諾如病毒檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

孫志強(qiáng),黃志成,王 修,陳 健

(吉林省腫瘤醫(yī)院,吉林 長春130012)

諾如病毒(NV)，是人類杯狀病毒科中諾如病毒屬的一種病毒，是一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。在全球均有因諾如病毒感染導(dǎo)致爆發(fā)性腹瀉的發(fā)生，且該病毒易感性強(qiáng)，傳播速度快，故尋找到合適方法進(jìn)行諾如病毒的檢測也尤為重要。這也為臨床疾病診斷及實驗室檢查提供了依據(jù)。目前通過電鏡法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、都可以較好地實現(xiàn)對諾如病毒的檢測，這為后續(xù)諾如病毒感染性疾病的治療奠定了良好的基礎(chǔ)。在諾如病毒的檢測中，因反應(yīng)特異性及靈敏度較高，可檢測出諾如病毒的不同分型，使諾如病毒疫苗及治療藥物的研發(fā)更加具有針對性，在臨床應(yīng)用方面產(chǎn)生更高價值。因此，檢測諾如病毒對疾病的診斷治療及隨后控制傳染性疾病的爆發(fā)具有高度的指導(dǎo)意義?？梢姡Z如病毒的檢測在實驗室及臨床研究中都是十分必要的。

1 病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

諾如病毒屬杯狀病毒科，諾如病毒屬，基因組長度約7.5-7.7 kb的單股正鏈RNA病毒，直徑約27-37 nm，無囊膜。其5＇端以共價鍵方式通過病毒末端結(jié)合蛋白結(jié)合，3＇端有多聚A尾[1]。諾如病毒共有3個開放閱讀框，ORF-1編碼非結(jié)構(gòu)多聚蛋白，長約5 kb，ORF-2編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白 VP1，長約1.8 kb，ORF-3編碼強(qiáng)堿性微小結(jié)構(gòu)蛋白，長約0.6 kb[2]。該病毒的衣殼蛋白為二十面體對稱結(jié)構(gòu)，由180個分子折疊成 90個二聚體構(gòu)成。衣殼蛋白分為突出區(qū)(P區(qū))和外殼區(qū)(S區(qū))，其中P區(qū)包含P1區(qū)和P2區(qū)，即拱干和拱頂。P2區(qū)因包含血型組織抗原結(jié)合序列和碳水化合物結(jié)合序列，故其屬于最可變區(qū)[3]。

2 發(fā)病機(jī)制

諾如病毒感染傳播途徑為糞-口傳播。其耐酸性較強(qiáng)，故能在人體上消化道定植并復(fù)制，其中信使RNA為病毒RNA[4]。諾如病毒受體是位于腸道黏膜表面的人類組織血型抗原。在感染時，人類組織血型抗原和諾如病毒衣殼蛋白VP1的突出區(qū)(P)的末端相結(jié)合。人類組織血型抗原中存在α-1,2糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT2)的個體，更易感染諾如病毒。當(dāng)人體不表達(dá)或缺失編碼轉(zhuǎn)移酶的基因時，機(jī)體則不感染諾如病毒[5]。

3 檢測技術(shù)

3.1 電鏡法

電鏡法為諾如病毒最早檢出的方法，因其靈敏度相對較低，同時要求較高的操作技術(shù)，故標(biāo)本中病毒的檢測范圍須≥106才可檢出。因此，并不適用于臨床診斷[6]。

3.2 免疫學(xué)檢測

3.2.1ELISA法 檢測諾如病毒主要是通過抗原抗體反應(yīng)[7]。固相上包被有諾如病毒特異性單(多)克隆抗體，標(biāo)本中諾如病毒衣殼抗原被捕獲后，用標(biāo)記的抗諾如病毒特異性多克隆抗體進(jìn)行檢測。目前利用此技術(shù)的檢測試劑盒已被臨床廣泛應(yīng)用[8]。Morillo SG等[9]將306例人體糞便標(biāo)本用RIDASCREEN第三代諾如病毒ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示特異性為90.9%-96.4%，靈敏度為43.8%-97.1%。該方法檢測諾如病毒節(jié)約時間，節(jié)約成本，操作簡便。檢測下限約為105拷貝/ml。ELISA法可能會顯示假陰性或假陽性結(jié)果，這是由于各種抗原抗體種類及結(jié)構(gòu)不同[10]。因諾如病毒該方法的檢測在特異性和靈敏度上仍有欠缺，同時病毒抗原易變異，故在檢測中被認(rèn)定為篩查試驗，仍需進(jìn)行以分子生物學(xué)檢測為主的確認(rèn)試驗。

3.2.2免疫層析技術(shù) 該技術(shù)可用于快速檢測諾如病毒，結(jié)合了免疫親和作用及層析技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)在于節(jié)約時間，操作方便，因此廣泛用于臨床檢測。免疫層析技術(shù)是利用試紙條，其上有利用諾如病毒抗原制備的單抗或多抗，來進(jìn)行檢測[11]。Takanashia S等[12]利用該方法檢測諾如病毒。檢測試劑盒中為以重組樣病毒基因亞型GII-3或GII-4為抗原制備的多克隆抗體，標(biāo)本中病毒復(fù)合物在測試線上，可捕獲抗體，并與抗體結(jié)合后反應(yīng)。硝酸纖維薄膜上涂有測試線條。用蒸餾水按一定倍數(shù)稀釋樣品，制成10%稀釋液，并將等量稀釋液與等量緩沖液混合均勻。將試紙條放入檢測試劑盒內(nèi)，混合物在毛細(xì)作用下沿條帶上升。15分鐘后，陽性為兩條區(qū)帶，陰性為一條區(qū)帶。因其節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)，多種免疫層析試劑盒已在國外廣泛應(yīng)用。Pombubpa K等[13]利用免疫層析技術(shù)檢測急性胃腸炎患者糞便中的諾如病毒，此種試劑盒靈敏度可達(dá)83.3%，特異性為87.5%。在用于檢測諾如病毒的標(biāo)本中，仍有12.5%的陰性樣品被誤檢為假陽性。因此，臨床上在檢測諾如病毒時，也常采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測，并將其認(rèn)定為諾如病毒檢測中的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

3.3 分子生物學(xué)檢測

3.3.1常規(guī)RT-PCR 常規(guī)RT-PCR技術(shù)在臨床上應(yīng)用廣泛，靈敏度較高，操作簡便，成本較低[14]。此技術(shù)是指隨核酸擴(kuò)增，累積擴(kuò)增產(chǎn)物，在檢測中或分析前，隨熱循環(huán)結(jié)束即達(dá)到平臺。利用該技術(shù)檢測諾如病毒時，可產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過不同的長度來鑒別不同的PCR產(chǎn)物[15]。該技術(shù)也可區(qū)分出諾如病毒不同的類型，通過病毒mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，即mRNA→cDNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增實現(xiàn)對目的基因的表達(dá)，使檢測靈敏度得以提升。同時，進(jìn)行序列比對，提高試驗的特異性[16]。劉翼等[17]在RNA聚合酶基因區(qū)以Koopmans引物JV12Y/JV13I來應(yīng)用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行諾如病毒檢測，RNA對該區(qū)具有依賴性。以358份腹瀉患兒糞便為檢測標(biāo)本，對共42份諾如病毒陽性標(biāo)本抽出11份進(jìn)行測序，在DNA序列數(shù)據(jù)庫中比對分析，結(jié)果表明為諾如病毒。早期，RT-PCR技術(shù)會存在樣品污染的情況，這是由于擴(kuò)增產(chǎn)物時需開放環(huán)境；同時，此技術(shù)在檢測諾如病毒時，變異率較高。后因型特異性引物的引進(jìn)，情況得到大大改善。

3.3.2多重RT-PCR 多重RT-PCR，于相同反應(yīng)體系，以同一DNA模板不同區(qū)段或不同模板進(jìn)行擴(kuò)增，同時需要不同的特異性引物。此法可檢測出諾如病毒的不同分型。該方法節(jié)約時間，節(jié)省成本，可同時實現(xiàn)多種病毒檢測，但靈敏度不高[18]。Khamrin P等[19]利用多重RT-PCR技術(shù)對10種病毒導(dǎo)致腹瀉的糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測，設(shè)計PCR引物后得到不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物片段，從而判斷不同種類的病毒。Shigemoto N等[20]對71例急性胃腸炎患者的糞便標(biāo)本進(jìn)行諾如病毒檢測，利用多重 RT-PCR 技術(shù)，以諾如病毒衣殼蛋白區(qū)及聚合酶區(qū)序列設(shè)計PCR引物。在確診了諾如病毒感染的61例標(biāo)本中，其檢出率可達(dá)96.7%。Zhang等[21]對兩個公司研發(fā)的多重檢測技術(shù)平臺進(jìn)行了調(diào)查，即BioFire公司和Luminex 公司。兩公司研究開發(fā)的薄膜陣列式胃腸檢測系統(tǒng)和胃腸道病菌檢測系統(tǒng)，均對諾如病毒的檢測有效，且檢測靈敏度有所提升。此類應(yīng)用多重RT-PCR技術(shù)的檢測系統(tǒng)，可廣泛應(yīng)用于在多種病原體之間諾如病毒的檢測。應(yīng)用此類系統(tǒng)時，操作迅速，且樣品處理時間短[22]。多重RT-PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對諾如病毒感染性疾病的檢測和臨床診斷都有重要的指導(dǎo)意義。

3.3.3熒光RT-PCR 熒光RT-PCR，即目標(biāo)探針耦聯(lián)有熒光染料，用來檢測所生成的不同核酸，其中目標(biāo)探針具有特異性。擴(kuò)增產(chǎn)物在反應(yīng)階段的任何PCR循環(huán)中均可產(chǎn)生，且具有較高的特異性和靈敏度[23]。諾如病毒中存在一靶向引物，可參與反應(yīng)對諾如病毒基因型進(jìn)行檢測，且反應(yīng)靈敏，迅速。該引物位于基因區(qū)最保守的區(qū)域，即開放性讀碼框ORF1/2連接區(qū)[24，25]。雖然是在最保守區(qū)域，諾如病毒單核苷酸千變?nèi)f化，且無法估計，同時，根據(jù)此區(qū)域設(shè)計的探針和引物在檢測諾如病毒的突變株時是否具有相同的反應(yīng)靈敏性，這也無法保證[26]。故在不同的檢測過程中，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整探針和引物。Miura T等[27]應(yīng)用熒光RT-PCR技術(shù)，對幾組糞便標(biāo)本中3種不同的諾如病毒同時進(jìn)行檢測。反應(yīng)階段設(shè)計3對不同的引物，在熒光染色過程中，應(yīng)用相同熒光染料，可以使反應(yīng)的特異性和靈敏度大大增強(qiáng)。這是由于此方法可疊加3種基因組不同諾如病毒的熒光信號。與其他RT-PCR技術(shù)的檢測結(jié)果相同，糞便標(biāo)本中可檢測出諾如病毒?，F(xiàn)已根據(jù)此技術(shù)研發(fā)出多種檢測試劑盒，如德國RIDAGENE試劑盒，其可檢測出多種不同分型的諾如病毒[28]?，F(xiàn)已進(jìn)行的諾如病毒GIV型熒光RT-PCR檢測，在全世界臨床檢測診斷及實驗室研究中已大規(guī)模應(yīng)用[29,30]。

4 小結(jié)

在諾如病毒的檢測中，電鏡法因靈敏度較低，操作要求較高，而不被廣泛使用。免疫學(xué)方法操作簡便，并且可節(jié)約時間，可進(jìn)行諾如病毒的初步篩查及快速檢測，但其靈敏度及特異性仍欠佳。分子生物學(xué)法被認(rèn)定為諾如病毒檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有良好的特異性及靈敏度，檢測結(jié)果也較為準(zhǔn)確，但技術(shù)水平要求相對嚴(yán)格。為了更準(zhǔn)確地檢測諾如病毒，目前實驗室研究中嘗試?yán)没蛐酒?，基因探測等方法進(jìn)行諾如病毒的檢測。同時，可應(yīng)用互聯(lián)網(wǎng)系統(tǒng)，不同實驗人員檢測不同標(biāo)本不同分型的諾如病毒時，可將特異性較強(qiáng)的檢測結(jié)果輸入到系統(tǒng)中，建立諾如病毒數(shù)據(jù)庫，增加樣本的多樣性，供研究人員進(jìn)行比對分析，從而研制出新的諾如病毒疫苗。但是，目前研究還面臨著一定的問題，例如人體感染諾如病毒后，是否在病毒迅速繁殖的過程中，機(jī)體出現(xiàn)了強(qiáng)耐藥性或是否免疫力發(fā)生了改變等。因此，諾如病毒的檢測技術(shù)仍然存在不足。最重要及最有效的方式仍是采取一定行動，加強(qiáng)對諾如病毒的預(yù)防，并減少諾如病毒的傳播。