Six1在惡性腫瘤中的最新研究進(jìn)展

姚昌洋，姜芳倩，潘成武，李煊赫，孫思雨，姚廷敬

同源盒基因Six1是一多基因家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。異常表達(dá)的Six1基因可以通過多種信號通路導(dǎo)致正常細(xì)胞的凋亡與增殖失衡，上游調(diào)控因子的異常表達(dá)可以導(dǎo)致Six1的功能失調(diào)，而異常表達(dá)的Six1可以作用于其靶基因CyclinA1、TGF-β等，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

1 同源盒基因基本概述

同源盒基因是一組特定時間表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可特異性調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其在結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性，可以特異性的識別并結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域，其大小及氨基酸的結(jié)構(gòu)順序是固定的，稱為同源異型結(jié)構(gòu)域(honedomain,HD)[1]。根據(jù)氨基酸序列進(jìn)行分析，Six家族可以分為三個亞系，共六個亞型，Six1/Six2、Six3/Six6、Six4/Six5，而對其亞型之一的Six1研究較多，其定位于人類染色體14q23上，是一段183bp的保守DNA編碼基因序列，可以編碼60-61個氨基酸，它參與細(xì)胞的增殖與分化，并在細(xì)胞的黏附及遷移中起到關(guān)鍵作用[2]。目前已經(jīng)有研究表明，Six1基因能在較多的惡性腫瘤中表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用[3]，但對于在腫瘤進(jìn)展過程中Six1具體通過何種調(diào)節(jié)機(jī)制、如何產(chǎn)生作用并無確切的解釋，后續(xù)的研究可能會更加集中在如何調(diào)控表達(dá)異常的Six1基因，從而達(dá)到抑制腫瘤的目的。明確Six1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的作用，對于惡性腫瘤的早診斷、早治療以及對預(yù)后的評估具有重要意義。

2 Six1基因與腫瘤的關(guān)系

2.1 Six1與乳腺癌 異常表達(dá)的Six1基因能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移及入侵誘發(fā)并增強(qiáng)致癌性。有動物實(shí)驗(yàn)表明，Six1參與乳腺組織的發(fā)育以及乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。Six1基因是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以通過激活CyclinA1、CyclinD1等靶基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，降低其與DNA結(jié)合能力，最后經(jīng)蛋白降解[4-5]，但Six1過表達(dá)削弱了此作用，加快整個細(xì)胞周期的進(jìn)程，促使細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Coletta等[6]研究報道在乳腺癌細(xì)胞中，Six1高表達(dá)可上調(diào)CyclinA1 mRNA的水平及活性，加速細(xì)胞的進(jìn)程，調(diào)節(jié)CyclinA1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生，再通過調(diào)控AyclinA2及c-myc等進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞的增生。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)把乳腺癌細(xì)胞注入有免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Six1表達(dá)能夠促進(jìn)瘤內(nèi)及瘤周的淋巴管生成、淋巴浸潤，并促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此證實(shí)Six1和VEGF-C在乳腺癌中是一起表達(dá)的。Micalizzi等[8-9]研究表明在乳腺癌細(xì)胞中Six1過表達(dá)依靠TGF-β信號通路以誘導(dǎo)EMT和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在這過程中，Six1與Smad3一同增強(qiáng)TGF-β信號。過表達(dá)的Six1乳腺癌患者其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移時間較短，總體生存率降低。TGF-β是Six1的新靶點(diǎn)，并暗示Six1是乳腺癌中TGF-β功能的決定性因素。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，由Six1誘導(dǎo)的EMT被描述為一種常見的癌癥進(jìn)展模式，它可以促進(jìn)乳腺癌的遷移和侵襲，并發(fā)現(xiàn)miR-204-5p可以抑制乳腺癌細(xì)胞系的遷移和侵襲。因Six1過表達(dá)促進(jìn)EMT，miR-204-5p通過下調(diào)Six1來抑制EMT的機(jī)制，還發(fā)現(xiàn)上調(diào)Six1可以下調(diào)miR-204-5p的表達(dá)，影響乳腺癌細(xì)胞系的遷移和侵襲?？傊?，乳腺癌中Six1的頻繁上調(diào)和/或miR-204-5p的下調(diào)可能會改變這些相互調(diào)節(jié)的平衡，并將乳腺癌細(xì)胞鎖定在間質(zhì)狀態(tài)。

2.2 Six1與肝癌(HCC) 據(jù)國際癌癥研究署發(fā)布的全球腫瘤疾病中，2012年全世界有78200例新發(fā)肝癌患者，約有746000例患者因肝癌死亡，在中國新發(fā)肝癌比例占50.5%，因肝癌死亡的患者占51.3%[11]。有研究[12]探索Six1與DACH1對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明Six1在癌組織中過表達(dá)，而DACH1被抑制。在G2/M期抑制Six1的表達(dá)及DACH1過表達(dá)，不僅可以抑制細(xì)胞增殖，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期。DACH1過表達(dá)時可以通過上調(diào)p53的表達(dá)抑制腫瘤的發(fā)生，而Six1過表達(dá)時則通過下調(diào)p53的表達(dá)加速腫瘤的生長。因此，Six1的降低促進(jìn)DACH1的表達(dá)，從而激活p53的表達(dá)并抑制HCC在體內(nèi)外的表達(dá)。Chen等[13]通過對比正常肝細(xì)胞，研究Six1在肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性及化療敏感性，經(jīng)功能實(shí)驗(yàn)證明，敲除肝癌細(xì)胞Six1基因后，增強(qiáng)了其對5-氟尿嘧啶的敏感性，降低了肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性，此外，還證明了Six1可以直接結(jié)合SOX2(干細(xì)胞特性主調(diào)節(jié)器)啟動子，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

2.3 Six1與胃癌(GC) Emadi等[14]研究表明從30對胃癌組織標(biāo)本行實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測Six1基因表達(dá)，采用配對t檢驗(yàn)或單因素方差分析，結(jié)果提示Six1的表達(dá)在彌漫性胃癌中顯著增加，并且隨著病理分級的升高，Six1基因的表達(dá)顯著增加，在Ⅰ級和Ⅲ級之間的差異更加顯著。Xie等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)Six1在胃癌組織中高表達(dá)，不僅可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲，同時因其過表達(dá)增加了cyclinD1、MMP2、p-ERK和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，可以通過敲除Six1蛋白而抑制這些蛋白的表達(dá)?？傊?，Six1表達(dá)在GC組織中上調(diào)，其可以通過MMP2和E-鈣粘蛋白及cyclinD1，經(jīng)由ERK信號侵襲和EMT途徑促進(jìn)GC細(xì)胞增殖。這些結(jié)果提示了Six1在胃癌細(xì)胞增殖和侵襲中的潛在調(diào)控機(jī)制。

2.4 Sxi1與結(jié)直腸癌(CRC) Xu等[16]研究采用原位模型和脾注射轉(zhuǎn)移模型，利用過表達(dá)Six1的小鼠結(jié)腸腺癌MC38細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Six1可以顯著促進(jìn)體內(nèi)CRC腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在MC38細(xì)胞中，過表達(dá)Six1提高了乙醛脫氫酶-1的蛋白水平，增加了CD44+/CD166+的數(shù)量，表明Six1增加了癌癥干細(xì)胞的特征。此外，Six1過表達(dá)通過上調(diào)VEGF的表達(dá)來刺激血管生成。Six1過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞通過增加巨噬細(xì)胞特異性集落刺激因子、2/5趨化因子(C-C motif)配體和VEGF的表達(dá)召集了腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(TAM)，進(jìn)一步促進(jìn)了CRC腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，并且還發(fā)現(xiàn)Six1在CRC細(xì)胞中激活了絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號?？傊?，Six1過表達(dá)促進(jìn)CRC的生長和轉(zhuǎn)移，并通過刺激血管生成和召集TAM來重塑腫瘤間質(zhì)。近來有研究證據(jù)表明，微小RNA通過下調(diào)Six1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用，Wan等[17]通過采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測CRC細(xì)胞miR-362和SIX1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組織和細(xì)胞相比，CRC組織和細(xì)胞系中的miR-362明顯降低。53例CRC患者的總生存期與miR-362的低表達(dá)之間存在顯著的聯(lián)系。miR-362的下調(diào)通過與CRC中SIX1 mRNA的3’-UTR結(jié)合來抑制細(xì)胞的增殖和侵襲，Six1是miR-362的直接靶基因，miR-362的表達(dá)與CRC中Six1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Six1可逆轉(zhuǎn)在CRC細(xì)胞的增殖和侵襲的部分功能。綜上所述，對于Six1對于CRC具體作用機(jī)制仍然不清楚，仍然需要進(jìn)一步探討。

2.5 Six1與腎母細(xì)胞瘤(WT) 復(fù)發(fā)性腎母細(xì)胞瘤(WTs)患兒中約有一半對挽救性治療產(chǎn)生了耐藥性。因此，揭示驅(qū)動腫瘤進(jìn)展/復(fù)發(fā)的事件非常重要。Spreafico等[18]考慮到收集WTs標(biāo)本的難度，已經(jīng)進(jìn)行一些分析配對的原發(fā)/復(fù)發(fā)性疾病的分子結(jié)構(gòu)的工作，通過研究了8對原發(fā)性/復(fù)發(fā)性WTs全基因組SNP陣列的基因組譜，并研究已知的與WT相關(guān)的基因，其中包括Six1、Six2和微RNA處理器基因，近來提出的觀點(diǎn)表示這些基因的突變提示更加不良的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在可能復(fù)發(fā)WT中產(chǎn)生了新生的突變，有的已經(jīng)在原發(fā)腫瘤中認(rèn)定為有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險，其中包括1q和3號染色體的等位基因失衡，以及染色體16q的CN缺失。此外，在原發(fā)性腫瘤中，SIX1和DROSHA突變可以是異質(zhì)性事件(在空間和時間上)，在復(fù)發(fā)性疾病的進(jìn)展中它們的共同出現(xiàn)可能是積極的選擇?？傊?，這些結(jié)果為WT進(jìn)展/復(fù)發(fā)背后的基因組和遺傳事件提供了新的見解。

2.6 Six1與子宮頸癌(CC) 宮頸癌是女性第二常見的癌癥，占全世界人類新發(fā)癌癥的5%，其中80%在發(fā)展中國家。越來越多的證據(jù)表明，micro-RNA在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。Shi等[19]研究microRNA-362(miR-362)在CC中的表達(dá)、作用及分子機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-362的表達(dá)水平在宮頸癌組織和細(xì)胞系中顯著降低。miR-362低表達(dá)與宮頸癌FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管侵犯相關(guān)。通過功能檢測顯示，miR-362的恢復(fù)抑制了CC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，還通過生物信息學(xué)分析、熒光素酶報告基因分析、qRT-PCR和western blot分析證實(shí)，Six1是miR-362在宮頸癌中的直接靶點(diǎn)。在宮頸癌中，Six1表達(dá)上調(diào)與miR-362表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外，Six1敲除可以模擬miR-362過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。此外，拯救實(shí)驗(yàn)表明，恢復(fù)Six1足以消除miR-362過表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞中引起的增殖、遷移和侵襲。新發(fā)現(xiàn)的miR-362/Six1通路為研究宮頸癌進(jìn)展提供了思路，并可能代表一種新的治療靶點(diǎn)。有研究[20]通過收集56對CC組織和癌旁組織標(biāo)本，同時培養(yǎng)人正常宮頸上皮細(xì)胞和CC細(xì)胞系。用MTT和遷移實(shí)驗(yàn)法檢測細(xì)胞的增殖和遷移能力。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測Six1與miR-23b間的相關(guān)性。結(jié)果顯示:MiR-23b在CC中明顯下調(diào)，MiR-23b低表達(dá)與CC患者預(yù)后差、OS差有關(guān)。功能檢測顯示，miR-23b過表達(dá)通過調(diào)控AKT/mTOR通路和EMT過程，明顯抑制了CC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。此外，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明，Six1是miR-23b在CC細(xì)胞中的一個功能靶點(diǎn)，說明miR-23b在CC細(xì)胞中的抑制功能部分被Six1調(diào)控。miR-23b在體內(nèi)可顯著抑制腫瘤生長?？偟膩碚f，MiR-23b可以直接靶向Six1，影響AKT/mTOR信號通路和EMT進(jìn)程，從而抑制CC的進(jìn)展。

2.7 Six1與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) 化療耐藥是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)化療失敗的主要障礙，為此尋找耐藥的原因就非常重要。據(jù)報道[21]，miR-186-5p與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NSCLC)的腫瘤發(fā)生和紫杉醇耐藥有關(guān)。然而，miR-186-5p是否參與了NSCLC對順鉑(DDP)的耐藥仍未公開。RT-qPCR和Western blot檢測miR-186-5p和Six1的表達(dá)。體外用MTT法測定DDP的50%抑制濃度(IC50)和細(xì)胞增殖。采用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)法檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞遷移、侵襲能力。在軟件上預(yù)測miR-186-5p與Six1之間的靶結(jié)合，并通過雙熒光素酶報告基因分析和RNA免疫沉淀證實(shí)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行異種移植以監(jiān)測腫瘤的生長。耐DDP NSCLC組織和細(xì)胞(A549/DDP和H1299/DDP)中miR-186-5p表達(dá)下調(diào)。在功能上，miR-186-5p過表達(dá)可抑制A549/DDP和H1299/DDP細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提高細(xì)胞凋亡率。在機(jī)械上，Six1為miR-186-5p的下游靶點(diǎn)，并在A549/DDP和H1299/DDP細(xì)胞中高度表達(dá)。同樣，Six1基因的下調(diào)也可以抑制DDP耐藥NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡率，而這是被miR-186-5p下調(diào)所逆轉(zhuǎn)的。此外，A549/DDP細(xì)胞誘導(dǎo)的移植瘤具有順鉑耐藥，而過表達(dá)miR-186-5p在DDP處理下可抑制腫瘤生長?？傊琺iR-186-5p的上調(diào)可能通過靶向Six1在體內(nèi)和體外抑制了DDP耐藥NSCLC細(xì)胞對順鉑的耐藥性。

2.8 Six1與甲狀腺乳頭狀癌(PTC) Six1作為視網(wǎng)膜決定基因網(wǎng)絡(luò)(RDGN)的關(guān)鍵成員，被認(rèn)為是各種癌癥的腫瘤啟動子。然而，其在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中的作用從未被研究過。Kong等[22]研究采用甲狀腺癌組織微陣列染色法鑒定Six1及其共激活因子EYA1的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，Six1和EYA1的高表達(dá)與惡性腫瘤相關(guān)。在甲狀腺癌組織芯片中，Six1與EYA1密切相關(guān)。功能測定表明，Six1通過在轉(zhuǎn)錄后水平穩(wěn)定EYA1而增加了EYA1表達(dá)。此外，Six1通過激活STAT3信號及其下游靶點(diǎn)以EYA1依賴的方式促進(jìn)甲狀腺癌的增殖和侵襲。Six1可以通過激活經(jīng)典的STAT3信號，與EYA1整合，促進(jìn)PTC的發(fā)展。

2.9 Six1與前列腺癌(PCa) 越來越多的證據(jù)表明，Six1的過表達(dá)在腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。然而，Six1的表達(dá)狀態(tài)及其與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系尚不清楚。此研究檢測了前列腺癌組織和正常前列腺組織中Six1的mRNA及蛋白水平。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(IHC)對前列腺癌組織芯片進(jìn)行臨床病理意義的研究。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析Six1蛋白表達(dá)與前列腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。與正常前列腺組織相比，大多數(shù)前列腺癌患者的Six1蛋白表達(dá)增加。Six1高表達(dá)患者與高組織學(xué)分級(χ2=58.651,P=0.00)，高臨床分期(χ2=57.330,P=0.000)，高格里森評分(χ2=63.480,P=0.000)，高原發(fā)腫瘤分級(χ2=57.330,P=0.000)和陽性區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=19.294,P=0.000)。此外，單變量和多變量生存分析表明，Six1是對總生存期一個獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)(P<0.05)。Six1用于識別有腫瘤進(jìn)展風(fēng)險的前列腺癌患者，可能用于預(yù)測前列腺癌患者的生存結(jié)果[23]。許多研究表明，miR-30a的下調(diào)存在于包括前列腺癌(PCa)在內(nèi)的多種癌癥中。Zhu等[24]研究miR-30a在PCa細(xì)胞系中的生物學(xué)功能和分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)miR-30a在PCa組織和細(xì)胞系中被下調(diào)。此外，低水平的miR-30a與前列腺癌組織和細(xì)胞系中Six1的表達(dá)增加有關(guān)。miR-30a的上調(diào)顯著抑制PCa細(xì)胞的增殖。過表達(dá)miR-30a可以抑制PCa細(xì)胞的侵襲。然而，miR-30a的下調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞的生長和PCa細(xì)胞的侵襲。生物信息學(xué)分析預(yù)測，Six1可能是miR-30a的靶基因。接下來，熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-30a可以直接靶向Six1。與miR-30a的作用一致，siRNA下調(diào)Six1可以抑制PCa細(xì)胞的增殖和侵襲。在PCa細(xì)胞中過表達(dá)的Six1部分逆轉(zhuǎn)了miR-30a模擬物的作用。綜上所述，miR-30a的引入通過下調(diào)Six1的表達(dá)顯著抑制了PCa細(xì)胞的增殖和侵襲，而下調(diào)Six1對于過表達(dá)miR-30a抑制細(xì)胞生長和侵襲PCa細(xì)胞至關(guān)重要。

3 結(jié)語

目前研究發(fā)現(xiàn)，Six1在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中產(chǎn)生作用，與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。異常表達(dá)的Six1基因可以通過多種信號通路導(dǎo)致正常細(xì)胞的凋亡與增殖失衡，上游調(diào)控因子的異常表達(dá)導(dǎo)致Six1的功能失調(diào)，而Six1異常表達(dá)作用于其靶基因CyclinA1、TGF-β等，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近來對Six1基因的上游調(diào)控機(jī)制以及Six1下游的靶基因有了很大突破，解釋了Six1基因在信號通路間的分子機(jī)制，為了解惡性腫瘤具體的發(fā)病機(jī)制，尋找新的腫瘤標(biāo)志物提供新的思路。