蜂膠抗光老化功效

黃鶯鶯, 張翠平, 張言政, 胡福良

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

皮膚暴露在紫外線照射下時，細(xì)胞內(nèi)會生成過量的活性氧(ROS)[1]，引起衰老相關(guān)基因表達(dá)[2]，誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)并降低彈力蛋白和膠原蛋白的表達(dá)量[3]，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)松弛、皺紋等老化現(xiàn)象[4-6].皮膚抗光老化過程中基因的表達(dá)實(shí)際上是保護(hù)基因與損傷基因的共同表達(dá).保護(hù)基因主要包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族蛋白的抑制基因以及細(xì)胞凋亡的抑制基因[7,8]，而損傷基因主要包括膠原蛋白降解相關(guān)基因和彈性蛋白降解相關(guān)基因.基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)是降解Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白最重要的酶[9]，當(dāng)皮膚細(xì)胞過量表達(dá)MMP-1時，真皮層細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞[10]，尤其是膠原纖維和彈力纖維的正常結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重影響[11]，因此MMP-1是導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)皺紋、細(xì)紋等衰老癥狀最主要的酶[12].MMP-1釋放量是評價光老化的主要指標(biāo).ROS含量的增多會加速細(xì)胞凋亡甚至死亡的速率[13].皮膚在光老化過程中，UV的照射可以導(dǎo)致皮膚細(xì)胞內(nèi)生成過量ROS，進(jìn)而引起皮膚組織多種生物學(xué)效應(yīng)[14]，如：MMP-1的過量表達(dá)[15]，細(xì)胞凋亡，抗氧化酶表達(dá)的降低等[16].因此，ROS含量也是評價光老化程度的重要指標(biāo).

蜂膠又被稱為紫色黃金，含有豐富的黃酮類物質(zhì)，黃酮類物質(zhì)是有效的抗氧化劑，能夠清除自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷[17]，蜂膠黃酮可以防止腦組織自由基過氧化而造成損傷[18].蜂膠中含有的咖啡酸苯乙酯也具有很強(qiáng)的抗氧化活性[19].蜂膠的抗氧化機(jī)制主要是通過直接或間接調(diào)節(jié)機(jī)體ROS的途徑以調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化—還原平衡，并通過其他方式調(diào)節(jié)各種酶的活性和含量[20].迄今為止，蜂膠已被證實(shí)具有抗氧化、清除自由基及免疫調(diào)節(jié)等多種作用，但對其延緩皮膚光老化的研究報道尚不多見.本研究基于UVA輻照成纖維細(xì)胞的氧化損傷模型，通過分析蜂膠對ROS清除率、氧化相關(guān)基因MMP-1表達(dá)情況以及MMP-1含量等作用來評價蜂膠的延緩皮膚衰老功效，為蜂膠在皮膚光老化方面的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠浸膏由楊屬型蜂膠(產(chǎn)地為河南)經(jīng)無水乙醇提取干燥制得，深褐色固體，具有特殊芳香味，于-20 ℃冷凍儲存.

成纖維細(xì)胞，由廣東博溪生物科技有限公司通過細(xì)胞原代、傳代培養(yǎng)獲得；低糖DMEM培養(yǎng)液(Gibco)、PBS(博士德)、MTT(Sigma)、DMSO(Sigma)、新生牛血清(四季青)、引物(TaKaRa)、RNA提取試劑盒(TaKaRa)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、熒光染料(TaKaRa)、ROS檢測試劑(Invitrogen)、ELISA 試劑盒(Abcam).

蜂膠乙醇樣品：蜂膠濃度為5%，用75%乙醇溶解蜂膠浸膏制得，棕黑色液體，室溫保存；蜂膠聚乙二醇樣品：蜂膠濃度為5%，用75%聚乙二醇溶解蜂膠制得，棕黑色液體，室溫保存.

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平(Denver TB-215D)、Milli-Q Intergral 純水/超純水一體化系統(tǒng)(Merk Millipore)、高效液相色譜儀(安捷倫1200)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、超凈工作臺(蘇凈安泰)、倒置顯微鏡(Olympus)、微量振蕩器(其林貝爾)、酶標(biāo)儀(BioTek)、PCR儀(伯樂)、熒光定量PCR儀(伯樂)、恒溫箱(泰斯特)、流式細(xì)胞儀(BECKMAN).

1.3 蜂膠化學(xué)成分分析

將蜂膠浸膏配置成5 mg·mL-1的乙醇溶液，濾膜除雜后放入高效液相色譜儀中分析檢測，條件如下：

色譜柱：Sepax HP-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-1%乙酸；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：36 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；

梯度洗脫程序?yàn)椋?～25 min，20%～40%甲醇；25～55 min，40%～55%甲醇；55～70 min，55%甲醇；70～85 min，55%～100%甲醇.

1.4 基于人成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測

該試驗(yàn)共2個樣品，設(shè)定8個濃度梯度，每個濃度下設(shè)置3個重復(fù)孔，同時，試驗(yàn)設(shè)置溶劑對照孔、調(diào)零孔(含10%新生牛血清低糖DMEM培養(yǎng)液)、陽性對照孔(8% DMSO).本試驗(yàn)通過MTT法檢測細(xì)胞活力，篩選細(xì)胞給藥的最大安全濃度.具體操作步驟如下：

制備細(xì)胞懸液，將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后接種到96孔板.兩種蜂膠液樣品分別配置不同濃度(0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.08%、0.16%、0.31%、0.63%)的受試物.待細(xì)胞鋪板率達(dá)到40%～60%時進(jìn)行給藥.給藥完成后將平板放置在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞孵育培養(yǎng)24 h，棄掉上清，加入MTT工作液，37 ℃避光孵育.4 h后棄去上清液，向各孔中加入150 μL二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀讀取D490 nm值.

1.5 基于人成纖維細(xì)胞的抗光老化功效檢測

抗老化效果測試是基于UVA輻照成纖維細(xì)胞的氧化損傷模型，通過分析ROS抑制率、氧化相關(guān)基因MMP-1表達(dá)情況以及MMP-1含量來評價待測活性物的功效，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1.

1.5.1 ROS抑制率檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化后接種至6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.根據(jù)表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)，配置不同濃度的受試物.待6孔板中細(xì)胞鋪板率達(dá)到約40%時，進(jìn)行分組給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔.37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)24 h.根據(jù)試驗(yàn)分組，空白對照組直接進(jìn)行ROS活性檢測；其余組采用劑量為10 J·cm-2的UVA進(jìn)行輻照.輻照結(jié)束后，直接進(jìn)行ROS活性檢測.PBS清洗細(xì)胞后，每孔加入1 mL濃度為25 μmol·L-1DCFH-DA探針，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育45 min；棄掉含DCFH-DA的培養(yǎng)液，用PBS清洗多次，胰酶消化細(xì)胞后，PBS清洗細(xì)胞1次，加入一定量新鮮PBS，流式檢測.匯總各組DCFH-DA Intensity(平均熒光強(qiáng)度)，用T-Test方法對進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

表1 抗光老化功效試驗(yàn)設(shè)計(jì)1)Table 1 Experimental design of anti-photoaging test

1)PC(VE)作為ROS檢測時陽性對照.

1.5.2MMP-1基因表達(dá)檢測 基于細(xì)胞毒性檢測的結(jié)果，選擇安全濃度進(jìn)行MMP-1基因表達(dá)檢測.待給藥24 h后收集細(xì)胞，通過qRT-PCR檢測樣品對細(xì)胞內(nèi)MMP-1基因表達(dá)的影響.具體操作步驟如下：

表2 MMP-1基因表達(dá)檢測引物序列及內(nèi)參基因序列Table 2 Primers for MMP-1 expression and GAPDH genes sequences

取對數(shù)生長期細(xì)胞消化后接種至6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.按試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)配置不同濃度的受試物.培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液用于下一步ELISA檢測.用PBS輕柔清洗細(xì)胞3次，使用RNA isoPlus裂解細(xì)胞，每孔加入1 mL裂解液.室溫放置5 min，使其充分裂解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL RNase-free Eppendorf管中，提取RNA，合成cDNA，進(jìn)行Elastin基因表達(dá)檢測.采用2-△△Ct計(jì)算方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用T-Test方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.將空白對照組mRNA擴(kuò)增倍數(shù)歸一處理，樣品組與空白對照組相比，顯著性以*表示，P<0.05表示差異顯著，標(biāo)注為*，P<0.01表示差異極顯著，標(biāo)注為**.

1.5.3 MMP-1含量檢測 收集1.4.2中細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5 mL EP管中，用于MMP-1 ELISA檢測.收集的培養(yǎng)液1 000 g離心后吸取上清-20 ℃保存，進(jìn)行MMP-1蛋白ELISA檢測.標(biāo)準(zhǔn)品每組設(shè)計(jì)2個平行孔，樣品每組設(shè)計(jì)3個平行孔.

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂膠浸膏的HPLC分析

蜂膠浸膏的高效液相色譜測定結(jié)果見圖1.本試驗(yàn)所用蜂膠浸膏中峰高最高的5種黃酮單體為短葉松素、松屬素、短葉松素-3-乙酸酯、白楊素和高良姜素.在蜂膠浸膏中的含量分別為短葉松素3.57%、松屬素4.61%、短葉松素-3-乙酸酯7.62%、白楊素5.16%、高良姜素2.07%.

2.2 細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

2.2.1 MTT檢測結(jié)果 樣品由高到低設(shè)定8個給藥濃度，在人成纖維細(xì)胞上開展細(xì)胞毒性檢測試驗(yàn)，細(xì)胞毒性檢測結(jié)果及細(xì)胞活力變化趨勢見圖2.

以樣品所選8個濃度為橫坐標(biāo)，人成纖維細(xì)胞相對活力值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞相對活力曲線.選取細(xì)胞相對活力值大于90%的轉(zhuǎn)折點(diǎn)濃度作為最大安全給藥濃度.根據(jù)MTT試驗(yàn)結(jié)果可以看出：與溶劑對照相比，當(dāng)蜂膠乙醇溶液樣品濃度為0.08%時，細(xì)胞相對活力值為128.27%，無細(xì)胞毒性；當(dāng)蜂膠聚乙二醇溶液樣品濃度為0.08%時，細(xì)胞相對活力值為126.16%，無細(xì)胞毒性.

2.2.2 形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果 基于MTT試驗(yàn)結(jié)果，選擇5個濃度進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測，檢測結(jié)果見圖3和圖4.

根據(jù)形態(tài)學(xué)結(jié)果可以看出：蜂膠乙醇溶液和蜂膠聚乙二醇溶液樣品濃度為0.08%時，細(xì)胞邊緣輪廓清晰，形態(tài)規(guī)則，胞內(nèi)無明顯顆粒物，與溶劑對照組細(xì)胞狀態(tài)無明顯差異.故根據(jù)MTT結(jié)果和形態(tài)學(xué)結(jié)果，最終確定蜂膠乙醇溶液和蜂膠聚乙二醇溶液樣品基于人成纖維細(xì)胞的最大安全給藥濃度不超過0.08%.

2.3 抗光老化功效檢測結(jié)果

2.3.1 ROS抑制率檢測結(jié)果 基于UVA刺激人成纖維細(xì)胞的氧化損傷模型，通過檢測ROS含量的變化來判定待測活性物的抗氧化功效，ROS檢測結(jié)果和ROS抑制率分析見圖5.

試驗(yàn)結(jié)果顯示，與未輻照BC組相比，UVA輻照后ROS含量極顯著增加(P<0.01)，表明氧化損傷模型造模成功；與UVA輻照組相比，PC組VE極顯著降低了ROS含量(P<0.01)，蜂膠乙醇溶液樣品在0.08%的給藥濃度時，ROS含量極顯著降低(P<0.01)，ROS抑制率13.39%。蜂膠聚乙二醇溶液樣品在0.08%的給藥濃度時，ROS含量顯著降低(P<0.05)，其抑制率為11%，說明樣品具有清除ROS而達(dá)到抗氧化的作用.

2.3.2MMP-1基因表達(dá)及MMP-1含量檢測結(jié)果 對樣品作用24 h后的人成纖維細(xì)胞進(jìn)行UVA輻照(10 J·cm-2)，輻照后孵育24 h，用RNAiso Plus處理后收樣，開展RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR操作，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心收集上清進(jìn)行ELISA檢測.MMP-1基因表達(dá)檢測結(jié)果及MMP-1含量檢測結(jié)果如圖6所示.

與空白對照BC組相比，陰性對照NC組經(jīng)UVA輻照后，MMP-1表達(dá)量和MMP-1含量極顯著上升(P<0.01)，表明UVA造模成功；與陰性對照NC(UVA輻照)相比，2個樣品組的MMP-1表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，對MMP-1基因水平表達(dá)有抑制作用；2個樣品組MMP-1含量均極顯著下調(diào)(P<0.01)，其中蜂膠乙醇溶液處理組MMP-1含量低于未輻照的BC組.以上結(jié)果表明，蜂膠乙醇與蜂膠聚乙二醇樣品均在0.08%的濃度下能夠抑制MMP-1的合成，因此2個樣品可以通過抑制MMP-1的表達(dá)而達(dá)到抑制胞外基質(zhì)ECM的降解，從而起到一定的抗光老化功效.

3 討論

與陰性對照NC(UVA+)組相比，蜂膠乙醇溶液和蜂膠聚乙二醇溶液均在0.08%給藥濃度下，對ROS含量有極顯著的下調(diào)作用；并且能顯著下調(diào)人成纖維細(xì)胞中氧化相關(guān)的MMP-1基因表達(dá)量；對MMP-1含量有極顯著下調(diào)作用.結(jié)果表明，蜂膠乙醇溶液和蜂膠聚乙二醇溶液一方面通過清除活性氧ROS防止自由基誘導(dǎo)的皮膚老化的產(chǎn)生，另一方面對MMP-1在基因水平和蛋白水平都具有顯著性的抑制作用，進(jìn)而通過抑制膠原等胞外基質(zhì)的降解而達(dá)到抗光老化的效果.與75%聚乙二醇作為溶劑相比，以75%乙醇作為溶劑溶解蜂膠對ROS抑制率更高、氧化相關(guān)基因MMP-1 mRNA的表達(dá)量更少、MMP-1含量更低；可以推測蜂膠乙醇溶液比蜂膠聚乙二醇溶液具有更高的抗光老化活性.

目前，預(yù)防和延緩皮膚衰老已成為醫(yī)學(xué)、化妝品和生物材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一.皮膚的衰老可以分為內(nèi)在因素引起的內(nèi)源性衰老和繼發(fā)于外在因素導(dǎo)致的外源性衰老，其中紫外線輻射是最主要的因素[21].安全、有效的防治光老化產(chǎn)品開發(fā)是相關(guān)產(chǎn)業(yè)研究的重要方向.本研究有望為醫(yī)藥、化妝品行業(yè)開發(fā)改善皮膚光老化產(chǎn)品提供新思路，促進(jìn)蜂產(chǎn)品行業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展.但是目前的研究依然存一些不足.首先，對蜂膠活性成分黃酮類物質(zhì)、酚酸類及萜烯類物質(zhì)等抗光老化的研究較少.其次，現(xiàn)階段對凋亡相關(guān)基因和衰老相關(guān)指標(biāo)，如細(xì)胞周期、線粒體融合蛋白、氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)等研究尚有不足.蜂膠對機(jī)體的保護(hù)作用機(jī)制復(fù)雜，對整個機(jī)體起到協(xié)調(diào)作用，而不是簡單的對某種物質(zhì)或信號通路的抑制或促進(jìn)作用.蜂膠能否應(yīng)用于抗光老化的預(yù)防和治療仍需大量深入的研究.