姜黃素對(duì)NOD糖尿病小鼠Th1細(xì)胞和CD4+Treg細(xì)胞的作用

王弘珺 李質(zhì)馨 劉忠平 劉瑋健 劉洋 田洪艷

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

姜黃素(Curcumin)屬于多酚類化合物，取自姜黃根部，為天然成分，無(wú)毒性作用。姜黃素對(duì)乳腺癌、直腸癌、胰腺癌有治療作用，此外還可治療多種自身免疫性疾病，如炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、重癥肌無(wú)力等〔1～4〕。其作用機(jī)制為降低炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素(IFN)γ，升高抑炎性細(xì)胞因子IL-4和IL-10，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化與功能〔5〕。1型糖尿病是T細(xì)胞進(jìn)行性損傷胰島β細(xì)胞引起的自身免疫性疾病，存在CD4+T細(xì)胞亞群的分化失衡〔6,7〕。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是1型糖尿病的動(dòng)物模型，發(fā)生糖尿病早期，NOD小鼠的Th1細(xì)胞進(jìn)行性增加、CD4+Treg細(xì)胞相對(duì)缺乏〔8〕。本文研究姜黃素對(duì)NOD小鼠Th1細(xì)胞和CD4+Treg細(xì)胞的作用，探討其對(duì)1型糖尿病的治療作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)10周齡雌性NOD小鼠購(gòu)自北京華阜康生物公司，隨機(jī)分為對(duì)照組和姜黃素組，每組6只，分別給予溶劑或姜黃素(50 mg/kg體重)灌胃，間隔1 d，至第20周。

1.2試劑 抗CD3-PE/CY7抗體、抗CD4-PERCP抗體、抗CD8-PB抗體、抗IFNγ-APC抗體、抗CD25-PE抗體、抗小鼠FcR單抗(BioLegend公司)，細(xì)胞活化試劑盒、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑GolgiStop、CD4+T細(xì)胞MACS分選試劑(BioLegend公司)，抗Foxp3-AF488抗體及染色試劑盒(eBioscience公司)，細(xì)胞因子染色試劑盒(BD公司)，BrdU ELISA檢測(cè)試劑盒(Roche公司)，小鼠淋巴細(xì)胞分離液(Sigma公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)、RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)。

1.3血糖檢測(cè) 取10 μl小鼠尾靜脈血，用血糖儀測(cè)定血糖，血糖值≥11.1 mmol/L為高血糖。

1.4外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 取小鼠靜脈血100 μl，肝素抗凝，用900 μl磷酸鹽緩沖液稀釋靜脈血。在15 ml離心管中加入1.0 ml淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后的血液平鋪在分離液上。室溫2 000 r/min離心20 min。離心結(jié)束后收集中間層細(xì)胞，與等體積磷酸鹽緩沖液混勻，室溫1 500 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌細(xì)胞1次，懸浮于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中。

1.5組織細(xì)胞樣品的制備 麻醉小鼠取脾和胸腺，制單細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液(17 mmol/L Tris-HCl，140 mmol/L NH4Cl，pH7.2)裂解紅細(xì)胞，懸浮于10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)。

1.6細(xì)胞因子檢測(cè) 取1×106淋巴細(xì)胞，加入終濃度為50 ng/ml佛波酯(PMA)、500 ng/ml Ionomycin和4 μl/ml GolgiStop，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞。加抗FcR單抗、抗CD3-PE/CY7抗體、抗CD4-PERCP抗體，4℃染色30 min。參照BD說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抗IFNγ-APC抗體染色，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.7Foxp3的檢測(cè) 取1×106淋巴細(xì)胞，加入抗FcR單抗、抗CD3-PE/CY7抗體、抗CD4-PERCP抗體、抗CD8-PB抗體、抗CD25-PE抗體，4℃染色30 min。參照eBioscience說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抗Foxp3-AF488抗體染色，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.8CD4+Treg細(xì)胞抑制功能檢測(cè) 先用BioLegend試劑盒分離小鼠脾CD4+T細(xì)胞，再用抗CD3-APC抗體、抗CD4-PERCP抗體、抗CD25-PE抗體、4℃染色30 min，流式細(xì)胞儀分選CD4+CD25+Treg細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞。在96孔板中加1 μg/ml抗CD3抗體(包被)和2 μg/ml抗CD28抗體(溶解)，接種對(duì)照組CD4+CD25-T細(xì)胞(5×104細(xì)胞/孔)，分別接種對(duì)照組或姜黃素組CD4+CD25+Treg細(xì)胞(1.25×104細(xì)胞/孔)，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，用BrdU ELISA法檢測(cè)細(xì)胞增殖，酶標(biāo)儀測(cè)吸光度(OD)值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1血糖水平 從第14周開(kāi)始每周測(cè)小鼠血糖，結(jié)果見(jiàn)圖1。第20周時(shí)，對(duì)照組血糖正常小鼠的百分?jǐn)?shù)為20%；而姜黃素組血糖正常小鼠的百分?jǐn)?shù)為60%。

圖1 兩組血糖正常小鼠

2.2外周血Th1細(xì)胞和CD4+Treg細(xì)胞的流式檢測(cè) 姜黃素組Th1細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。兩組CD4+Treg細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。姜黃素組CD4+Treg/Th1顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖2。

表1 外周血Th1細(xì)胞和CD4+Treg細(xì)胞變化

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；下表同

2.3胸腺CD4+Treg細(xì)胞的流式檢測(cè) 兩組胸腺CD4+CD8-T細(xì)胞、CD8+CD4-T細(xì)胞及CD4+Treg細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；姜黃素組胸腺總細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖3，表2。

2.4CD4+Treg細(xì)胞抑制功能檢測(cè) 姜黃素組CD4+CD25+Treg細(xì)胞可抑制對(duì)照組CD4+CD25-T細(xì)胞增殖(0.414±0.055 vs 0.639±0.077，P<0.01)；但對(duì)照組CD4+CD25+Treg細(xì)胞(0.626±0.052)不能抑制自身CD4+CD25-T細(xì)胞增殖。

表2 胸腺內(nèi)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和CD4+Treg細(xì)胞變化

3 討 論

引起1型糖尿病的重要免疫因素是CD4+T細(xì)胞亞群的分化失衡。前期研究表明，糖尿病早期外周Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子IFNγ增加，而外周CD4+Treg細(xì)胞數(shù)目或功能相對(duì)降低，從而導(dǎo)致糖尿病〔8～10〕。針對(duì)1型糖尿病早期CD4+T細(xì)胞亞群分化失衡，應(yīng)用藥物抑制Th1細(xì)胞分化、促進(jìn)CD4+Treg細(xì)胞分化、增加CD4+Treg細(xì)胞抑制功能，可阻止或改善1型糖尿病病情。

由于雌性NOD小鼠在12～30周齡時(shí)自發(fā)糖尿病，本研究對(duì)雌性NOD小鼠從第10周至第20周用等體積溶劑或姜黃素灌胃，結(jié)果提示，姜黃素早期治療推遲了糖尿病NOD小鼠的高血糖癥狀。

本研究結(jié)果說(shuō)明，姜黃素降低NOD小鼠外周Th1細(xì)胞數(shù)目，相對(duì)緩解外周CD4+Treg細(xì)胞缺乏，延緩了NOD小鼠的高血糖癥狀。天然CD4+Treg細(xì)胞產(chǎn)生于胸腺，姜黃素對(duì)NOD小鼠胸腺內(nèi)CD4+Treg細(xì)胞未見(jiàn)明顯影響，然而，姜黃素延緩胸腺退化，改善了NOD小鼠的胸腺環(huán)境。姜黃素是否影響胸腺內(nèi)T細(xì)胞分化或胸腺上皮細(xì)胞及胸腺樹(shù)突細(xì)胞功能，還需深入研究。進(jìn)一步分析姜黃素對(duì)CD4+Treg細(xì)胞的作用，對(duì)照組CD4+CD25+Treg細(xì)胞不能抑制自身CD4+CD25-T細(xì)胞對(duì)抗CD3和抗CD28的增殖反應(yīng)；然而姜黃素組CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以抑制對(duì)照組CD4+CD25-T細(xì)胞或姜黃素組CD4+CD25-T細(xì)胞對(duì)抗CD3與抗CD28的增殖反應(yīng)，說(shuō)明姜黃素組CD4+Treg細(xì)胞的抑制功能明顯增加。PTEN-mTOR與IL-2-STAT5信號(hào)是調(diào)控Th1細(xì)胞和CD4+Treg細(xì)胞分化、維持CD4+Treg細(xì)胞抑制功能的關(guān)鍵信號(hào)〔11～15〕。姜黃素是否調(diào)控上述兩個(gè)信號(hào)通路影響CD4+Treg細(xì)胞分化與功能，尚需深入研究。

綜上，姜黃素治療NOD小鼠，可降低外周血Th1細(xì)胞，增加CD4+Treg細(xì)胞抑制功能，延緩胸腺退化，降低NOD小鼠高血糖的發(fā)生率。