有誘發(fā)感染性創(chuàng)面的風(fēng)險(xiǎn)。DUSCHER等[21]對(duì)其方式進(jìn)行了改良，對(duì)糖尿病大鼠的背部皮膚進(jìn)行牽拉，將磁片放置于皮膚兩側(cè)，每天12 h連續(xù)壓迫，21 d內(nèi)通過(guò)觀察皮膚狀況確定造模是否成功。

2.2 動(dòng)脈結(jié)扎離斷法

KIM等[22]將糖尿病大鼠的股動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎，并離斷遠(yuǎn)端所有分支動(dòng)脈，成功建立糖尿病缺血性潰瘍模型，但這種方式造成的急性缺血與真實(shí)糖尿病創(chuàng)面的形成過(guò)程差異太大。李文惠等[23]對(duì)前人的方式進(jìn)行改良，使用STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，結(jié)扎離斷股動(dòng)脈及其主要分支，保留部分側(cè)枝動(dòng)脈供血，并使用SQL-5Q燙傷儀燙傷缺血下肢皮膚，一方面造成不完全缺血狀態(tài)模擬糖尿病創(chuàng)面缺血狀態(tài)，另一方面通過(guò)人為創(chuàng)面縮短造模時(shí)間。

3 糖尿病感染性創(chuàng)面模型

感染是糖尿病創(chuàng)面延期愈合的重要原因，目前糖尿病足潰瘍感染病原菌主要分為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌三大類，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別是革蘭氏陽(yáng)性球菌和革蘭氏陰性球菌感染最多的菌種[24-27]，目前方法主要以創(chuàng)面菌株涂抹和皮下菌株注射為主。

3.1 大腸埃希菌感染的糖尿病創(chuàng)面模型

黃仁燕等[28]使用STZ誘導(dǎo)雄性SD大鼠糖尿病后，先使用恒溫恒壓燙傷儀在大鼠背部下端皮膚進(jìn)行接觸燙傷，以燙傷處出現(xiàn)紅腫、水泡為標(biāo)準(zhǔn)，HE染色可觀察到深度Ⅱ度燙傷代表糖尿病創(chuàng)面模型建模成功，48 h后在創(chuàng)面皮下注射大腸埃希菌懸液，48 h后取局部分泌物做菌培養(yǎng)，檢測(cè)出不耐藥細(xì)菌或機(jī)會(huì)感染菌即為造模成功。

3.2 金黃色葡萄球菌感染的糖尿病創(chuàng)面模型

韓強(qiáng)等[29]使用高脂飼料喂養(yǎng)雄性SD大鼠8周后，使用STZ誘導(dǎo)糖尿病，在大鼠背部下端皮膚使用恒溫恒壓燙傷儀建立體表燙傷模型，創(chuàng)面皮膚接種金黃色葡萄球菌懸液，48 h后創(chuàng)面分泌物菌培養(yǎng)中檢測(cè)出不耐藥細(xì)菌代表建模成功。這種高脂飼料聯(lián)合STZ方法建立的創(chuàng)面模型更大程度地模擬了2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程，在一定程度上能夠避免單純由于STZ殺死胰島β細(xì)胞形成的1型糖尿病。

4 糖尿病神經(jīng)病變性創(chuàng)面模型

糖尿病性周圍神經(jīng)病變是糖尿病創(chuàng)面重要的誘發(fā)因素之一，自主神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)的異常均可導(dǎo)致潰瘍的發(fā)生。目前糖尿病神經(jīng)病變性創(chuàng)面的模型較少，建立主要以神經(jīng)離斷的方式為主，JIN[30]和KALE等[31]通過(guò)手術(shù)分離并結(jié)扎坐骨神經(jīng)的方式構(gòu)建神經(jīng)病變的模型，7 d后大鼠出現(xiàn)自發(fā)性潰瘍。在理論狀態(tài)下這種方式首先通過(guò)大鼠較長(zhǎng)時(shí)間高血糖狀態(tài)的保持以造成機(jī)體病理改變的發(fā)生，繼而通過(guò)神經(jīng)破壞加速病變，最終形成潰瘍，能夠較好模擬糖尿病潰瘍的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。但該方式自發(fā)誘導(dǎo)創(chuàng)面出現(xiàn)的可能性較小，往往需要結(jié)合組織破壞的方式。

5 糖尿病慢性創(chuàng)面模型

創(chuàng)面延期愈合是糖尿病創(chuàng)面的重要臨床特點(diǎn)，如何能夠較好地模擬糖尿病創(chuàng)面的病理過(guò)程、構(gòu)建延期愈合的創(chuàng)面模型也是研究的難點(diǎn)之一，目前延期愈合模型構(gòu)建的方法以免疫抑制為主。彭艷等[32]使用STZ誘導(dǎo)Wistar大鼠構(gòu)建糖尿病模型后，通過(guò)射線照射的方法抑制大鼠的免疫功能，后結(jié)扎股動(dòng)脈，觀察雙下肢皮膚，出現(xiàn)潰瘍則為造模成功。張東萍等[33]則通過(guò)對(duì)Wistar糖尿病大鼠腹腔注射3%的豬胃黏蛋白以降低大鼠機(jī)體的免疫力，延緩創(chuàng)面的愈合過(guò)程，相比其他方法更好地模擬了糖尿病免疫功能抑制狀態(tài)下多種病原微生物混合感染對(duì)糖尿病足發(fā)展的影響，更利于實(shí)驗(yàn)的觀察。

6 糖尿病難愈性創(chuàng)面中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h2>

辨證論治是中醫(yī)治療的根本原則之一，癥候模型的建立對(duì)中醫(yī)基礎(chǔ)研究的發(fā)展有極大的推動(dòng)作用。通過(guò)中醫(yī)理論在普通糖尿病慢性創(chuàng)面的基礎(chǔ)上從創(chuàng)面觀察和大鼠癥狀上構(gòu)建陽(yáng)虛陰證模型，不論是從病理因素還是臨床特征，都更符合糖尿病難愈性創(chuàng)面的特點(diǎn)。但目前各類中醫(yī)證型糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠模型的構(gòu)建方式還存在一定問(wèn)題，主要還是以自行激發(fā)為主，誘導(dǎo)的方式不足，部分證型大鼠模型造模成功率太低。

6.1 糖尿病難愈性創(chuàng)面陰證模型

李媛[34]、蒙玉嬌等[35]探索性使用STZ、皮膚缺損、激素干預(yù)、塑料環(huán)創(chuàng)面邊緣埋置等多因素復(fù)合的方法構(gòu)建糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面陰證模型，通過(guò)使用激素等方式使創(chuàng)面的狀態(tài)更接近臨床中難愈性創(chuàng)面的狀態(tài)、延緩創(chuàng)面愈合，大鼠出現(xiàn)蜷縮、尾冷、大便糖稀、創(chuàng)面分泌物多，滲液清稀，肉芽組織紅而不澤等整體或局部陽(yáng)虛的表現(xiàn)，與臨床中糖尿病足潰瘍的表現(xiàn)相近。糖尿病難愈性創(chuàng)面在中醫(yī)屬于陰證的范疇，患有糖尿病難愈性創(chuàng)面的病人在全身癥狀和創(chuàng)面局部癥狀中均能見(jiàn)到陽(yáng)虛的表現(xiàn)[36-38]。

6.2 腎陰虛型糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠模型

張紅英等[39]對(duì)SD大鼠禁食不禁水后12 h后注射STZ溶液和甲狀腺素構(gòu)建糖尿病大鼠模型，甲狀腺素用以加速陰虛癥候的發(fā)展，如大鼠cAMP/cGMP比值升高，空腹血糖值≥11.1 mmol/L，出現(xiàn)形體消瘦、體毛無(wú)光澤、活動(dòng)增加、反應(yīng)遲鈍、肛門紅腫、大便干結(jié)色黑等癥狀則視為腎陰虛模型造模成功。

6.3 脾氣虛型糖尿病大鼠模型

顏剛等[40]在對(duì)SD大鼠注射STZ溶液后進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)，7 d后測(cè)空腹血糖，如大鼠同時(shí)出現(xiàn)倦怠、懶動(dòng)、大便時(shí)軟時(shí)溏、游泳耐力下降、體毛光亮度減退，則視為脾氣虛型糖尿病大鼠模型成功。

6.4 陰虛內(nèi)熱型糖尿病大鼠模型

吳晏[41]和扶麗君等[42]則系統(tǒng)建立了糖尿病大鼠陰虛內(nèi)熱證型的行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)高脂喂養(yǎng)和STZ誘導(dǎo)后SD大鼠的動(dòng)物神態(tài)、行為、背部溫度、二便情況、舌、爪、活動(dòng)狀態(tài)等方面綜合對(duì)糖尿病大鼠陰虛內(nèi)熱的表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)癥狀學(xué)的判斷更加符合中醫(yī)診斷的過(guò)程，是目前最為常用且較為合理的方法，但缺乏可量化數(shù)據(jù)的支持。

6.5 陰虛血瘀型糖尿病大鼠模型

楊明華等[43]先使用高糖高脂的飼料使大鼠有血瘀型糖尿病的前期準(zhǔn)備，同時(shí)通過(guò)喂甲狀腺素片加速陰虛進(jìn)程，最后注射ALX，使大鼠同時(shí)具備胰島素抵抗和陰虛血瘀的特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)大鼠飲水、被毛、體溫、環(huán)磷酸腺苷含量判斷大鼠的陰虛狀態(tài)，通過(guò)凝血時(shí)間、血液黏度、血漿NO含量等判斷大鼠的血瘀狀態(tài)，成功構(gòu)建陰虛血瘀型糖尿病大鼠模型。

7 討論與展望

目前糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒕鶠槎嗖襟E進(jìn)行，糖尿病模型和皮膚創(chuàng)面模型的先后建立也符合疾病發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程。糖尿病模型建立的方法眾多，基因敲除及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型發(fā)展迅速, 但因其價(jià)格高昂并不是研究者的首選。目前以STZ法誘導(dǎo)應(yīng)用最為廣泛，但通過(guò)高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗后再注射 STZ 的方法，可以損傷胰島功能，引起血糖升高，更貼合2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程。皮膚磁片壓迫法通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的壓力造成局部皮膚缺血缺氧，進(jìn)行形成皮膚壞死性創(chuàng)面，燙傷法建立的糖尿病創(chuàng)面同樣屬于慢性創(chuàng)面，同樣具有延期愈合的特點(diǎn)。相比之下，動(dòng)脈結(jié)扎離斷法建立的急性缺血模型與糖尿病創(chuàng)面的缺血病理過(guò)程并不一致。細(xì)菌原株種植的方式構(gòu)建糖尿病感染性創(chuàng)面模型，在操作上相對(duì)簡(jiǎn)單，但有研究表明，傷口細(xì)菌感染對(duì)創(chuàng)面組織有雙重作用，大量重度感染能夠延緩創(chuàng)面愈合，少量輕度感染則可以加快創(chuàng)面愈合，因此可控性較低，在未來(lái)的研究中應(yīng)對(duì)創(chuàng)面面積和細(xì)菌種植濃度的比例進(jìn)行量化。

在糖尿病動(dòng)物皮膚創(chuàng)面模型建立后, 還要保證其慢性難愈性等病理特征是較為困難的，也是目前糖尿病創(chuàng)面模型進(jìn)一步提高的核心問(wèn)題。在糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建中使用激素是目前較為流行的方式，一方面可以維持組織的低免疫狀態(tài)，另一方面可以起到延緩創(chuàng)面愈合，構(gòu)建慢性創(chuàng)面的作用。但慢性難愈性創(chuàng)面的構(gòu)建仍存在許多難以模擬的因素，如老齡化等，慢性創(chuàng)面的愈合速度與年齡之間的關(guān)系已經(jīng)被證實(shí)，未來(lái)老齡化大鼠的培育相信會(huì)給相關(guān)模型的建立帶來(lái)新的可能。

當(dāng)前階段糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠模型的制備主要以模擬各類病理因素和臨床特征，但僅僅是簡(jiǎn)單的疊加，而非病理過(guò)程的自然轉(zhuǎn)化，創(chuàng)面的形成也多由外部破壞，而非自發(fā)性形成潰瘍，這些都是需要在未來(lái)解決的問(wèn)題。糖尿病難愈性創(chuàng)面的病理過(guò)程是復(fù)雜的，疾病發(fā)展過(guò)程中的表現(xiàn)多樣，構(gòu)建正確合理的大鼠模型需要考慮諸多因素。單因素的模型制備相對(duì)簡(jiǎn)單，但與人類糖尿病難愈性創(chuàng)面的真實(shí)表現(xiàn)有較大差異，因此多因素模型的制備應(yīng)該是未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。而目前多因素模型多為病理因素結(jié)合臨床特征兩方面進(jìn)行制備。對(duì)于臨床特征的觀察，中醫(yī)往往有更為細(xì)致的觀察和獨(dú)特的角度，中西醫(yī)結(jié)合的思路，不僅能準(zhǔn)確把握糖尿病難愈性創(chuàng)面“病”的特點(diǎn)，也能綜合糖尿病難愈性創(chuàng)面“證”的因素，可以最大程度模擬糖尿病難愈性創(chuàng)面的疾病特點(diǎn)，滿足各類實(shí)驗(yàn)的要求。