金銀花總黃酮對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化的影響及機(jī)制

徐曉燕 苗 芳 王曉丹 高永峰 張志遠(yuǎn) 蘇設(shè)鎮(zhèn)

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

金銀花為忍冬科植物忍冬(LoniceraejaponicaerFlos)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，為臨床常用中藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效[1]。現(xiàn)代藥理研究證明，金銀花及活性成分具有優(yōu)良的抗氧化、自由基清除、抗炎及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等作用[2- 4]，但是有關(guān)金銀花黃酮抗肝纖維化的作用鮮有報(bào)道。因此本研究通過(guò)四氯化碳(CCl4)復(fù)制大鼠肝纖維化模型，研究金銀花總黃酮對(duì)大鼠肝纖維化的生化指標(biāo)及形態(tài)學(xué)的影響，并通過(guò)體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞(HSC)，觀察金銀花總黃酮對(duì)HSC增殖、凋亡的影響，評(píng)價(jià)金銀花總黃酮對(duì)肝纖維化的作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

健康清潔級(jí)SD大鼠(200±20)g，購(gòu)于魯抗動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證:2008A010)；HSC細(xì)胞(細(xì)胞株)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院；金銀花中藥飲片，購(gòu)自泰安金泰聯(lián)醫(yī)藥商行；SOD、GSH- Px、MDA、Hyp測(cè)定試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自sigma公司；細(xì)胞凋亡測(cè)試試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)；BP211D型分析天平(美國(guó)Sar- torius公司)；酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司，M200pro)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1金銀花總黃酮的提取、純化及含量測(cè)定 中藥飲片金銀花使用70%乙醇回流提取3次，得金銀花總黃酮粗品。粗品選用AB- 8大孔吸附樹(shù)脂70%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥得金銀花總黃酮。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得所提取樣品中金銀花總黃酮的含量為71.28%，備用。

1.2.2動(dòng)物分組給藥及肝纖維化模型的制備 大鼠48只，隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組及金銀花總黃酮低、高劑量組；其中金銀花總黃酮低、高劑量組分別灌胃金銀花總黃酮100 mg/kg、200 mg/kg，對(duì)照組及模型組灌胃等容量生理鹽水，連續(xù)6周。給藥期間，除對(duì)照組外其他各組大鼠皮下注射40%CCl4油溶液1 mL/kg，每周2次，連續(xù)注射6周，同時(shí)給以10%乙醇代水飲，復(fù)制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型；對(duì)照組注射等容量大豆油。末次給藥 24 h后心臟取血，收集血清檢測(cè)血清ALT活性和Hyp含量，處死大鼠取肝臟檢測(cè)肝臟MDA含量和SOD、GSH- Px活性，并進(jìn)行肝臟組織切片，H- E染色觀察病理改變。

1.2.3HSC細(xì)胞增殖試驗(yàn) 培養(yǎng)HSC細(xì)胞，以MTT比色法檢測(cè)HSC的增殖。培養(yǎng)的HSC以含小牛血清的DMEM制備為5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，對(duì)含細(xì)胞的孔進(jìn)行分組，每個(gè)劑量組5個(gè)復(fù)孔，分組情況如下：(1)對(duì)照組，HSC細(xì)胞繼續(xù)用100 μL DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；(2)藥物處理組，棄去原有的培養(yǎng)基后用100 μL相應(yīng)濃度200、100、50、25 μg/mL的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分組處理后培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，微型振蕩器振蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。

1.2.4HSC細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 培養(yǎng)HSC細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞以1.5×106/孔的接種量接種于6孔培養(yǎng)板上。藥物分組處理后，加入不含EDTA的胰酶消化，培養(yǎng)液終止消化，PBS沖洗2次，收集于流式管中，離心5 min(1 000 r/min)，棄去上清液，每管加入PBS將細(xì)胞混懸后離心5 min(1 000 r/min)，棄上清，每管加入300 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL的 AnnexinV- FITC混勻放置10 min，加入5 μL的Propidium Iodide，混勻上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 金銀花總黃酮對(duì)肝纖維化大鼠血清ALT、Hyp含量的影響

模型組大鼠血清ALT、Hyp顯著升高，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而金銀花總黃酮低、高劑量組血清ALT、Hyp與模型組相比顯著減少，并且具有一定的量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 金銀花總黃酮對(duì)大鼠血清ALT、Hyp的影響各組n=7)

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.01；與模型組比較，★P<0.05。

2.2 金銀花總黃酮對(duì)肝纖維化大鼠肝組織MDA、SOD和GSH- Px的影響

與對(duì)照組比較，模型組肝組織中MDA含量增高，SOD和GSH- Px活性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，金銀花總黃酮低、高劑量組的MDA含量下降，GSH- Px、SOD活性提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體見(jiàn)表2。

2.3 金銀花總黃酮對(duì)肝纖維化大鼠肝臟形態(tài)學(xué)的影響

HE染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠肝臟組織的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周排列整齊；模型組匯管區(qū)炎性細(xì)胞、壞死細(xì)胞增多，細(xì)胞索排列紊亂，纖維間隔增厚；金銀花總黃酮低、高劑量組肝纖維化程度明顯減輕，對(duì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維的增生以及假小葉的形成等均有明顯的改善。具體見(jiàn)圖1。

表2 金銀花總黃酮對(duì)大鼠肝臟MDA、SOD、GSH- px含量的影響各組n=7)

注：與對(duì)照組相比，▲P<0.01；與模型組相比，★P<0.05。

A.金銀花總黃酮低劑量組；B.金銀花總黃酮高劑量組；C.對(duì)照組；D.模型組。

2.4 金銀花總黃酮對(duì)HSC增殖的影響

與對(duì)照組比較，藥物處理組均能不同程度抑制HSC的增殖，呈明顯劑量- 效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表3。

表3 金銀花總黃酮對(duì)HSC增殖的影響

注：與對(duì)照組比較，**P<0.001，*P<0.05。

2.5 金銀花總黃酮對(duì)HSC細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，藥物處理組與對(duì)照組比較，其中早期凋亡率與晚期凋亡率均高于對(duì)照組，并具有明顯劑量依賴性，顯示金銀花總黃酮可明顯促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3 討 論

研究表明，肝臟在CCl4刺激下產(chǎn)生大量活性氧自由基，使自由基代謝失去平衡，過(guò)多的活性氧自由基會(huì)攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，引起血漿ALT活性的增高。因此，ALT的活性是肝細(xì)胞損壞的重要指標(biāo)[5- 6]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，模型組大鼠血清中的ALT活性明顯升高，說(shuō)明CCl4已經(jīng)造成了肝臟細(xì)胞損傷；金銀花總黃酮的高、低劑量組的大鼠血清中的ALT活性與模型組的相比顯著降低，說(shuō)明金銀花總黃酮的高、低劑量組對(duì)由CCl4所引起的大鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用。長(zhǎng)期的肝細(xì)胞損傷、變性、壞死致內(nèi)皮細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子增加，細(xì)胞因子進(jìn)一步激活靜息狀態(tài)的星狀細(xì)胞，使之轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，其過(guò)度增殖，同時(shí)大量合成各種細(xì)胞外基質(zhì)，過(guò)度沉積從而導(dǎo)致肝纖維化形成。Hyp是構(gòu)成機(jī)體內(nèi)膠原蛋白的特有成分，臨床上血和尿中Hyp 的檢測(cè)已成為衡量機(jī)體膠原組織代謝的重要指標(biāo)，它能間接反映組織中膠原代謝狀況。肝纖維化時(shí)由于肝實(shí)質(zhì)內(nèi)膠原纖維組織明顯增多,可導(dǎo)致血和肝組織Hyp 含量升高,因此直接檢測(cè)Hyp 含量可反映肝纖維化的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠血清中的Hyp明顯升高，說(shuō)明CCl4連續(xù)皮下注射可以誘導(dǎo)肝纖維化形成；而金銀花總黃酮的高、低劑量組的大鼠血清中的Hyp與模型組的相比顯著降低，說(shuō)明金銀花總黃酮的高、低劑量組對(duì)由CCl4所誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有一定的干預(yù)作用。

A.對(duì)照組未染色；B.對(duì)照組；C.金銀花總黃酮200μg/mL；D.金銀花總黃酮100μg/mL;E.金銀花總黃酮50μg/mL;F.金銀花總黃酮25μg/mL。

肝損傷時(shí)由于肝臟組織抗氧化能力降低，自由基積累，產(chǎn)生過(guò)多的脂質(zhì)過(guò)氧化物，MDA的含量不僅能表示肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)弱，而且可以間接的體現(xiàn)自由基對(duì)肝細(xì)胞的損害程度[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠肝組織中MDA的含量明顯增加，而金銀花總黃酮組肝組織中MDA水平明顯下降，說(shuō)明金銀花總黃酮能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而保護(hù)肝臟組織免受損傷。肝組織中SOD能阻止其破壞肝細(xì)胞，GSH- Px能特異地催化還原性GSH對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟SOD、GSH- Px活性明顯降低，而金銀花總黃酮組SOD、GSH- Px活性明顯升高，表明金銀花總黃酮有明顯對(duì)抗肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、保護(hù)抗氧化活性的作用。病理學(xué)檢查是判斷肝纖維化程度，評(píng)價(jià)抗肝纖維化藥物療效的可靠標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，病理組織學(xué)HE染色發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，肝纖維化程度極重， 而金銀花總黃酮組可明顯改善大鼠肝纖維化程度，并且呈劑量相關(guān)關(guān)系，表明金銀花總黃酮具有明顯減輕肝損傷，減少纖維條索生成的作用，對(duì)肝纖維化的形成具有一定的干預(yù)作用。

肝纖維化是指肝臟內(nèi)纖維性結(jié)締組織的大量異常增生,是一種“創(chuàng)傷愈合”的慢性漸進(jìn)的病理過(guò)程[6]。多種因素誘發(fā)肝細(xì)胞損傷,導(dǎo)致肝Kupffer細(xì)胞、肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、肝成纖維細(xì)胞等其他類型肝細(xì)胞以及遷移的炎性細(xì)胞活化并釋放大量的細(xì)胞因子和可溶因子,與此同時(shí)這些因子導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(HSC)活化、分化與增殖,合成大量ECM,并逐漸沉積從而引起肝纖維化[7- 10]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)金銀花總黃酮能抑制HSC的增殖，促進(jìn)HSC凋亡，并呈劑量依賴性，體外實(shí)驗(yàn)同樣提示金銀花總黃酮具有抑制肝纖維化形成的作用。