血小板微粒與缺血性腦卒中診療的研究進(jìn)展

李慶運(yùn)，曾俊玲 綜述 陳煜森 審校

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 湛江 524001

腦血管疾病是危害人類生命和健康的疾病譜中最重要的疾病之一。全球每年約有1 500萬(wàn)患者被診斷為中風(fēng)，其中約有500萬(wàn)人死亡，是全球第二致死病因，也是長(zhǎng)期致殘重要病因[1]，在中國(guó)每年約240 萬(wàn)人患有腦卒中，約有110 萬(wàn)人死亡[2]，這已成為中國(guó)人民主要死因，而缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)占其80%左右[3]。目前缺血性腦卒中患者，能在短時(shí)間內(nèi)迅速恢復(fù)腦血流，挽救缺血半暗帶的有效治療方法是超急性期溶栓與血管介入治療，但由于其時(shí)間窗極短與禁忌證較多，能在臨床運(yùn)用并使患者收益相當(dāng)少，導(dǎo)致IS 患者往往具有很高的殘疾率和死亡率。因此尋找IS早期診斷、判斷預(yù)后的新的標(biāo)記物和新的治療方法已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。越來(lái)越多研究表明：血小板微粒(platelet microparticle，PMP)不僅有望成為判斷IS嚴(yán)重程度及預(yù)后新的標(biāo)志物，而且有望為IS患者治療方面提供新的治療思路。

1 血小板微粒概述

血小板微粒首次被發(fā)現(xiàn)是在1967年，當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)者沃爾夫?qū)⑺鼈兠麨椤把“鍓m?！盵4]。經(jīng)后面研究表明，血小板微粒是血小板在應(yīng)激后通過(guò)血小板激活和自身凋亡兩條途徑釋放的直徑在0.1～1.0 um的顆粒樣物質(zhì)[5]。血小板微粒是循環(huán)微粒中含量最豐富的微粒，占70%～90%[6]。血小板微粒釋放受高剪切力[7]、ADP、細(xì)胞因子、低溫、凝血酶[8]、膠原[9]、Ca2+[10]、補(bǔ)體[11]等影響。有研究通過(guò)對(duì)比不同血小板激動(dòng)劑作用下產(chǎn)生的血小板微粒，經(jīng)過(guò)蛋白組學(xué)檢測(cè)顯示，PMP 中的蛋白質(zhì)組成與用于血小板刺激的激動(dòng)劑類型直接相關(guān)[12]。

目前PMP的形成和釋放機(jī)制研究尚未明確，普遍認(rèn)為血小板活化時(shí)，通過(guò)細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣通道開(kāi)放、鈣離子動(dòng)員和細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，蛋白質(zhì)磷酸化，細(xì)胞骨架被破壞，這些機(jī)制與PMP形成與釋放關(guān)系密切。當(dāng)血小板被激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加，位于細(xì)胞骨架中的肌球蛋白形成細(xì)絲，然后從細(xì)胞的外圍收縮到中心，而位于膜骨架的肌動(dòng)蛋白微絲由于受依賴凝Ca2+膠蛋白切割，使其聚合受阻。當(dāng)活化血小板收縮時(shí)，部分缺乏正常膜骨架支持的細(xì)胞膜不能正常收縮，向外伸展變形形成偽足，而正常膜骨架支撐部分向內(nèi)收縮，偽足末端具有芽狀凸起。最后這些活化血小板形成的變形細(xì)胞膜可以通過(guò)偽足破裂或芽狀突起出芽形成PMP。

有研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)傳統(tǒng)鈣蛋白酶激活的情況下，靜息血小板形成可通過(guò)整合素αIIbβ3信號(hào)傳導(dǎo)引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的去穩(wěn)定化。這種由整合素介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的不穩(wěn)定而導(dǎo)致PMP的形成，這種不依賴Ca2+的傳統(tǒng)模式，可能是血小板凋亡有關(guān)[13]。血小板凋亡可釋放PMP，而導(dǎo)致血小板凋亡機(jī)制有兩種，一是由細(xì)胞表面死亡受體(腫瘤壞死因子受體等)誘發(fā)，經(jīng)過(guò)受體與配體相互作用，傳導(dǎo)信息，引起半胱天冬酶原自身切割，最后導(dǎo)致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶活化，促使血小板凋亡[14]，這是外源途徑。二是線粒體受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)刺激，使其內(nèi)膜去極化，打開(kāi)通透性轉(zhuǎn)換孔，膜間隙釋放細(xì)胞色素C，最后由凋亡執(zhí)行蛋白誘導(dǎo)血小板凋亡，這是內(nèi)源性途徑。

2 PMP在IS中的病理生理機(jī)制

2.1 PMP與炎性反應(yīng) 目前PMP參與炎癥反應(yīng)機(jī)制仍未明確，普遍認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞可以被PMP活化，并促進(jìn)兩者相互作用。而活化單核細(xì)胞可通過(guò)分泌多種促炎因子如腫瘤壞死因子-α、黏附分子、蛋白水解酶、白細(xì)胞介素-1β等，使內(nèi)皮細(xì)胞受損，誘導(dǎo)腦內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，損害血-腦脊液屏障。中性粒細(xì)胞通過(guò)受損的血-腦脊液屏障，在缺血性腦組織黏附聚集，通過(guò)產(chǎn)生蛋白分解酶和氧自由基，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，使腦組織受損。然而有人提出PMP可能通過(guò)穩(wěn)定Treg表型，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)從而在組織修復(fù)過(guò)程發(fā)揮作用[15]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)與人體自身免疫息息相關(guān)。當(dāng)Tregs受外來(lái)刺激后可自身調(diào)節(jié)可表現(xiàn)出對(duì)促炎癥表型的可塑性，進(jìn)一步分泌白細(xì)胞介素-17(IL-17)或干擾素-γ(IFN-γ)。Tregs 表型是否穩(wěn)定與炎癥反應(yīng)是否持續(xù)密切相關(guān)，當(dāng)其失衡時(shí)可引起移植物抗宿主病。PMP 能通過(guò)與CCR6 +HLA-DR+記憶樣Treg亞群、P-選擇素、CXCR3結(jié)合成劑量依賴性抑制外周血衍生的Tregs 分化為產(chǎn)生IL-17和IFN-γ的細(xì)胞，穩(wěn)定Treg表型，抑制炎癥反應(yīng)，縮短炎癥持續(xù)時(shí)間，從而可能促進(jìn)腦組織恢復(fù)。

2.2 PMP 與血栓形成 血小板微粒促進(jìn)血栓形成主要機(jī)制有以下三個(gè)方面，一是血小板活化因子(PAF)方面，PAF是血小板激活劑[16]。當(dāng)PAF濃度達(dá)到一定水平時(shí)，就易誘發(fā)血栓形成，而PMP 決定了PAF的活性。二是PMP 膜富含PS，當(dāng)血小板活化時(shí)促進(jìn)血小板聚集和凝血反應(yīng)，同時(shí)它可以通過(guò)釋放PMP表達(dá)PS 或TF，導(dǎo)致更多凝血酶釋放，使凝血反應(yīng)加強(qiáng)。這是一種類似于正反饋機(jī)制，通過(guò)這正反饋加強(qiáng)凝血反應(yīng)，最終導(dǎo)致血小板進(jìn)一步減少和血液高凝狀態(tài)形成[17]。這種正反饋?zhàn)饔迷谂R床多種疾病血栓形成中起重要作用，進(jìn)一步剖析該途徑，研究拮抗劑或許能成為新一代的抗栓藥物。有研究通過(guò)對(duì)比PMP 與活化后血小板單位表面積在促凝血方面活性發(fā)現(xiàn)，PMP促凝血活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于活化血小板，最高可達(dá)到活化血小板的100 倍[18]。三是Ⅷ因子和Va 因子，Ⅷ因子是Tenase 酶復(fù)物形成的協(xié)同因子；而凝血酶原酶復(fù)合物形成取決于因子Va與Xa結(jié)合。雖然Ⅷ因子與血小板的聯(lián)系不穩(wěn)定，但Ⅷ因子及Va 因子結(jié)合到PMP 的表面時(shí)是穩(wěn)定的，因此PMP在這方面不依賴于血小板活化促進(jìn)凝血，這種促凝血活性比血小板活化引起的凝血更持久。據(jù)報(bào)道SPMP(直徑小于0.5 μm 的血小板微粒)可觸發(fā)血小板和單核細(xì)胞功能，并通過(guò)P-選擇蛋白調(diào)節(jié)血栓形成[19]。

2.3 PMP 與血管新生 PMP 促進(jìn)血管新生主要是因?yàn)镻MP 包含多種血管生成mRNA 及多種原型血管生成蛋白，例如表皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子-α、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮糖蛋白、內(nèi)皮素-1、五聚蛋白-3、血小板因子-4、纖溶酶原激活物抑制劑-1、血管生成素-1、組織金屬蛋白酶-1 和血小板反應(yīng)蛋白-1 的抑制劑[20]。從而促進(jìn)血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)，PMP 可將微RNA(miRNA)傳遞至受體細(xì)胞，改變了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中血管生成調(diào)節(jié)劑的釋放，還可以抑制血小板反應(yīng)蛋白-1的生成[21]，從而調(diào)節(jié)血管形成。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，PMP 可以通過(guò)促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子-1α細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)血管新生[22]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校琍MP可導(dǎo)致梗死邊緣區(qū)細(xì)胞增殖、血管生成呈劑量依賴性增加，行為缺陷明顯改善[23]。而在后肢缺血的嚙齒動(dòng)物模型中，靜脈注射PMP也可促進(jìn)新血管形成[24]。

3 PMP有望成為IS早期診斷與預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志物

CHEN 等[25]發(fā)現(xiàn)，外周血中檢測(cè)PMP，急性缺血性腦卒中(AIS)患者較健康志愿者的PMP 水平顯著升高，而且AIS亞型中循環(huán)PMP的水平與梗死體積呈正相關(guān)，在小動(dòng)脈閉塞(LAA)亞型中更明顯。既往也有研究表明，腦梗塞面積與患者良好臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，梗塞面積越大，并發(fā)癥越多，神經(jīng)修復(fù)能力越低[26-28]。此外，動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的PMP水平明顯高于心源性腦梗死[29]。而頸動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿中的PMP水平明顯高于無(wú)頸動(dòng)脈粥樣硬化的健康人。這些研究表明PMP 不僅有助于診斷是否患有缺血性腦卒中及判斷缺血性腦損傷程度，而且在鑒別腦梗塞病因方面也有一定潛力。甚至PMP 在成為動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志物方面也有巨大前景。

目前AIS 患者最有效治療方法是，在時(shí)間窗內(nèi)靜脈溶栓與血管內(nèi)治療。對(duì)決定是否進(jìn)一步血管內(nèi)治療取決于靜脈溶栓是否再通情況，在短短的治療時(shí)間窗內(nèi)，快速、簡(jiǎn)捷的判斷再通情況的標(biāo)志物尤為重要。BIVARD等[30]納入57例診斷為急性腦梗塞并在溶栓時(shí)間窗內(nèi)患者，在接受靜脈內(nèi)rtPA治療后局部或完全再通的缺血性卒中患者與再通狀況較差的患者相比，PMP 的水平顯著增加，因此PMP 可能是再灌注治療有效性的生物標(biāo)志物。而再通是臨床預(yù)后的有力預(yù)測(cè)指標(biāo)，PMP的水平不僅有望成為預(yù)測(cè)溶栓患者預(yù)后指標(biāo)，而且有望成為靜脈內(nèi)治療的再通標(biāo)記為溶栓患者是否分流至血管內(nèi)治療臨床提供有效的指導(dǎo)。

目前有研究通過(guò)納入42 例癥狀性頸動(dòng)脈疾病患者和31例健康人對(duì)照，探討了癥狀性頸動(dòng)脈疾病患者PMP水平與后續(xù)復(fù)發(fā)栓塞事件標(biāo)志物之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)癥狀性頸動(dòng)脈疾病患者急性腦缺血病變(DWI+)的PMP較對(duì)照組升高，而癥狀性頸動(dòng)脈疾病患者中急性腦缺血病變(影像學(xué)DWI+)較(影像學(xué)DWI-)患者PMP明顯升高[31]。該研究與既往研究PMP 與近期腦缺血事件具有相關(guān)性結(jié)果相符。值得注意的是，經(jīng)顱多普勒超聲(微栓塞信號(hào))是提示正在進(jìn)行血栓栓塞活動(dòng)，而此實(shí)驗(yàn)中經(jīng)顱多普勒超聲(微栓塞信號(hào)[MES+])患者較微栓塞信號(hào)[MES-]患者PMP 也明顯升高，PMP與正在進(jìn)行血栓栓塞活動(dòng)相關(guān)。此研究表明PMP 可以預(yù)測(cè)正在進(jìn)行的血栓栓塞活動(dòng)。

4 PMP與缺血性腦卒中的治療

4.1 PMP 有望成為缺血性腦卒中新的治療方法 通過(guò)健康志愿者中收集獲得PMP，予以不同濃度PMP浸潤(rùn)缺血性腦梗塞模型大鼠腦表面，通過(guò)追蹤大鼠腦卒中后90 d 內(nèi)，神經(jīng)功能缺損評(píng)定、免疫組織化學(xué)等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外源性PMP處理后的大鼠較未處理大鼠梗塞邊界血管、新生細(xì)胞數(shù)量明顯增加，殘疾評(píng)分下降更明顯[23]。PMP 在體內(nèi)以劑量依賴的方式增加血管生成和神經(jīng)發(fā)生，并改善中風(fēng)后的功能結(jié)局?；蛟S在重癥腦梗塞，如大面積腦梗塞，尤其是去顱瓣減壓患者方面，可予以外源性PMP 浸潤(rùn)，促進(jìn)IS 患者血管新生、神經(jīng)干細(xì)胞分化，促進(jìn)患者神經(jīng)功能缺損癥狀改善，這或許有望成為缺血性腦卒中治療新方法，當(dāng)然目前研究較少，PMP對(duì)缺血性腦卒中恢復(fù)期作用還需更多證據(jù)，運(yùn)用于臨床還有很長(zhǎng)一段路要走。

4.2 抗血小板治療與PMP釋放

4.2.1 不可逆的環(huán)氧合酶抑制劑 抗血小板藥對(duì)于血管疾病的預(yù)防和治療尤為重要，但是它們對(duì)PMP釋放的影響及機(jī)制目前尚未明確。乙酰水楊酸，也稱為阿司匹林，是一種環(huán)氧酶抑制劑。目前關(guān)于PMP對(duì)乙酰水楊酸(ASA)治療的反應(yīng)性的報(bào)道是有限且矛盾的。既往研究發(fā)現(xiàn)，ASA 可降低健康受試者[22]、高血壓心臟病、非重度(＜50%管腔狹窄)冠狀動(dòng)脈疾病的患者的PMP產(chǎn)生[33]。在心肌梗塞模型大鼠實(shí)驗(yàn)中，ASA也可降低PMP 水平。同時(shí)相對(duì)于單用ASA 相比，雙抗(ASA 聯(lián)合氯吡格雷)效果更為明顯。盡管如此，絕大多數(shù)報(bào)告表明ASA 對(duì)PMP 形成的影響有限。ASA對(duì)IS 的急性期或慢性期患者、房顫、周圍動(dòng)脈閉塞性疾病、高脂血癥患者、多發(fā)性梗塞性癡呆癥患者、急性冠脈綜合征、1 型或者2 型糖尿病患者PMP 的釋放均無(wú)明顯影響[34-40]。這些矛盾的實(shí)驗(yàn)報(bào)道可能是ASA不同治療時(shí)間、ASA劑量、PMP定量方法等不同引起，現(xiàn)需進(jìn)一步規(guī)范化及大樣本研究證明。有必要進(jìn)一步研究不同劑量下ASA 或聯(lián)合抗血小板治療能否減少PMP釋放。

4.2.2 腺苷二磷酸受體抑制劑 P2Y12 ADP 受體通過(guò)與Gi 蛋白和腺苷酸環(huán)化酶途徑偶聯(lián)，相互作用，促進(jìn)纖維蛋白原的GP IIb/IIIa受體激活，這在PMP形成中起重要作用[41]。P2Y12受體拮抗劑通過(guò)增加環(huán)內(nèi)單磷酸腺苷的血小板內(nèi)濃度，降低血小板激活敏感度和隨后的血小板囊泡化。有研究發(fā)現(xiàn)急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者在發(fā)病24 h內(nèi)[42]，予以氯吡格雷治療，通過(guò)檢測(cè)用藥前后循環(huán)PMP表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，PMP在服藥后下降，其中以持續(xù)用藥第5 天最為明顯。FRAN?A等[43]也發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定的冠心病患者氯吡格雷血漿濃度與PMP 釋放量成負(fù)相關(guān)。PMP 或許可以成為評(píng)估藥物抗血小板效果的潛在標(biāo)志物。

4.2.3 HMG-CoA 還原酶抑制劑(他汀類) 血小板活化和聚集能促進(jìn)凝血反應(yīng)和血栓形成。據(jù)此，通過(guò)抑制血小板活化，啟動(dòng)IS一級(jí)預(yù)防，或許是預(yù)防IS的有效方法。有研究發(fā)現(xiàn)HMG-CoA還原酶抑制劑，不僅可以通過(guò)降低膽固醇，減少動(dòng)脈粥樣硬化事件[44]。同時(shí)可以預(yù)防內(nèi)膜增生及血小板的活化和聚集。參與細(xì)胞骨架重組的修飾G 蛋白功能和Rho 激酶途徑，他汀類藥物會(huì)影響PMP脫落，以脂質(zhì)非依賴性方式降低PMP的數(shù)量[45-46]。HMG-CoA 還原酶抑制劑有助于降低NF-KB活性，并促進(jìn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體暴露。因此，它們影響許多促炎細(xì)胞因子和趨化因子的釋放[47]，從而限制了血小板的活化。ROSA等[45]研究結(jié)果也相同，與未經(jīng)治療的血漿脂質(zhì)水平相同的患者相比，他汀類治療的高膽固醇血癥患者的PMP濃度較低。缺血性腦卒中后高脂血癥患者予以辛伐他汀20 mg/d，維持6個(gè)月，患者PMP百分比降低[48]。

4.2.4 維生素K 拮抗劑 CHOUDHURY 等[49]通過(guò)對(duì)房顫(AF)患者治療研究，發(fā)現(xiàn)以前未進(jìn)行過(guò)任何抗栓治療，華法林開(kāi)始口服抗凝治療(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比例的目標(biāo)范圍在2～3)對(duì)PMP 釋放沒(méi)有顯著影響，而且，在接受ASA 和華法林的AF 患者中，PMP 濃度無(wú)顯著差異。既往規(guī)律服用ASA 的AF 患者改為服用華法林一段時(shí)間對(duì)比，PMP釋放也沒(méi)有明顯變化。

5 展望

綜上所述，PMP 具有多種特性，在缺血性腦卒中中參與多種病理機(jī)制，PMP 在成為缺血性腦卒中診斷、預(yù)后的標(biāo)志物，提供新的治療思路具有巨大潛力。研究人員已開(kāi)始將PMP視為血管疾病(尤其是腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)分層)中的新型生物標(biāo)記物。藥物對(duì)循環(huán)PMP的影響，或許可以為IS治療的提供一個(gè)新的治療方向。通過(guò)調(diào)節(jié)PMP釋放，而且暴露其表面標(biāo)志物可能具有重要的治療作用，同時(shí)可能監(jiān)測(cè)抗血小板治療的療效。雖然PMP在缺血性腦卒中的早期診斷、治療及預(yù)測(cè)預(yù)后方面具有廣闊前景，但是距離運(yùn)用于臨床還有很長(zhǎng)一段路要走，還需進(jìn)一步研究和檢驗(yàn)。