ATF3表達與宮頸癌臨床病理因素及預后的關系

孫 穎 袁秋月 張維娜 高 媛 陳 龍

1.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)，山東 泰安 271016； 2.青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266011

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最主要的惡性腫瘤之一，在全球女性癌癥發(fā)病率居第二位[1]，嚴重危害女性生命健康。由于宮頸癌預防篩查工作缺乏，確診時常伴淋巴結轉移、脈管浸潤等影響預后的中高危因素[2]，導致宮頸癌患者不良的生存結局。激活轉錄因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是ATF/CREB轉錄因子家族的成員之一,屬于堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，其表達上調受多種因素的影響，包括紫外線輻射、遺傳毒性因子和生長因子[3]。同時，ATF3可以作為調控各種信號傳導通路的靶基因，例如P53信號通路、c- Myc信號通路等[4- 5]。有研究報道，ATF3的高表達與肺癌的組織學分級、淋巴結轉移及總生存率降低存在顯著相關性，表明ATF3表達上調可促進肺癌的遷移和侵襲[6]。本研究回顧性分析2010年1月—2014年6月青島市市立醫(yī)院住院治療的180例宮頸癌患者組織中ATF3表達與臨床病理因素的相關性，并研究ATF3表達對宮頸癌患者5年總生存率及無進展生存率的影響，探討ATF3陽性表達與宮頸癌臨床病理因素及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月—2014年6月在青島市市立醫(yī)院住院治療的病理診斷為宮頸癌且臨床病理資料完整的180例患者，資料主要包括：年齡、病理類型、臨床分期、組織學分級、腫瘤大小、新輔助化療(化療方案為紫杉醇+鉑類)、淋巴結轉移、宮旁浸潤、脈管浸潤，并對180例入組宮頸癌患者進行5年隨訪，分析ATF3表達情況對宮頸癌患者5年總生存率及無進展生存率影響。納入標準：①經病理診斷確診為宮頸癌者；②所有病例按國際婦產科聯(lián)盟(FIGO 2009)分期標準進行分期，具有完整臨床資料的I期～ⅡA期宮頸癌患者，所有宮頸癌患者治療均按照宮頸癌診治指南[7]；③無其他系統(tǒng)嚴重疾病者。排除標準：(1)合并其他部位原發(fā)腫瘤；(2)患有肝炎、肺炎、結腸炎等慢性炎癥；(3)患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風濕性關節(jié)炎等免疫性疾?。?4)臨床資料不全的患者。

1.2 研究方法

收集2010年1月—2014年6月在青島市市立醫(yī)院住院治療的宮頸癌患者臨床病理資料，將收集的宮頸癌患者存檔的手術切除標本包埋蠟塊切片，采用免疫組化法，檢測宮頸癌中ATF3蛋白表達情況。鼠抗人ATF- 3單克隆抗體購自美國Abcam公司,工作液有效配比濃度為1∶400；DAB顯色劑及二抗選自福州邁新生物公司。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，以ATF- 3陽性的小鼠心肌細胞細胞核作為陽性對照。

1.3 結果評定

ATF3免疫組化染色陽性信號為黃色或棕黃色。觀察5個以上高倍視野(×400倍)計數(shù)≥1 000個細胞陽性細胞數(shù)，綜合染色強度和染色范圍進行判定。按著色強度計分：未著色或淡染者為1分，中強染色為2分，強染色為3分；染色范圍按陽性細胞數(shù)所占百分數(shù)計分：≤10%為1分，>10%～25%為2分，>25%～50%為3分，>50%～75%為4分，>75%為5分。兩項得分結果相加：≤3為陰性(-)，≥4為陽性(+)[8]。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS24.0軟件統(tǒng)計分析,計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(Fisher精確概率法)；采用Kaplan- Meier法繪制生存曲線并分析ATF3表達對宮頸癌患者5年總生存率及無進展生存率的影響；P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ATF3在宮頸癌組織中的表達及與其臨床病理因素的關系

ATF3蛋白在宮頸癌細胞胞漿及組織間質中表達，且ATF3在宮頸癌周圍組織的脈管內皮細胞表達顯著(如圖1，箭頭所示處)，在宮頸癌細胞核中未見ATF3蛋白的陽性表達。在180例宮頸癌患者中，60例患者ATF3表達陽性，120例患者ATF3表達陰性。同時，研究結果顯示，ATF3表達與臨床分期(P=0.011)、淋巴結轉移(P=0.003)、脈管浸潤(P=0.015)、新輔助化療(P=0.026)臨床病理因素分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而與年齡(P=0.396)、病理類型(P=0.076)、組織學分級(P=0.102)、腫瘤直徑大小(P=0.182)、宮旁浸潤(P=0.075)無顯著關系。見表1。

圖1 宮頸癌患者ATF3在脈管的陽性表達(IHC×200)

表1 ATF3表達與宮頸癌臨床病理因素的關系

2.2 ATF3表達與宮頸癌患者5年總生存率及無進展生存率的關系

180例宮頸癌患者5年跟蹤隨訪結果顯示，相比ATF3陰性表達的患者，ATF3陽性表達患者的5年生存率及無進展生存率更低。ATF3陽性表達患者5年總生存率是80.7%，ATF3陰性表達患者5年總生存率是90.4%，ATF3表達陽性的患者5年總生存率較ATF3表達陰性的患者低9.7%，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.074)；ATF3陽性表達患者5年無進展生存率是78.7%，ATF3陰性表達患者5年無進展生存率是89.4%，ATF3表達陽性患者5年無進展生存率較ATF3表達陰性患者低10.7%，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.058)，見圖2、圖3。

圖2 ATF3表達對總生存率影響

圖3 ATF3表達對無進展生存率影響

3 討 論

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，最新報道顯示，我國宮頸癌發(fā)病率每年遞增4.1%，死亡率每年遞增5.9%[9]，嚴重威脅婦女健康。在我國，宮頸癌預防及篩查工作尚未普及，確診宮頸癌時常期別較晚且伴淋巴結轉移等危險因素[2]，嚴重影響宮頸癌患者的生存預后。ATF3是ATF/CREB轉錄因子的家族成員之一，可以直接或間接地改變多種基因表達，這些基因與炎癥反應調節(jié)有關，炎癥反應是癌癥侵襲和轉移的重要機制，并且ATF3表達還與細胞穩(wěn)態(tài)的維持、細胞損傷修復及粘附等有關[10- 11]。本研究結果顯示，在宮頸癌患者中，ATF3主要在宮頸癌細胞胞漿及正常的組織間質中表達，這與本研究小鼠心肌細胞陽性對照組不一致，在宮頸癌患者的組織中，ATF3蛋白存在異位表達，即ATF3異位表達于宮頸癌細胞胞漿及組織間質中，進而有利于腫瘤細胞的浸潤、轉移。并且，研究發(fā)現(xiàn)，ATF3在宮頸組織中脈管內皮細胞上表達顯著(如圖1)，ATF3在脈管內皮細胞上的異位表達可能與宮頸癌的脈管浸潤有關。

有研究顯示，在肺癌、乳腺癌中，ATF3表達與組織學分級、淋巴結轉移及臨床分期有關，從而表明ATF3表達與乳腺癌、肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移有關[6,12]。本研究結果顯示，ATF3表達陽性與淋巴結轉移、脈管浸潤、臨床分期有關(P<0.05)。淋巴結轉移是宮頸癌主要的轉移途徑，ATF3可能通過某些機制促使癌細胞進入癌組織周圍淋巴管內，在淋巴管內形成瘤栓，隨淋巴液到達局部淋巴結，從而導致宮頸癌細胞的脈管浸潤及淋巴結轉移；宮頸癌臨床分期越晚，侵及范圍越大，腫瘤負荷增加，ATF3異位表達量相應增多。因此，我們推測ATF3表達可能與宮頸癌的轉移、浸潤有關，可能是評價宮頸癌轉移浸潤程度的重要指標。

因此，ATF3作為一種適應反應基因,在宮頸癌、乳腺癌及肺癌的侵襲轉移方面發(fā)揮重要作用。除此之外，最近研究表明，ATF3也可根據(jù)腫瘤類型及環(huán)境的不同發(fā)揮抑制癌癥發(fā)展的作用，例如，ATF3可能作為抑癌基因，在抑制食管癌、胃癌、肝癌、結腸癌及前列腺癌的形成、浸潤及轉移等方面發(fā)揮一定的作用[13- 18]。例如，有研究表明，ATF3表達與人結腸癌細胞中的細胞凋亡有關，柚皮素(naringenin，NAR)作為一種葡萄柚中黃酮類化合物，具有抗癌活性，柚皮素能刺激人結腸癌細胞ATF3表達上調，從而誘導人結腸癌細胞凋亡，抑制結腸癌的形成及發(fā)展[18]。然而，在其他腫瘤類型中，ATF3促進或抑制腫瘤發(fā)生、增殖及轉移的具體分子生物學機制尚不明確。

紫杉醇是一種廣譜、高效的抗腫瘤的化學治療藥物，具有穩(wěn)定細胞骨架、阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡的作用，在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用[19]。然而，Tsonwin等人[10]研究結果顯示，紫杉醇通過ATF3介導能促進血管生長，改變癌細胞轉移微環(huán)境，可能與小鼠的乳腺癌肺轉移有關，此研究結果與紫杉醇的抗腫瘤作用的觀念相悖。血管內皮生長因子可調節(jié)血管生成、增加血管通透性，促進內皮細胞增殖，抑制細胞凋亡，并且，血管內皮生長因子可以與相對應的血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)高親和力特異性的結合，在癌癥轉移、浸潤方面發(fā)揮重要作用。例如，VEGF與其相應的VEGFR- 3結合，可調節(jié)腫瘤淋巴管形成[20]；VEGF通過與VEGFR- 2結合，可調節(jié)腫瘤新生血管形成[21]。紫杉醇可能通過某些機制介導ATF3表達上調，并使血管內皮生長因子合成、分泌增加，其與相應的血管內皮生長因子受體高親和力結合，從而促進小鼠乳腺癌的浸潤、轉移。

現(xiàn)如今，為了提升宮頸癌手術切除癌灶滿意度及增加局部晚期患者手術機會，以紫杉醇聯(lián)合鉑類新輔助化療方案開始廣泛應用于宮頸癌治療。Symonds等人[22]研究表明，在復發(fā)性或轉移性宮頸癌中，以紫杉醇為基礎聯(lián)合化療中加入血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抑制劑可延長患者總生存期及無進展生存期。本研究結果表明，ATF3陽性表達與新輔助化療有關(P<0.05)。因此，本研究結果提示新輔助化療方案中的紫杉醇可能通過某些機制上調ATF3表達，從而進一步介導血管內皮生長因子合成、分泌增加，其分別與相應VEGFR結合，促使宮頸癌組織中新生脈管形成，從而促進宮頸癌的轉移、浸潤。

對入組的宮頸癌患者進行隨訪，研究結果顯示，相比ATF3陰性表達的宮頸癌患者，ATF3陽性表達的患者5年生存率及無進展生存率更低(ATF3表達陽性的宮頸癌患者5年總生存率較ATF3表達陰性患者低9.7%，ATF3表達陽性的宮頸癌患者5年無進展生存率較ATF3表達陰性低10.7%)。在肺癌中，Li等人[6]研究結果證明，ATF3高表達與肺癌的總生存率降低有關。ATF3異位表達可能與宮頸癌浸潤、轉移有關，從而降低了宮頸癌患者的5年總生存率和無進展生存率。本研究表明，ATF3陽性表達與新輔助化療有關，新輔助化療方案中的紫杉醇可能介導ATF3陽性表達上調，從而促進宮頸癌的浸潤、轉移，降低宮頸癌患者的5年總生存率及無進展生存率；ATF3陽性表達患者中淋巴結轉移、脈管浸潤的患者偏多，且期別較晚，降低了ATF3陽性組宮頸癌患者的5年總生存率及無進展生存率。因此，我們考慮ATF3陽性表達可能與宮頸癌患者不良預后有關，可在一定程度上預測宮頸癌患者的預后。由于本研究所納入的宮頸癌患者例數(shù)有限，ATF3表達對宮頸癌患者5年總生存率及無進展生存率是否有影響(P<0.05)，仍需要擴大樣本量進一步研究。

總之，我們的研究表明，ATF3陽性表達在宮頸癌細胞胞漿及組織間質中，可能與ATF3的異位表達有關。同時，ATF3表達與宮頸癌的臨床分期、淋巴結轉移、脈管浸潤、新輔助化療有關，提示ATF3表達可能促進宮頸癌的浸潤轉移，且新輔助化療方案中的紫杉醇可能促進ATF3表達上調，從而進一步促進宮頸癌的脈管浸潤轉移。并且，研究發(fā)現(xiàn)，與ATF3陰性表達的宮頸癌患者相比，ATF3陽性表達的患者5年生存率及無進展生存率更低，雖然差異并無統(tǒng)計學意義，但在一定程度上提示ATF3表達與宮頸癌的預后有關，可能作為評估宮頸癌患者預后的指標，后續(xù)仍需進一步擴大樣本驗證。

由此，我們認為，ATF3表達可能是推測宮頸癌浸潤轉移程度以及評價宮頸癌預后的重要指標。然而，在宮頸癌浸潤轉移中，紫杉醇通過哪些機制上調ATF3表達，VEGF是否參與該過程或在其中的作用機制等問題目前尚未明確，需要大樣本量前瞻性隨機對照研究予以證實。