胸腔積液中IL-33、ADA及外周血T-SPOT.TB聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值

金芬華 王道會(huì) 林慧 彭燕平 何劍波 夏曉東

結(jié)核性胸膜炎是常見的一種肺外結(jié)核病。胸膜活檢和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)是結(jié)核性胸膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因胸膜活檢的創(chuàng)傷性、結(jié)核桿菌培養(yǎng)困難等原因使診斷較為困難[1-2]。隨著近年來(lái)酶學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，酶類及細(xì)胞因子在各種免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中越來(lái)越受到關(guān)注[3]。腺苷脫氨酶（adenosinedeaminase,ADA）存在于人體各組織，主要參與嘌呤核苷的分解，近年來(lái)臨床上廣泛用于結(jié)核病的診斷[4]。ADA檢測(cè)是目前所公認(rèn)的一種診斷結(jié)核性胸膜炎的理想指標(biāo)[5]。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（tuberculosis T cell spot detection，T-SPOT.TB） 屬于干擾素-γ 釋放試驗(yàn)（interferon-γrelealseassay，IGRA）的一種。該法主要利用結(jié)核特異性抗原（EAST-6，CFP-10）通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（enzymelinked immunospotassay,ELISPOT）檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）特異性抗原刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌干擾素 γ(interferon-γ，IFN-γ)的T細(xì)胞數(shù),可作為結(jié)核病早期臨床診斷的輔助方法[6-7]。研究顯示在結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中白介素（interleukin，IL）-33的水平明顯高于其他病因引起的胸腔積液[8-10]。因此，我們推測(cè)IL-33可能在結(jié)核性胸腔積液（tuberculous pleural effusion，TPE）的產(chǎn)生中扮演重要角色。本研究通過(guò)分析胸腔積液中IL-33與ADA、外周血T-SPOT.TB的相關(guān)性，以及3者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值，旨在為臨床診斷結(jié)核性胸膜炎提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2017年6月至2018年12月在本院呼吸內(nèi)科住院的胸腔積液患者79例，其中男52例，女27例，年齡 16～89（48±20）歲。根據(jù)診斷結(jié)果分為兩組，TPE 組 57例，男 41 例，女 16 例，年齡 16～89（39±18）歲；非TPE組22例（惡性胸腔積液17例，類肺炎性胸腔積液 5例），男 11 例，女 11 例，年齡 41～88（63±13）歲。兩組患者性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），年齡比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）TPE：①胸腔積液檢測(cè)到抗酸桿菌和（或）在胸膜活檢樣本中發(fā)現(xiàn)肉芽腫樣改變者，并能排除其它原因所導(dǎo)致的肉芽腫性胸膜炎；②根據(jù)胸腔積液Light標(biāo)準(zhǔn)若符合滲出性改變，抗結(jié)核治療，胸腔積液吸收，并且臨床癥狀緩解。（2）非TPE：包括惡性胸腔積液和類肺炎性胸腔積液。①惡性胸腔積液：影像學(xué)結(jié)果符合原發(fā)性支氣管肺癌并發(fā)胸腔積液；經(jīng)纖維支氣管鏡或者胸腔鏡取得的肺部組織活檢其病理學(xué)確診為肺癌；胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查檢測(cè)到轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞。②類肺炎性胸腔積液：有咳嗽、咳痰和發(fā)熱癥狀，且胸部影像學(xué)檢查提示肺部滲出影，并經(jīng)抗生素治療后胸水吸收。排除標(biāo)準(zhǔn)：符合以下任意一項(xiàng)者，（1）患者在入院前半年內(nèi)，罹患有胸部外傷者或接受關(guān)于創(chuàng)性胸膜腔檢查治療者；（2）患者曾接受過(guò)抗腫瘤或抗結(jié)核治療；（3）患者使用過(guò)糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥，或免疫抑制劑者；（4）患者胸腔積液的病因診斷不明確者；（5）風(fēng)濕免疫性疾病等導(dǎo)致的胸腔積液患者。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 胸腔積液患者住院經(jīng)超聲定位行胸腔穿刺置管術(shù)收集引流液5ml，與500U/ml的淡肝素混合，3 000r/min離心10min，收集上清液置于-80℃冰箱保存，待測(cè)定IL-33；收集引流液10ml送本院檢驗(yàn)科化驗(yàn)室測(cè)定 ADA、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）。采集入選者外周晨起空腹肘靜脈血5ml送本院檢驗(yàn)科化驗(yàn)室進(jìn)行T-SPOT.TB測(cè)定。

1.2.2 檢測(cè)方法 胸腔積液中IL-33的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，試劑盒由英國(guó)abcam公司提供，操作步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。ADA、LDH檢測(cè)由本院檢驗(yàn)科醫(yī)師采用德國(guó)西門子AVDIA2400全自動(dòng)生化儀協(xié)助檢測(cè)完成。外周血T-SPOT.TB檢測(cè)由本院檢驗(yàn)科醫(yī)師按照說(shuō)明書嚴(yán)格操作，TB-IGRA培養(yǎng)管由廈門萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位間距）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線，最佳臨界值依據(jù)約登指數(shù)（敏感度+特異度-1）確定。計(jì)算IL-33水平對(duì)結(jié)核性胸膜炎的最佳診斷閾值及相應(yīng)的敏感度和特異度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者胸腔積液中IL-33、ADA、LDH水平和外周血T-SPOT.TB水平比較 見表1。

表1 各組患者胸腔積液中IL-33、ADA、LDH和外周血T-SPOT.TB水平比較

由表1可見，TPE組患者胸腔積液中ADA、IL-33及外周血T-SPOT.TB水平明顯高于非TPE組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01）。

2.2 胸腔積液中IL-33水平與ADA水平、外周血TSPOT.TB水平的相關(guān)性分析 見圖1、圖2。

圖2 胸腔積液中IL-33水平與外周血T-SPOT.TB水平的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

由圖1、2可見，胸腔積液中IL-33水平與ADA、外周血 T-SPOT.TB 水平均呈正相關(guān) （r=0.343、0.450，均P＜0.05）。

2.3 胸腔積液中ADA、IL-33和外周血T-SPOT.TB水平對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值 見表2、圖3。

表2 胸腔積液中IL-33、ADA和外周血T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值

圖3 胸腔積液中ADA、IL-33和外周血T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核性胸膜炎診斷的ROC曲線

由表2、圖3可見，胸腔積液中IL-33、ADA水平和外周血 T-SPOT.TB診斷 TPE 的 AUC分別為 0.753、0.912 和 0.865，靈敏度分別為 49.1%、93.0%和 92.3%，特異度分別為 100.0%、90.9%和 71.4%。

2.4 胸腔積液中 IL-33、ADA和外周血 T-SPOT.TB 3者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值 見表3。

表3 胸腔積液中IL-33、ADA和外周血T-SPOT.TB 3者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值

由表3可見，胸腔積液IL-33、ADA和外周血TSPOT.TB 3 者聯(lián)合檢測(cè)時(shí) AUC 最大，為 0.962，特異度100.0%，靈敏度 88.5%。

3 討論

結(jié)核性胸膜炎是導(dǎo)致胸腔積液的最常見病因，占我國(guó)胸腔積液住院患者病因的 49.5%～54.5%[11]。臨床醫(yī)生需要一種快速有效的檢測(cè)方法，以便早期診治TPE患者，減少因TPE所致的結(jié)核性膿胸、肺毀損等并發(fā)癥[12]。

IL-33由Schmitz等[13]2005年證實(shí)，屬于IL-1類細(xì)胞因子超家族新成員，具有家族成員相似的同源性結(jié)構(gòu)三葉草形結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中IL-33水平明顯高于非TPE，TPE中IL-33的AUC 為 0.753，以 155.96ng/L為最佳截?cái)嘀禃r(shí)靈敏度為49.1%，特異度為100%。胸腔積液中IL-33水平與ADA、外周血T-SPOT.TB均呈正相關(guān)。Lee和Xuan等[9-10]發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中IL-33水平明顯高于其他病因積液和自身血清水平，其靈敏度分別為78%和86.96%，特異度分別為65%和90.48%。與本研究類似，Lee等[9]的研究結(jié)果提示胸腔積液中IL-33水平與ADA呈明顯正相關(guān)。Li等[8]的研究也顯示，IL-33診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度為83.9%，特異度為87.3%，AUC為0.823。所以，以上證據(jù)顯示，與非TPE相比，IL-33與TPE的病理生理更有相關(guān)性。雖然我們沒(méi)有明確IL-33對(duì)TPE發(fā)病的具體作用機(jī)制，但本研究所觀察到的IL-33與結(jié)核性胸膜炎之間的關(guān)系可以通過(guò)以下假設(shè)來(lái)解釋：IL-33在一定程度上有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，如誘導(dǎo)細(xì)胞因子和應(yīng)答細(xì)胞。越來(lái)越多的基礎(chǔ)研究顯示，IL-33可以通過(guò)增加IFN-γ參與調(diào)解增強(qiáng)Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)[14-16]。研究還發(fā)現(xiàn)，IL-33的表達(dá)由IFN-γ和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）上調(diào)[17-18]。因此，IFN-γ不只是IL-33的上游調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也是IL-33信號(hào)的下游產(chǎn)物[15-16，19]。所以，在結(jié)核性胸膜炎中IL-33和IFN-γ可能形成偶聯(lián)的正反饋回路[15-20]。所以，IL-33可能參與結(jié)核性胸膜炎的發(fā)病和發(fā)展，其水平升高可能為結(jié)核桿菌在胸膜局部刺激的作用，IL-33對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷具有重要應(yīng)用價(jià)值。

ADA是嘌呤核苷代謝的一種重要酶類，主要存在于人體各組織，特別是淋巴細(xì)胞中。結(jié)核性胸膜炎發(fā)病機(jī)制是MTB感染引起機(jī)體產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)，MTB的結(jié)核蛋白進(jìn)入胸膜腔引起胸膜炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞分化增殖，引起ADA含量升高[4]。ADA是最廣泛研究和推薦的生物標(biāo)志物之一，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在診斷TPE方面具有良好的性能。一篇包含63項(xiàng)研究的薈萃分析評(píng)估了胸腔積液中ADA活性在鑒別TPE和非TPE的價(jià)值，證明了其高靈敏度和特異度（分別為92%和90%）[21]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中ADA水平明顯高于非TPE，其診斷結(jié)核性胸膜炎靈敏度為93.0%，特異度為90.9%，與Meta分析研究中ADA特異度（90.0%）相似[21]。

結(jié)核性胸膜炎的主要免疫方式是細(xì)胞免疫，T細(xì)胞在受到MTB抗原刺激后,活化分泌細(xì)胞因子IFN-γ參與免疫應(yīng)答，患者外周血中存在對(duì)應(yīng)的特異T細(xì)胞[22]。T-SPOT.TB檢測(cè)的原理是通過(guò)分離外周血MTB特異性T細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)和抗原再次刺激后分泌IFN-γ,以相應(yīng)抗體檢驗(yàn)IFN-γ濃度來(lái)診斷是否存在MTB感染。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其診斷價(jià)值不受患者性別、年齡、腫瘤、免疫抑制等影響，不僅可用于肺外結(jié)核病的診斷，還可以作為治療效果評(píng)估，具有較高的應(yīng)用價(jià)值[23]。本研究結(jié)果顯示，MTB組的外周血T-SPOT.TB水平明顯高于非MTB組，外周血T-SPOT.TB對(duì)TPE的靈敏度為92.3%，特異度為71.4%。但研究顯示外周血T-SPOT.TB存在自身缺陷，易受外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響[24]，尤其是免疫缺陷的胸腔積液患者[25]，常會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。且外周血 T-SPOT.TB不能鑒別MTB潛伏感染還是活動(dòng)性結(jié)核病，致使診斷活動(dòng)性結(jié)核病的特異度受限制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-33的特異度最高，為100.0%，對(duì)于排除結(jié)核性胸膜炎的意義重大，但靈敏度不高，只有 49.1%。然而，IL-33聯(lián)合 T-SPOT.TB 檢測(cè)診斷特異度為100.0%，靈敏度升高，為76.9%。聯(lián)合IL-33+ADA+T-SPOT.TB檢測(cè)診斷特異度為100.0%，靈敏度為88.5%，提示聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸膜炎具有更高診斷價(jià)值，有利于早發(fā)現(xiàn)、早治療，對(duì)結(jié)核性胸膜炎有重要的輔助診斷價(jià)值。