基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的金蓮花活性成分抗炎機(jī)制研究

郭艷麗，劉維麗，鞠愛(ài)霞，馬偉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

金蓮花來(lái)源于毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花及花蕾[1]，具有清熱解毒、消腫明目功效，主治刃傷、瘡瘍多膿及咽喉腫痛等病癥[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究金蓮花有很好的廣譜抗菌作用，臨床中主要用于治療上呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎等[3-5]，近年來(lái)有報(bào)道稱其抗炎作用甚至高于常用抗菌素[6-8]，且副作用小，但其作用機(jī)理尚不明確。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)的角度和分子水平研究中藥及中藥方劑的藥效機(jī)理。中藥藥理學(xué)要解決的核心問(wèn)題是，如何在疾病相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的背景下，評(píng)價(jià)中藥的多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路與中醫(yī)藥整體觀念一致，可應(yīng)用于解決中藥及復(fù)方研究中多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用特點(diǎn)帶來(lái)的難題[10]。目前已經(jīng)建立了若干數(shù)據(jù)庫(kù)，提供有關(guān)中藥的各方面信息，包括疾病、方劑、草藥或天然產(chǎn)物、生物活性成分和靶點(diǎn)。這些數(shù)據(jù)庫(kù)成為中醫(yī)藥與現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)之間的橋梁，在中藥藥理學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用。本研究利用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，探究金蓮花抗炎功能的作用靶點(diǎn)和相關(guān)基因，為金蓮花抗炎的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 金蓮花活性成分靶點(diǎn)的獲取及活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索金蓮花，查找金蓮花的活性成分，以口服利用度(OB)和類藥性(DL)兩個(gè)指標(biāo)對(duì)活性成分進(jìn)行篩選，篩選到的活性和其相關(guān)靶點(diǎn)整理。將去除重復(fù)的靶點(diǎn)蛋白輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)的Uniprot KB搜索，限定物種為人類，檢索到的蛋白與對(duì)應(yīng)的基因整理成Excel表格，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 炎癥相關(guān)基因的獲得及相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，選擇Gene選項(xiàng)，輸入檢索詞“inflammation”，得到與人類炎癥相關(guān)的基因，將這些基因數(shù)據(jù)整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，對(duì)“meaning of network edges項(xiàng)”和“minimum required interaction score項(xiàng)”進(jìn)行參數(shù)設(shè)定，形成炎癥靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.3 金蓮花活性成分-抗炎作用靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.1中所得金蓮花活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與1.2中炎癥的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得金蓮花活性成分抗炎靶點(diǎn)，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建金蓮花活性成分-抗炎作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 金蓮花活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在TCMSP平臺(tái)以金蓮花為關(guān)鍵詞，搜索到金蓮花活性成分共計(jì)51種，選擇OB≥30%、DL≥0.18，篩選到活性成分7種，能找到靶點(diǎn)蛋白的活性成分共計(jì)6種(有一種活性成分未有對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白)，6種活性成分信息見表1。

表1 7種活性成分信息

檢索6種活性物質(zhì)共得到靶點(diǎn)蛋白244個(gè)，去除重復(fù)后得到183個(gè)靶點(diǎn)蛋白。將183個(gè)靶點(diǎn)蛋白在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，其中166個(gè)靶點(diǎn)蛋白能夠搜索到相應(yīng)的靶點(diǎn)基因，共找到靶點(diǎn)基因 166 個(gè)。將6種活性成分與靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，得到活性成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)，圖1。圖1中圓代表活性成分，三角代表基因靶點(diǎn)。用network analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，自由度越大則表明通過(guò)該靶點(diǎn)發(fā)揮作用的可能性越大，以自由度≥5為篩選目標(biāo)，得到靶點(diǎn)基因3個(gè)，分別是Ptgs1、Ptgs2、Ncoa2，其在網(wǎng)絡(luò)中的具體參數(shù)信息詳見表2。

2.2 抗炎靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇Gene選項(xiàng)，輸入檢索詞“inflammation”，得到與人類炎癥相關(guān)基因1882個(gè)，下載數(shù)據(jù)整理成Exel表格，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，參數(shù)設(shè)定:meaning of network edges項(xiàng)選擇“evidence”、minimum required interaction score項(xiàng)選擇“highest confidence(0.900)”形成炎癥靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，圖2。圖中共有節(jié)點(diǎn)1 776個(gè)，邊條17 185個(gè)。

圖1 活性成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖

表2 靶點(diǎn)基因Ptgs1、Ptgs2、Ncoa2在網(wǎng)絡(luò)中的具體參數(shù)信息

圖2 炎癥靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 金蓮花活性成分-抗炎作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將2.1所得6種活性化合物的166個(gè)靶點(diǎn)與2.2炎癥的相關(guān)1 882個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，即兩者取交集，構(gòu)建金蓮花-抗炎的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。即利用 Cytoscape 3.7.2軟件的merge功能獲得金蓮花活性成分-抗炎作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，圖3。圖3中金蓮花活性成分與抗炎靶點(diǎn)的交集(去除重復(fù))共計(jì)87個(gè)。其中，刺槐素(acacetin)抗炎靶點(diǎn)16個(gè)，β-谷甾醇(beta-sitosterol)抗炎靶點(diǎn)15個(gè)，谷甾醇(sitosterol)抗炎靶點(diǎn)2個(gè)，果膠蛋白(Pectolinarigenin)抗炎靶點(diǎn)6個(gè)，玄參黃酮(Skrofulein)抗炎靶點(diǎn)5個(gè)，槲皮素(quercetin)抗炎靶點(diǎn)80個(gè)。6種活性成分相對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)個(gè)數(shù)及名稱見表3。

圖3 金蓮花活性成分-抗炎作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表3 6種活性成分相對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)個(gè)數(shù)及名稱

3 討論

金蓮花作為傳統(tǒng)的清熱解毒藥，其抗炎效果好，不容易出現(xiàn)耐藥性，且毒副作用低，是臨床常用且好用的抗菌消炎的中藥，其中成藥制劑在治療感冒、發(fā)熱及咽喉腫痛等病癥中更是應(yīng)用廣泛[11]。目前藥理學(xué)研究證實(shí)金蓮花提取物具有良好的抑制細(xì)菌能力及治療上呼吸道感染、咽炎和痤瘡方面的藥理作用，和臨床效果一致，但其抗炎機(jī)制的研究少見。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)平臺(tái)，共檢索到金蓮花口服利用度≥30%、類藥性≥0.18的活性成分7個(gè)，其中6個(gè)活性成分具有靶點(diǎn)蛋白，靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因中自由度≥5的共計(jì)3個(gè)，分別是Ptgs1、Ptgs2、Ncoa2基因；金蓮花-抗炎靶點(diǎn)基因共計(jì)87個(gè)，包括刺槐素抗炎靶點(diǎn)16個(gè)，β-谷甾醇抗炎靶點(diǎn)15個(gè)，果膠蛋白抗炎靶點(diǎn)6個(gè)，谷甾醇抗炎靶點(diǎn)2個(gè)，玄參黃酮抗炎靶點(diǎn)5個(gè)，槲皮素抗炎靶點(diǎn)80個(gè)，其中自由度≥5的抗炎靶點(diǎn)基因2個(gè)，分別是Ptgs1、Ptgs2，且Ptgs1、Ptgs2在5個(gè)活性成分(acacetin，beta-sitosterol，Pectolinarigenin，Skrofulein，quercetin)中均有出現(xiàn)，因此判斷Ptgs1、Ptgs2是金蓮花中5個(gè)活性成分共有的抗炎靶點(diǎn)。

前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶(PTGS)，又稱環(huán)加氧酶，是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶，既是一種雙加氧酶又是一種過(guò)氧化物酶。PTGS有兩種同工酶：組成型PTGS1和誘導(dǎo)型PTGS2，它們?cè)诒磉_(dá)和組織分布調(diào)節(jié)上存在差異。PTGS2基因編碼誘導(dǎo)同工酶。它由特定的刺激事件調(diào)節(jié)，提示它與炎癥和有絲分裂發(fā)生相關(guān)的前列腺素生物合成有關(guān)。PTGS1和PTGS2主要參與前列腺素的合成、前列腺素的代謝過(guò)程、脂肪酸合成過(guò)程、脂肪酸代謝過(guò)程、脂質(zhì)代謝過(guò)程等，還參與對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等。金蓮花主要化學(xué)成分有黃酮類、有機(jī)酸、生物堿等，黃酮類的含量最高，總黃酮約占金蓮花干重的 16%[12]，被認(rèn)為是金蓮花中最主要活性物質(zhì)，藥理學(xué)研究也證實(shí)金蓮花抗菌抗炎的主要活性成分是黃酮類化合物[13]。槲皮素屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗血小板聚集、抗氧化以及減輕心肌肥厚、抑制T細(xì)胞體外活化等多種作用[14-16]；槲皮素的抗炎作用主要表現(xiàn)在能減少急性、慢性和亞臨床癥狀的炎癥過(guò)程，并能抑制巨噬細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，減少致命的休克反應(yīng)[17-19]。本研究中金蓮花抗炎靶點(diǎn)基因共獲得87個(gè)，其中槲皮素抗炎靶點(diǎn)基因有80個(gè)，Ptgs1、Ptgs2是金蓮花中5個(gè)活性成分共有的抗炎靶點(diǎn)，因此我們推測(cè)金蓮花發(fā)揮抗炎作用的活性成分可能是槲皮素；推斷金蓮花抗炎的主要作用靶點(diǎn)是Ptgs1、Ptgs2基因。槲皮素是通過(guò)怎樣的途徑來(lái)影響Ptgs1、Ptgs2基因，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用，是有待進(jìn)一步研究的。