基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎的機(jī)制研究

張慧，王艷艷，黃莉莉，毛子瑋，李廷利

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

胃炎具有病程長(zhǎng)、復(fù)發(fā)性強(qiáng)的特征，給患者帶來了痛苦，其發(fā)病原因與生物、藥物、生理等多種因素相關(guān)。癥狀以惡心、腹痛、胃潰瘍等常見，病理切片可見胃黏膜上皮薄、肌層增生等[1]。吳茱萸-黃連藥對(duì)是治療胃腸疾病的經(jīng)典中藥藥對(duì)。吳茱萸和黃連藥對(duì)配伍，不同比例會(huì)形成不同的配方且應(yīng)用功效也不盡相同。吳茱萸與黃連藥對(duì)配伍以吳茱萸為君藥，配比6：1時(shí)組成反左金丸，以黃連為君藥配比6：1時(shí)組成左金丸，左金丸出自《丹溪心法·火六》以瀉熱為主，主要針對(duì)胃腸熱癥疾病，肝火犯胃引起的惡心，嘔逆等[2]。后人在左金丸的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良將其比例互換得到反左金丸、甘露散、茱萸丸。反左金丸以吳茱萸作為君藥，用于治療寒凝阻滯引起的胃脘疾病，甘露散以黃連吳茱萸2∶1，主治胃熱型胃腸疾病[3]，茱萸丸以黃連吳茱萸1∶1，主治虛寒型腹瀉下痢等胃腸疾病[4]。這些不同比例的吳茱萸黃連配伍都具有共同的藥理作用：對(duì)胃腸疾病可以抑制與胃酸分泌相關(guān)的激素以及中和胃蛋白酶等、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)還可以抗幽門螺旋桿菌防止胃潰瘍發(fā)生[5-6]。

雖然吳茱萸和黃連在胃癌、胃潰瘍等胃腸疾病中研究較為廣泛[7-9]，臨床報(bào)道吳茱萸黃連治療胃炎有顯著的療效[10]，但是系統(tǒng)介紹吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎的機(jī)制研究較少，且研究靶點(diǎn)較為單一，故此本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)吳茱萸-黃連藥對(duì)配伍治療胃炎機(jī)制進(jìn)行多靶點(diǎn)、多途徑進(jìn)行探討，為今后更深一步研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)、BankDrug、STITCH(Chemical Association Networks)、 Swiss Target Prediction、Uniprot、 GeneCards、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、TTD(Therapeutic Target Database)、HPO (Human Phenotype Ontology)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)String、數(shù)據(jù)庫(kù)DisGeNET、基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)Bioconductor、韋恩圖安裝包Venny 2.1.0、繪圖安裝包c(diǎn)olorspace、stringi等、R語(yǔ)言軟件R×64 3.6.1、軟件Cytoscape 3.7.2。

1.2 方法

1.2.1 吳茱萸-黃連藥對(duì)活性成分的篩選

活性成分的篩選主要為文獻(xiàn)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP和BankDrug中查找獲得。篩選成分的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為OB%≥30，DL≥0.18[11]。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)包含了499 味中草藥以及其化合物約300 000個(gè)成分，它的每個(gè)化合物都提供了關(guān)于人體吸收、分布、代謝(ADME)、OB、DL等相關(guān)性質(zhì)，為藥物活性成分的篩選和活性成分靶點(diǎn)的篩選提供了較為方便的平臺(tái)[7]。

1.2.2 吳茱萸-黃連藥對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP、STITCH、SwissTarget 輸入?yún)擒镙呛忘S連的活性成分，篩選出活性成分的作用靶點(diǎn)整理并導(dǎo)出，去重。然后在Uniprot中的Uniprot KB數(shù)據(jù)庫(kù) Uniprot限定物種為Homo sapiens，然后再使用腳本程序?qū)?duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行注釋校正為其官方名稱，收集整理得到藥物成分-靶點(diǎn)文檔，備用。

1.2.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards、OMIM、TTD、HPO、Uniprot輸入“gastritis”進(jìn)行相關(guān)疾病的檢索，物種限定為人類，之后將全部相關(guān)基因?qū)С霾⑦x擇相關(guān)度大于等于2的靶點(diǎn)，收集整理成疾病靶點(diǎn)文檔，備用。

1.2.4 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用R語(yǔ)言安裝韋恩圖安裝包Venny 2.1.0將成分-靶點(diǎn)文檔和疾病靶點(diǎn)文檔求交集繪制成韋恩圖，并得到成分-疾病文檔，將藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病聯(lián)系建立起來。之后，在軟件Cytoscap 3.7.2輸入相關(guān)文件，繪制藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

我們檢索string網(wǎng)站，在選項(xiàng)種選擇多個(gè)蛋白選項(xiàng)，將上述關(guān)鍵靶點(diǎn)粘貼輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)，物種限定為Homo sapiens，點(diǎn)擊繼續(xù)后得到蛋白互建PPI網(wǎng)絡(luò)，得到的PPI網(wǎng)絡(luò)圖關(guān)系線適中，故對(duì)網(wǎng)站默認(rèn)參數(shù)不進(jìn)行修改，設(shè)置默認(rèn)最低相互作用閥值“medium confidence”為0. 4，之后以將結(jié)果以tsv格式導(dǎo)出，從而得到蛋白相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)圖。數(shù)據(jù)庫(kù)String 能夠查詢已知約九百六十萬蛋白之間的相互作用關(guān)系，預(yù)測(cè)蛋白與蛋白之間約十三億八千萬多種相互作用關(guān)系，為藥物作用靶點(diǎn)的篩選提供了方便[11]，此外，該數(shù)據(jù)庫(kù)還總結(jié)了實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)得到的數(shù)據(jù)，為實(shí)驗(yàn)開展提供依據(jù)。

1.2.6 基因本體論生物學(xué)過程分析(gene ontology，GO)、KEGG通路富集分析

先將關(guān)鍵靶點(diǎn)用腳本將symbol轉(zhuǎn)換為ID后，在R中進(jìn)行相關(guān)安裝包(colorspace，stringi)的安裝后，用R語(yǔ)言在Bioconductor平臺(tái)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。導(dǎo)出保存GO富集分析表格、KEGG富集分析表格，KEGG通路圖[11]。

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸-黃連藥對(duì)活性成分以及靶點(diǎn)的篩選

在數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP以及Bankdurg中分別輸入?yún)擒镙呛忘S連，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18對(duì)成分進(jìn)行篩選，吳茱萸篩選得29個(gè)，黃連篩選得到14個(gè)，兩者共同成分有2種，分別為berberine(小檗堿)、quercetin(槲皮素)。其中，去除沒有與胃炎靶點(diǎn)基因相對(duì)應(yīng)的成分，共篩選出符合條件的23個(gè)成分，吳茱萸是17個(gè)，黃連是8個(gè)，二者相同成分2個(gè)(見表1)。然后，將活性成分在數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP中的靶點(diǎn)整合得到一起，再?gòu)臄?shù)據(jù)庫(kù)STITCH、數(shù)據(jù)庫(kù)SwissTarget 篩選相關(guān)活性成分的靶點(diǎn)，刪除相同的靶點(diǎn)，共得到79個(gè)活性成分靶點(diǎn)。

2.2 胃炎疾病靶點(diǎn)的篩選

在數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCard、OMIM、TTD、HPO中輸入“gastritis”，得到胃炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)后，去重，選取其中相關(guān)度大于等于2的靶點(diǎn)，共獲得233個(gè)疾病靶點(diǎn)。利用 R 語(yǔ)言安裝韋恩圖繪制包繪制韋恩圖，獲得共同基因18 個(gè)，分別為CASP3、VEGFA、EGFR、IL6、MYC、CCND1、ERBB2、PPARG、CASP8、ICAM1、PTGS1、BCL2、NFKBIA、BIRC5、GSTP1、PARP1、RASSF1、GSTM1。在數(shù)據(jù)庫(kù)DisGeNET中依次輸入這18個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)得到關(guān)于這些靶點(diǎn)的相關(guān)信息(見表2)。這些靶點(diǎn)中CASP3、CCND1、CASP8、PTGS1、BIRC5、RASSF1，6個(gè)是屬于酶類；MYC、PPARG，2個(gè)屬于轉(zhuǎn)錄因子，其中PPARG還是一種受體；EGFR、BCL2，2個(gè)屬于受體類型；VEGFA屬于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；IL6屬于細(xì)胞介素；以及ERBB2、ICAM1、NFKBIA、GSTP1、PARP1、GSTM1，6個(gè)未知類型的靶點(diǎn)基因。這些多類型的靶點(diǎn)基因說明吳茱萸-黃連藥對(duì)在治療胃炎疾病時(shí)不是單一途徑，這可能與中藥配伍相互作用的多成分，多靶點(diǎn)治療疾病的機(jī)制有關(guān)，符合中醫(yī)理論中的“整體觀念”，即人是一個(gè)有機(jī)的整體, 不僅包含了生理上、病理上的整體性還包括了診治上的整體性[12]。診斷疾病的處方更加要求各藥味協(xié)同發(fā)揮作用，以達(dá)到最好的治療效果。

表1 吳茱萸黃連活性成分篩選(OB≥30%，DL≥0.18)

表2 胃炎疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)及類型

2.3 藥物-活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

黃連與胃炎相關(guān)的作用靶點(diǎn)的活性成分有8個(gè)，分別為 berberine、berberrubine、(R)-canadine、berlambine、palmatine、coptisine、worenine、quercetin；吳茱萸與胃炎相關(guān)的作用靶點(diǎn)活性成分有17個(gè)，分別為rutaecarpine、isorhamnetin、beta-sitosterol、Rutalinidine、dihydrorutaecarpine、Evodiamine、1-(5,7,8-trimethoxy-2,2-dimethylchromen-6-yl)ethanone、hydroxyevodiamine、6-OH-Luteolin、Evodiamide、Goshuyuamide I、Goshuyuamide II、Gossypetin、Gravacridoneshlirine、N-(2-Methylaminobenzoyl)tryptamine、quercetin、berberine。其對(duì)胃炎作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的共同活性成分為 berberine、quercetin，將吳茱萸-黃連藥對(duì)藥味名稱、活性成分mol ID 號(hào)、疾病名稱、與胃炎相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)名稱，輸入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化(見圖1)。平行四邊形代表胃炎疾病，長(zhǎng)方形代表吳茱萸-黃連藥對(duì)藥味黃連和吳茱萸，三角形代表活性成分，橢圓形代表靶點(diǎn)，相關(guān)連線代表二者之間的相互作用關(guān)系。如圖2所示，結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中有75個(gè)節(jié)點(diǎn)和89條邊，連線代表二者之間相關(guān)，其中PTGS1與多種活性成分相關(guān)，推測(cè)為胃炎關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖1 吳茱萸-黃連藥對(duì)活性成分及胃炎關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎的18個(gè)潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，設(shè)置物種為人類，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，得到各蛋白相互作用圖(見圖2)。網(wǎng)絡(luò)中包含了18個(gè)節(jié)點(diǎn)以及86條邊，其中前五個(gè)連線最大的基因?yàn)镸YC、CASP3、CCND1、EGFR、CASP8。平均節(jié)點(diǎn)度為9.56，推測(cè)這些靶點(diǎn)基因?yàn)閰擒镙?黃連藥對(duì)治療胃炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 吳茱萸-黃連藥對(duì)抗胃炎相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因GO分析

GO富集分析顯示，吳茱萸-黃連藥對(duì)中的18個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因選取錯(cuò)誤率P<0.05的前20個(gè)功能信息(見表3)發(fā)現(xiàn)，吳茱萸-黃連藥對(duì)活性成分治療胃炎所涉及到的功能主要有對(duì)不同蛋白的結(jié)合,其中有蛋白磷酸酶、谷胱甘肽結(jié)合、細(xì)胞因子受體、凋亡受體、生長(zhǎng)因子受體以及與過氧化氫受體有關(guān)的受體，腫瘤壞死因子家族受體等。其次還有與激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合功能、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶的功能、磷脂酶激活功能、 依賴于細(xì)胞周期蛋白的絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑功能、NAD+ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶功能等。

表3 吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎基因具有的GO功能信息

續(xù)表3

2.6 吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG分析

通路富集選取發(fā)生錯(cuò)誤率P<0.05的前20相關(guān)通路(見表4)發(fā)現(xiàn)，與吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎相關(guān)的通路主要有HIF-1信號(hào)通路、腫瘤壞死因子TNF信號(hào)通路。此外，吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎還和結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、艾巴氏病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、癌癥微型病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、多種細(xì)胞凋亡通路、酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、癌癥的蛋白聚糖通路、軍團(tuán)菌病通路有關(guān)。說明吳茱萸-黃連藥對(duì)在治療胃炎過程中不止依賴于單一通路，而且還從不同疾病的通路著手，對(duì)胃炎進(jìn)行多方面治療，這為吳茱萸-黃連藥對(duì)預(yù)防和治療胃炎提供了新的方案。

表4 吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路分析

3 討論

2015版《中國(guó)藥典》記載吳茱萸味辛、苦，熱；有小毒。歸肝、脾、胃、腎經(jīng)。功能與主治有散寒止痛，降逆止嘔，助陽(yáng)止瀉。用于厥陰頭痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣，經(jīng)行腹痛，脘腹脹痛，嘔吐吞酸，五更泄瀉。吳茱萸主要生物活性成分為生物堿類，包括吳茱萸堿、去氫吳茱萸堿、小檗堿等，其主要藥理作用是可以增強(qiáng)心肌收縮力，抗再灌注引起的心肌缺血性心率失常，對(duì)胃腸產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛影響[13-15]。黃連味苦，寒。歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)。功能與主治有清熱燥濕，瀉火解毒。用于濕熱痞滿，嘔吐吞酸，瀉痢，黃疸，高熱神昏，心火亢盛，心煩不寐，心悸不寧，血熱吐衄，目赤，牙痛，消渴，癰腫疔瘡；外治濕疹，濕瘡，耳道流膿。黃連的主要生物活性成分也是生物堿，如小檗堿、黃連堿、掌葉防己堿等。黃連的藥理作用主要以抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒為主[16-17]。本文對(duì)吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎成分篩選后發(fā)現(xiàn)，從吳茱萸中篩選出吲哚類生物堿8個(gè)(rutaecarpine、Evodiamine、Goshuyuamide I、Goshuyuamide II、N-(2-Methylaminobenzoyl)tryptamine 、hydroxyevodiamine、dihydrorutaecarpine、berberine)，酰胺類1個(gè)(Evodiamide)，黃酮類成分4個(gè)(isorhamnetin、quercetin、6-OH-Luteolin、Gossypetin)，揮發(fā)油2個(gè)(beta-sitosterol、Rutalinidine)，其他類2個(gè)(1-(5,7,8-trimethoxy-2,2-dimethylchromen-6-yl)ethanone、Gravacridoneshlirine)。從黃連中篩選的活性成分除槲皮素屬于黃酮類(quercetin)成分，其他7個(gè)成分(berberine、berberrubine、(R)-canadine、berlambine、palmatine、coptisine、worenine)均為生物堿。研究證實(shí)，吳茱萸與黃連二者配伍后水煎液中吳茱萸生物堿含量溶出減少，而吳茱萸酰胺、次吳茱萸堿等成分則溶出增強(qiáng)，部分揮發(fā)油含量也有所增加，且檢測(cè)出了二者單煎液中未有成分[18]。在二者配伍對(duì)胃腸疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，吳茱萸-黃連藥對(duì)水煎液及生物堿成分均具有抗胃潰瘍作用，可以減少胃黏膜的充血、出血和糜爛, 減少黏膜層和黏膜下層的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但是生物堿組則優(yōu)于水煎液組，其胃黏膜損傷抑制率達(dá)到81.14%。在建立的寒熱大鼠胃黏膜損傷模型中，吳茱萸-黃連藥對(duì)均可以抑制幽門螺旋桿菌、促進(jìn)胃黏膜修復(fù)、炎癥因子IL-8，腫瘤壞死因子TNF-α含量也明顯降低[19]，因此，推斷吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎的主要有效成分是生物堿，對(duì)不同證候的胃炎均有作用[20]。

通過預(yù)測(cè)吳茱萸-黃連藥對(duì)與胃炎疾病共有靶點(diǎn)基因是CASP3、EGFR、IL-6、MYC、CCND1等共18個(gè)。CASP3參與caspase的激活級(jí)聯(lián),負(fù)責(zé)凋亡的執(zhí)行[21]。EGFR 是表皮生長(zhǎng)因子受體，IL-6是細(xì)胞介素，研究發(fā)現(xiàn)，在辣椒煎液復(fù)制的胃熱型大鼠模型中，給藥左金丸組明顯減低IL-2、IL-6、IL-1β含量，顯著增加血清中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、還原型谷胱甘肽、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化相關(guān)的酶含量[22]。而本文在對(duì)吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎基于 GO 功能富集化分析中發(fā)現(xiàn)，吳茱萸-黃連藥對(duì)活性成分治療胃炎所涉及到的功能主要有對(duì)不同蛋白的結(jié)合,其中有蛋白磷酸酶、谷胱甘肽、細(xì)胞因子受體、凋亡受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體以及與過氧化氫受體有關(guān)的受體，腫瘤壞死因子家族受體等，說明吳茱萸-黃連藥對(duì)在治療胃炎疾病時(shí)主要功能是抗胃黏膜氧化損傷，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，修復(fù)胃黏膜表皮細(xì)胞。

關(guān)鍵靶點(diǎn)基因通路(KEGG)分析發(fā)現(xiàn)吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎還和結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、艾巴氏病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、癌癥微型病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、多種細(xì)胞凋亡通路、酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、癌癥的蛋白聚糖通路、軍團(tuán)菌病通路、HIF-1信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等相關(guān)。尤其以HIF-1信號(hào)通路最為重要，HIF-1信號(hào)通路參與生物發(fā)育、代謝、貧血、損傷修復(fù)等生理和病理生理過程，HIF-1(低氧誘導(dǎo)因子-1)是感知低氧的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，其在神經(jīng)干細(xì)胞增值中有著重要作用[23]，這為胃炎發(fā)病過程中胃黏膜損傷的治療提供了可能性。此外，在基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃癌、高血壓、胃潰瘍等胃腸疾病時(shí)[11，24-26]涉及到很多相類似的信號(hào)通路及功能。這使得吳茱萸-黃連藥對(duì)作用不同疾病時(shí)會(huì)通過相同的作用機(jī)制，其基本功能主要從抗氧化、抗損傷、增強(qiáng)機(jī)體自身修復(fù)、啟動(dòng)相關(guān)凋亡程序及凋亡因子清除機(jī)體障礙，這也使得吳茱萸-黃連藥對(duì)成為治療癌癥的潛在藥物。但是這些推測(cè)的作用通路還有待于后期實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從理論上初步分析了吳茱萸-黃連藥對(duì)治療胃炎的主要活性成分為生物堿類，通過HIF-1信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等發(fā)揮抗氧化、抗損傷、抑制炎癥因子產(chǎn)生等作用。結(jié)果提示吳茱萸-黃連藥對(duì)在胃炎治療過程中運(yùn)用多通路聯(lián)合協(xié)同方式，為胃炎的防治和治療提供了可行性理論指導(dǎo)以及對(duì)今后的胃炎研究提供了新思路。