橄欖苦苷對染砷小鼠大腦神經(jīng)免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響*

王 昱

(隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 成縣 742500)

0 引 言

我國飲水型砷中毒分布廣、影響人群多，是環(huán)境砷中毒的主要類型[1]．砷通過食物鏈或飲用水進(jìn)入人體，容易蓄積，潛伏期長，危害大．研究顯示，慢性飲水型高砷暴露使動物的空間學(xué)習(xí)、記憶能力下降[2]，損傷神經(jīng)元或增加神經(jīng)系統(tǒng)損傷易感性[3]，誘導(dǎo)凋亡人膠質(zhì)瘤細(xì)胞[4]，干擾動物大腦組織白細(xì)胞介素(IL，interleukin)家族部分基因和下丘腦-垂體-腎上腺軸受體相關(guān)基因的表達(dá)[5]，抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫、體液免疫、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞系統(tǒng)整體功能[6-7]．橄欖苦苷(OP，oleuropein)屬于天然的多酚化合物，是油橄欖中最主要的含量最多的活性成分[8]．本課題組前期已經(jīng)研究了OP在降血糖、抗衰老及降血脂等方面的藥理作用[9-11]．為了進(jìn)一步研究OP的藥理作用，本研究在三氧化二砷(As2O3)染毒小鼠的基礎(chǔ)上給予OP干預(yù)，觀察大腦組織部分神經(jīng)免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化，探討其拮抗神經(jīng)毒性的保護(hù)作用．

1 材料與方法

1.1 動物模型建立與給藥

健康昆明小鼠30只(購于蘭州大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證編號：14-006，體質(zhì)量 18～20 g，雌雄各半)，同條件飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組(每組10只)：As2O3組、As2O3+OP組和對照組．As2O3組每天灌胃4 mg/kg劑量的As2O3溶液[12]；OP組灌胃4 mg/kg劑量的As2O3溶液，同時灌胃100 mg/kg的OP[10](隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司提供)；對照組每天灌胃等量的0.9% 生理鹽水．3組實驗連續(xù)處理5周后，斷頭處死小鼠，立即取大腦儲存于RNA保存液中，備用．

1.2 總RNA 的提取和基因芯片雜交

分別研磨各組實驗小鼠大腦，按照TRIzol 試劑盒(美國Invitrogen 公司)操作說明從中抽提總RNA，用RNeasy Mini Kit(美國Oiagen公司)進(jìn)行純化．用UV-1800紫外分光光度儀(日本Tokyo)測定RNA 的濃度和純度，變性膠電泳(美國Sigma公司DEPC水和溴酚藍(lán)，Bocherigmer公司MOPs緩沖液)檢測RNA 有無降解，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA、體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA 探針，同時用生物素標(biāo)記探針，片段化處理探針，45℃下在雜交箱640 (美國Affymetrix 公司)中與Mouse Genome 4302.0 Araay 基因芯片雜交16 h，全自動芯片洗滌工作站450(美國Affymetrix 公司)中洗脫、染色；最后用GeneArrayTM掃描儀3000(美國Affymetrix 公司)掃描雜交信號．

1.3 芯片數(shù)據(jù)處理和生物學(xué)信息分析

采用Microarray Suite Version 5.0軟件(美國Affymetrix 公司)進(jìn)行分析，在對單個樣本表達(dá)分析的前提下，建立對照組、As2O3組、As2O3+OP組基因表達(dá)譜，其中P>0.06 為不表達(dá)，P<0.04為表達(dá)，P值在0.04～0.06 為臨界值．將各組實驗的基因表達(dá)譜進(jìn)行組間比較，根據(jù)信號強(qiáng)度比值的對數(shù)(signal log ratio，SLR)判斷．SLR>1(即表達(dá)倍數(shù)>2)為表達(dá)上調(diào)，SLR<-1(即表達(dá)倍數(shù)<2)為表達(dá)下調(diào)，建立各組差異表達(dá)的數(shù)據(jù)庫．

2 結(jié) 果

2.1 IL家族基因的表達(dá)

OP對小鼠大腦IL家族基因表達(dá)的影響結(jié)果列于表1．與對照組相比，As2O3組小鼠大腦組織基因IL-3、IL-10、IL-11、IL-1a、IL-15、IL-20、IL-23a、IL-31、IL-1f6、IL-13、IL-25和IL-24表達(dá)均下調(diào)，IL-17d表達(dá)上調(diào)．與As2O3組比較，As2O3+OP組小鼠大腦組織基因IL-3、IL-10、IL-11、IL-1a、IL-15、IL-20、IL-23a、IL-31、IL-25和IL-24表達(dá)下調(diào)，IL-1f6和IL-17d表達(dá)上調(diào)，IL-13表達(dá)無差異．除了基因IL-15、IL-24外，其他基因在對照組與As2O3+OP組小鼠大腦組織的表達(dá)無差異．不同組間IL家族基因差異表達(dá)倍數(shù)結(jié)果顯示，OP干預(yù)后，基因表達(dá)變化幅度減小，說明OP干預(yù)有效.

表1 不同組間小鼠大腦白細(xì)胞介素家族基因差異表達(dá)倍數(shù)

注：OP為橄欖苦苷；As2O3為三氧化二砷；IL為白細(xì)胞介素.

2.2 IL家族受體基因的表達(dá)

OP對小鼠大腦IL家族受體基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)列于表2．與對照組比較，As2O3組小鼠大腦組織基因IL-13受體α1(IL-13ral)和IL-2受體 γ 鏈(IL-2rg)表達(dá)上調(diào)，IL-17受體C (IL-17rc)表達(dá)下調(diào)．與As2O3組比較，As2O3+OP組小鼠大腦組織基因IL-13ral、IL-12rg和IL-17rc表達(dá)上調(diào)．基因IL-13ral、IL-2rg和IL-17rc在對照組與As2O3+OP組小鼠大腦組織的表達(dá)無差異．As2O3+OP組與As2O3組的基因差異表達(dá)倍數(shù)均小于As2O3組與對照組的表達(dá)倍數(shù)絕對值，說明OP干預(yù)有效.

2.3 丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)基因表達(dá)

OP對小鼠大腦下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果列于表3．與對照組比較，As2O3組小鼠大腦組織基因促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1(Crhr1)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體2(Crhr2)、精氨酸加壓素(Avp)、精氨酸加壓素受體1B(Avpr1b)、精氨酸加壓素受體1A(Avpr1a)、精氨酸加壓素受體2(Avpr2)表達(dá)下調(diào)，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Crh)和阿黑皮素原α(Pomc1)表達(dá)上調(diào)．與As2O3組比較，As2O3+OP組小鼠大腦組織基因Crhr1、Crhr2、Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2表達(dá)下調(diào)，Crh和Pomc1表達(dá)上調(diào)．除了基因Crhr2外，其他基因在對照組與As2O3+OP組小鼠大腦組織的表達(dá)無差異．同上，組間基因差異表達(dá)倍數(shù)絕對值變小，說明OP干預(yù)有效.

表2 不同組間小鼠大腦白細(xì)胞介素家族受體基因差異表達(dá)倍數(shù)

注：IL-13ral為IL-13受體α1；IL-2rg為IL-2受體 γ 鏈；IL-17rc為IL-17受體C.

表3 不同組間小鼠大腦下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)基因差異表達(dá)倍數(shù)

注：Crh為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素；Crhr1為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1；Crhr2為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體2；Avp為精氨酸加壓素；Avpr1b為精氨酸加壓素受體1B；Avpr1a為精氨酸加壓素受體1A；Avpr2為精氨酸加壓素受體2；Pomc1為阿黑皮素原α.

3 討 論

砷可通過血液和腦脊液進(jìn)入腦實質(zhì)而損傷腦組織，導(dǎo)致腦功能失調(diào)[5]．中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放的IL可作用于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響免疫系統(tǒng)特定的功能，而且還可能參與神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)間的相互調(diào)節(jié)．本實驗利用基因芯片技術(shù)分析結(jié)果顯示，As2O3組小鼠大腦IL家族基因及受體基因IL-3、IL-10、IL-11、IL-1a、IL-15、IL-20、IL-23a、IL-31、IL-1f6、IL-13、IL-25、IL-24和IL-17rc表達(dá)水平顯著低于對照組，IL-17d、IL-13ral和IL-2rg表達(dá)水平顯著高于對照組，說明上述IL家族部分基因表達(dá)水平的變化，可能與砷的免疫毒性作用有關(guān)，這與王艷艷等[5]的研究結(jié)果一致．經(jīng)OP干預(yù)后，染砷小鼠大腦組織IL家族部分基因的表達(dá)水平與對照組表達(dá)無差異，提示通過調(diào)節(jié)大腦IL家族基因的表達(dá)是減輕砷致免疫毒性的途徑之一．

下丘腦-垂體-腎上腺軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，已有研究表明，大腦組織Crh的相關(guān)基因Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2、Crhr1和Crhr2等是調(diào)控腎上腺皮質(zhì)激素分泌的重要基因[5]，這些基因下調(diào)會導(dǎo)致促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌減少，引起腎上腺皮質(zhì)萎縮，分泌功能減退，進(jìn)而抑制免疫功能．本研究顯示，染砷小鼠大腦組織下丘腦-垂體-腎上腺軸受體相關(guān)基因Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2、Crhr1、Crhr2表達(dá)水平均低于對照組，這進(jìn)一步表明砷可能影響神經(jīng)免疫調(diào)控功能的重要生物信息．經(jīng)OP干預(yù)后，染砷小鼠大腦組織下丘腦-垂體-腎上腺軸受體相關(guān)基因Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2、Crhr1、Crhr2的表達(dá)變化幅度均變小，這表明OP影響了小鼠大腦組織內(nèi)下丘腦-垂體-腎上腺軸受體相關(guān)基因的表達(dá)，但還需進(jìn)一步探討．