血流感染的實驗室分子診斷研究進(jìn)展

陳明慧，陳莎燕，房 杰，孫蘭菊，常艷敏

血流感染（bloodstream infection，BSI）是病原微生物侵入血液循環(huán)而引起的嚴(yán)重的全身感染性疾病[1]，具有起病急驟、病死率高的特點。近年來,隨著靜脈置管等侵入性操作和廣譜抗生素及免疫抑制劑等藥物的廣泛應(yīng)用，血流感染的發(fā)生率和嚴(yán)重程度逐年升高。在世界范圍內(nèi)，血流感染是北美和歐洲排名前七的死亡原因[2]，其公共衛(wèi)生問題日益嚴(yán)重。血流感染死亡率的上升往往與抗感染治療的延遲，不足或不適當(dāng)有關(guān)，在抗生素治療中，感染性休克后每延遲6 h，生存率就會降低7%以上[3]。

目前，血培養(yǎng)被認(rèn)為是診斷血流感染的參考標(biāo)準(zhǔn)，并且仍然是必不可少的。在取夠足量的標(biāo)本（即至少兩到三套血培養(yǎng)瓶，每瓶裝滿10 mL）的情況下，血培養(yǎng)的靈敏度可達(dá)95%以上，且操作方便，亦可良好地顯示培養(yǎng)病原體對抗菌藥物的敏感性。但是，血培養(yǎng)也具有一些缺點，如檢測周期長，無法識別細(xì)菌或酵母菌以外的生長緩慢或?qū)Ｐ缘募?xì)胞內(nèi)微生物和病原體，以及以前曾接受過抗菌藥物治療的患者，其血流感染相關(guān)的微生物檢測可能大幅延遲或甚至無法檢測到。這些缺點可能導(dǎo)致重要的后果：首先，盡早地對血流感染開始適當(dāng)?shù)目股刂委煟绕湓谂R床診斷后的第1 小時內(nèi)，對降低發(fā)病率和死亡率至關(guān)重要；其次，由于以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的診斷很慢，醫(yī)生經(jīng)常不得不開始憑經(jīng)驗使用廣譜抗菌治療；此外，較長的培養(yǎng)時間也導(dǎo)致確切的臨床診斷延遲，住院時間增加，并發(fā)癥發(fā)生率提高，從而最終增加醫(yī)療費用。因此，臨床迫切需要快速檢測和鑒定病原體，從而優(yōu)化抗菌治療的療效，降低初始治療附帶的損害，例如毒性，副作用和抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生。

因此，十多年來用于早期識別病原體和一些耐藥因子的病原體特異性檢測已經(jīng)被測試和開發(fā)出來。這些分子工具已被測試作為血培養(yǎng)的替代或補(bǔ)充[4]。根據(jù)陽性血培養(yǎng)的革蘭染色結(jié)果，微生物實驗室可以決定使用哪種特定分子方法以滿足他們的需求。本綜述介紹了診斷血流感染的分子方法的最新進(jìn)展。

1 從陽性血培養(yǎng)物鑒定病原菌的分子方法

1.1 基于原位雜交的方法 雜交測定是兩條互補(bǔ)核酸鏈的特異性結(jié)合，其中一條探針是已知特性的核酸序列，另一條靶序列是待鑒定的未知微生物的基因組的一部分，熒光原位雜交（FISH）測定即基于該原理。在FISH 中，熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針用于特異性結(jié)合靶病原體基因組中的核糖體DNA（rDNA）區(qū)域，即細(xì)菌的16S rDNA 基因或真菌的18S rDNA 基因，通過熒光顯微鏡觀察探針和互補(bǔ)序列之間的這種特異性結(jié)合。雖然FISH 技術(shù)可以識別血液中最常見的細(xì)菌和酵母，但由于檢測中可用的物種特異性探針數(shù)量有限，因此不能鑒定所有致病菌[5]。

第一個商業(yè)化的基于FISH 的技術(shù)是PNA-FISH，使用肽核酸探針（PNA）可檢測金黃色葡萄球菌，凝固酶陰性葡萄球菌，屎腸球菌，大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌和念珠菌等臨床常見的血流感染病原菌。PNA-FISH 可在2.5 h 內(nèi)提供結(jié)果，并于2013 年推出更快，更節(jié)約勞動力的版本Quick FISH，提供結(jié)果僅需不到30 min[6]。但PNA-FISH的缺點為病原菌數(shù)量的檢測限（LOD）需達(dá)到105CFU/mL，PNA-FISH 探針數(shù)量有限，以及缺乏所鑒定微生物的抗菌藥物敏感性[7]。PNA-FISH 和Quick FISH 的敏感性和特異性分別為97%～100%和90%～100%。

Accu Probe 系統(tǒng)也是基于DNA 探針的雜交。Gen-Probe 商業(yè)化測試可鑒定金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，腸球菌屬及A 群和B 群鏈球菌。起初開發(fā)這些測試用于鑒定培養(yǎng)物中的病原體; 然而，Lindholm 及其同事修改了制造商的標(biāo)本制備說明，可使用直接用陽性血培養(yǎng)物制成的細(xì)菌顆粒。對于大多數(shù)病原體的檢測，靈敏度和特異性顯示高于97.9%，測試時間為1 h[8]。

1.2 基于DNA 微陣列的雜交技術(shù) DNA 微陣列由固定在固體表面上的短寡核苷酸組成，它們可同時并行檢測許多病原體及其抗菌藥物的耐藥基因。DNA 微陣列覆蓋的物種一般約為已知引起血流感染的所有病原體的90%～95%，靈敏度范圍為101～105CFU/ mL[9]。Verigene 系統(tǒng)是美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的基于DNA 微陣列的檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)可鑒定12 種革蘭氏陽性細(xì)菌以及相關(guān)的耐藥基因（vanA，vanB，mecA），和9 種革蘭氏陰性菌及它們的耐藥基因（bla VIM，bla NDM，bla OXA，bla KPC和bla CTX-M）。該系統(tǒng)可以直接從陽性血培養(yǎng)物中識別細(xì)菌種類以及相關(guān)的耐藥基因，靈敏度為81%～100%，特異性高于98%[10]，測試時間為2.5 h。日本的一項研究表明，在由Verigene 試驗靶向的單一病原體引起的菌血癥中，Verigene 試驗與血培養(yǎng)之間的細(xì)菌鑒定一致性很高，革蘭陽性菌和革蘭陰性菌分別達(dá)97.4%和100%[11]。然而，如果血培養(yǎng)中病原菌并非單一菌種，出現(xiàn)混合菌生長，Verigene 系統(tǒng)則無法檢測到耐藥基因與特定病原體的關(guān)聯(lián)[12]。

1.3 基于核酸擴(kuò)增的方法 最常用的核酸擴(kuò)增技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），用于直接從血液以及陽性血培養(yǎng)物中鑒定病原體。診斷實驗室中使用的PCR 測試基于廣譜PCR或多重PCR。廣譜PCR 使用針對細(xì)菌（16S）或真菌（18S）基因組的保守rDNA 區(qū)域的通用引物，隨后通過測序或?qū)?種特異性實時PCR 測定鑒定微生物。常見的有FilmArray系統(tǒng)和Xpert MRSA/ SA 系統(tǒng)。

Film Array 是一個自動化多重PCR 平臺，它結(jié)合了樣品制備，PCR 擴(kuò)增，檢測和分析。Film Array 血液培養(yǎng)鑒定小組（BCID）可以在1 h 內(nèi)識別來自陽性血培養(yǎng)物的19 種細(xì)菌和5 種念珠菌以及4 種耐藥基因（vanA，vanB，mecA，bla KPC），實際操作時間僅需2 min。在一項隨機(jī)對照試驗中，所有微生物靶標(biāo)的敏感性均超過96%，特異性為99%。耐藥基因vanA/B，bla KPC 的鑒定敏感性和特異性達(dá)100%。但是，可產(chǎn)生對金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌中mecA 基因檢測的假陽性結(jié)果[13]。

Xpert MRSA/SA 檢測基于實時PCR，可在約1 h 內(nèi)鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）。該試驗通過檢測葡萄球菌蛋白A（spa）基因，耐甲氧西林（mecA）基因以及攜帶mecA基因的葡萄球菌染色體盒（SCCmec）和金黃色葡萄球菌基因組（orfX）之間的連接序列，進(jìn)一步分析鑒定是否為MRSA。據(jù)報道，對于金黃色葡萄球菌，鑒定的敏感性和特異性分別為99.6%和99.5%，MRSA 分別為98.1%和99.6%[14]。

1.4 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS） 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）徹底改變了細(xì)菌鑒定方法，這種方法廣泛應(yīng)用于臨床微生物實驗室。其原理是將基質(zhì)和樣品混合點在金屬靶盤上形成共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)分子吸收激光的能量使樣品吸附，并使其發(fā)生軟電離，形成不同質(zhì)荷比(m/z)的帶電離子。在電場作用下，樣品離子通過高真空的飛行時間管到達(dá)檢測器，質(zhì)荷比越小，時間越短；根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同，以質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)，檢測到的離子峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行質(zhì)量分析，形成質(zhì)量圖譜，通過軟件分析比較，篩選并確定出特異性圖譜，從而實現(xiàn)對目標(biāo)微生物種或菌株的鑒定[15]。MALDI-TOF MS 能夠識別多種微生物，快速獲得結(jié)果，具有較高的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性且滿足成本效益。市場上有兩種主要的商業(yè)系統(tǒng)：法國梅里埃Vitek MS 和德國布魯克Microflex LT Biotyper 質(zhì)譜檢測系統(tǒng)。

MALDI-TOF MS 對革蘭氏陰性菌如腸桿菌科細(xì)菌，非發(fā)酵菌等鑒定準(zhǔn)確率高，與VITEK-2 的鑒定符合率達(dá)95.83%[16]；對厭氧菌[17]和結(jié)核分枝桿菌[18]的分析和鑒定較傳統(tǒng)方法有明顯優(yōu)勢；MALDI-TOF MS 還可檢測微生物的耐藥性，主要方法有直接分析法，酶水解法和曲線下面積計算法等[19-21]。然而，MALDI-TOF MS 在微生物鑒定和藥敏中依然存在一定的局限性，如MALDI-TOF MS的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫還需完善，對某些病原菌的亞種及少見菌鑒定會存在誤差，目前臨床使用的商品化數(shù)據(jù)庫主要來自梅里埃和布魯克兩大廠家，且多為國際菌株，難以滿足本土化的微生物鑒定需求；雖然目前已有許多關(guān)于細(xì)菌耐藥檢測方面的研究，但是尚處于起步階段，距離應(yīng)用于臨床還需很多工作；國內(nèi)實驗室該技術(shù)應(yīng)用尚處于初級階段，各臨床實驗室的操作習(xí)慣不同可能會直接影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，因此MALDI-TOF MS 的操作標(biāo)準(zhǔn)化問題也亟待解決。

2 直接從血液中鑒定病原菌的分子方法

直接在全血樣品上進(jìn)行的分子方法可以節(jié)省孵育的時間，避免在識別生長緩慢的細(xì)菌或無法培養(yǎng)的微生物時，以及在患者已經(jīng)接受抗菌藥物的情況下對血培養(yǎng)的限制。此外，與血培養(yǎng)相比，對于難以獲得更大量血液的兒科患者，僅需較少量的血液樣本使得這些分子方法更具優(yōu)勢[22]。然而，為檢測微生物而開發(fā)的分子方法主要基于PCR 的分析，患者血液中存在大量人類DNA 以及其他血液成分，會干擾并抑制PCR 反應(yīng)。盡管PCR 測定通常非常敏感，但污染DNA 或來自死亡微生物的DNA，可能導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性結(jié)果。在這里，我們將對常用的分子方法進(jìn)行闡述。

2.1 基于核酸擴(kuò)增的方法 羅氏Septi Fast 是采用多重實時PCR 技術(shù)。該試驗?zāi)軌蛟诩s6 h 內(nèi)直接從1.5 mL 全血中鑒定最常見的血流感染病原體，包括19 種細(xì)菌和6 種真菌。在一項診斷兒童發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少癥的研究中，顯示Septi Fast 試驗的敏感性和特異性分別為91%和98.3%[23]。因此，基于PCR 的檢測可用于采血困難的兒童，可彌補(bǔ)血培養(yǎng)需采集大量血液的缺陷。

Sepsi Test 系統(tǒng)是經(jīng)CE 認(rèn)證的檢測方法，結(jié)合了廣譜PCR 和測序技術(shù)。該測試使用針對細(xì)菌16SrDNA 和真菌18S rDNA 區(qū)域的通用引物進(jìn)行廣譜PCR，然后對來自陽性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，隨后進(jìn)行BLAST 分析以鑒定屬和物種水平的病原體。該檢測可處理低至1 mL 的血液量，所需時間為8～12 h。一項研究報告顯示，Sepsi Test系統(tǒng)的特異性和敏感性分別為86%和48%[24]。

2.2 基于T2 磁共振的方法

T2 磁共振是一種基于磁共振的診斷方法，可測量存在磁場時水質(zhì)子T2 張弛信號的變化。其方法為病原體特異性PCR 擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增子與富含探針的超順磁性納米顆粒雜交。一項近期的研究[25]表明，T2 磁共振診斷可用于檢測細(xì)菌和念珠菌引起的血流感染，在檢測到的細(xì)菌血培養(yǎng)陽性患者中，敏感性和特異性分別為89%和98%。

2.3 宏基因組學(xué)方法 宏基因組學(xué)是對被檢測樣品中存在的特定或所有遺傳物質(zhì)的基因組進(jìn)行分析，樣品中核酸的測序可以基于特定擴(kuò)增子或整個基因組（鳥槍宏基因組學(xué)）?；谔囟〝U(kuò)增子的方法雖已證明可直接從血液中診斷細(xì)菌，但目前為止還沒有開發(fā)出商業(yè)上可獲得的方法。鳥槍宏基因組學(xué)具有不受某些病原體限制的優(yōu)點，并且提供樣品中存在的所有微生物和病毒的信息[26]。此外，鳥槍宏基因組學(xué)可以檢測抗菌素耐藥性和毒力基因，并提供有關(guān)分子流行病學(xué)的重要信息。到目前為止，獵槍宏基因組學(xué)僅適用于血液或血液成分，并且只開發(fā)了一種商用工具，臨床實驗室的引入可能會受到高成本，分批測試方法和測序所需的復(fù)雜的基礎(chǔ)設(shè)施的限制。

綜上所述，血流感染的實驗室分子診斷技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地對血流感染病原體進(jìn)行鑒定，彌補(bǔ)傳統(tǒng)血培養(yǎng)的固有缺陷，但其一些技術(shù)方法尤其是藥敏分析尚需完善，且具有高昂的成本，無法完全替代血培養(yǎng)。因此，血流感染的診斷可聯(lián)合多種新型分子診斷技術(shù)和傳統(tǒng)方法，從而提高血流感染診斷的時效性和準(zhǔn)確性，為血流感染患者的早期診斷和合理用藥提供重要參考。