肝細(xì)胞癌的基因組學(xué)和基因靶向治療的研究進(jìn)展

王文晶 曹國洪

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上常見的惡性腫瘤之一。近年來對HCC基因組學(xué)的研究已取得一定進(jìn)展，本文總結(jié)了HCC病因相關(guān)基因、HCC特異血清指標(biāo)甲胎蛋白（AFP）相關(guān)基因、HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等研究成果。另外通過構(gòu)建HCC特異基因模型，尋找HCC治療的新靶點新方法。本文就此作出如下綜述。

1 HCC發(fā)生、發(fā)展的基因組學(xué)

1.1 HCC病因相關(guān)基因研究 目前已知HCC的發(fā)生與病毒感染、致癌物污染以及遺傳因素有關(guān)。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染在我國HCC病因中占主導(dǎo)地位，其次為強(qiáng)致癌劑黃曲霉素 B1（aflatoxin b1,AFB1），另外一些HCC患者具有家族聚集性和遺傳易感性。總之，HCC的發(fā)生涉及多因素多步驟的癌變過程。早前研究發(fā)現(xiàn)HBV的DNA可整合入人體HCC細(xì)胞的DNA中，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)HCC組織中HBV-DNA的整合率遠(yuǎn)高于正常肝組織，且此現(xiàn)象具有高度易變性和隨機(jī)性[1]。通過對81例HBV陽性HCC患者行全基因組測序，研究者發(fā)現(xiàn)HBV陽性者癌組織86.4%有HBV-DNA的整合，而癌旁組織僅有30.7%；同時發(fā)現(xiàn)在整合位點區(qū)域有較多基因拷貝數(shù)目變異，其中最主要的3個為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）、mixed-lineage leukemia（MLL4）gene、細(xì)胞周期蛋白 E1 基因（CCNE1）[2]。HBVDNA的整合可引起基因組置換、缺失和反向復(fù)制等改變，進(jìn)而影響細(xì)胞周期、分化和凋亡等功能，因此學(xué)者發(fā)現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測HBV-DNA含量變化具有一定意義。如肝動脈栓塞介入治療（TACE）可影響HBV-DNA含量的變化，一些學(xué)者對TACE治療前后HBV-DNA含量的變化進(jìn)行研究，認(rèn)為TACE治療可引起HBV-DNA的再活化[3]。同樣致病條件，不同人群所致結(jié)果不同，因此HCC的發(fā)生與個體間基因遺傳多態(tài)性有關(guān)，即易感基因。經(jīng)統(tǒng)計HCC發(fā)生的性別差異在HBV病例中最為明顯，男性更易發(fā)展為HCC。男性HCC發(fā)病率為3.7～31.9/10萬例/年，女性為1.4～10.2/10萬例/年[4]。HBV攜帶者中，較高的雄激素通路活性與男性HCC高發(fā)病率相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)雄激素受體通過整合HBV在TERT啟動子區(qū)的點突變來增強(qiáng)TERT效應(yīng)，被認(rèn)為是HBV相關(guān)HCC男性高發(fā)病率的機(jī)制，因此雄激素受體可能成為HCC治療的靶點[5]。

p53是一種腫瘤抑制基因，正常p53為野生型，可監(jiān)護(hù)細(xì)胞基因的完整性；p53突變體不僅喪失抑癌活性，反而具惡性轉(zhuǎn)化功能。HCC強(qiáng)致癌劑AFB1屬二氫呋喃雜萘的衍生物，研究發(fā)現(xiàn)AFB1可使部分p53發(fā)生突變生成p53-R249S，即p53第249位密碼子精氨酸（AGG）置換為絲氨酸（AGT）。在含p53突變的HCC中，p53-R249S發(fā)生率約為30%，且在HCC高危區(qū)的發(fā)生率超過96%[6]。另有研究提示HBV編碼的x蛋白(HBx)可能具有促進(jìn)HCC增殖作用，同時與p53-R249S相互作用促進(jìn)HCC生長[7]。

肝干細(xì)胞（hepatic progenitor cells，HPCs）在正常條件下是靜止的，且數(shù)量很少，在肝損傷時可復(fù)制分化為肝細(xì)胞。研究者在肝腫瘤和腫瘤前病變中觀察到HPCs的活化，認(rèn)為HPCs也是HCC的干細(xì)胞[8]。維生素D作為一種維持機(jī)體鈣和磷酸鹽穩(wěn)態(tài)的元素，經(jīng)肝腎的聯(lián)合活化成為維生素D3（VitD3）。研究發(fā)現(xiàn)AFB1可通過影響絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）和Hippo信號通路改變HPCs樣上皮細(xì)胞系WB-344細(xì)胞；VitD3通過激活A(yù)KT和關(guān)閉Hippo信號通路，來抑制AFB1誘導(dǎo)HPCs的擴(kuò)增，同時也驗證了VitD3可作為HCC的抗癌劑[9]。含PPPDE肽酶結(jié)構(gòu)域蛋白1（PPPDE1）可編碼人體凋亡前表達(dá)蛋白，有研究者發(fā)現(xiàn)敲除PPPDE1可以顯著阻斷人HCC的克隆生長和致瘤性，而且PPPDE1是p53蛋白及其下游凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，對p53有負(fù)性調(diào)節(jié)作用[10]。

HBV感染、強(qiáng)致癌劑AFB1等的相關(guān)研究，證實了HCC發(fā)生、發(fā)展與其密切相關(guān)，從而促使人類采取一定措施來預(yù)防，如HBV疫苗的普及、避免含AFB1食物的攝入等。

1.2 甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）相關(guān)基因研究AFP是胎兒肝細(xì)胞產(chǎn)生的一種特殊蛋白——糖蛋白，它是胎兒血清的正常成分，并發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞能合成AFP。AFP作為一種特異血清標(biāo)志物，已廣泛應(yīng)用于HCC的篩查、臨床診斷及預(yù)后復(fù)發(fā)的判斷。AFP-L3（甲胎蛋白異質(zhì)體）是AFP糖基化側(cè)鏈修飾后的產(chǎn)物之一，在HCC細(xì)胞中特異性高表達(dá)[11]。研究表明AFP在HCC的細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，AFP含量與HCC病灶體積、血管侵襲及分化程度等相關(guān)[12-13]。

miRNA是基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后具有調(diào)控作用的小分子RNA，研究者發(fā)現(xiàn)miR-202是一類具有抑癌基因特性的miRNA，能夠靶向介導(dǎo)原癌基因的增殖侵襲過程并抑制其表達(dá)，進(jìn)而抑制其增殖并誘導(dǎo)其凋亡[14]。研究顯示HCC患者血清中miR-202的表達(dá)量與血清中AFP、AFP-L3的含量呈負(fù)相關(guān)，這就說明miR-202的低表達(dá)與HCC的發(fā)生密切相關(guān)[15]。AFP作為一種常規(guī)腫瘤指標(biāo)廣泛應(yīng)用于臨床，但經(jīng)統(tǒng)計實際約30%左右的HCC患者AFP含量為陰性。AFP陰性HCC患者的基因機(jī)制如何，還需學(xué)者進(jìn)一步研究。

1.3 肝癌病理分級的相關(guān)基因研究 HCC的埃德蒙森-施泰納（Edmondson-Steiner）分級為Ⅰ～Ⅳ級，病理分級一般為高、中、低和未分化HCC，且HCC不同分化程度與預(yù)后密切相關(guān)。c-myc是myc基因家族的重要成員，c-myc既是一種可易位基因，又是一種可使細(xì)胞無限增殖、獲永生化功能促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因，c-myc與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)HCC組織中cmyc陽性表達(dá)率在低分化HCC中高于高分化HCC，在HCC伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者[16]。c-myc是不可控型p53的誘導(dǎo)物，可引起p53表達(dá)減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞失控增殖。

1.4 肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因研究 整合素αvβ3是整合素家族中的重要成員，作為內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的橋梁，通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、凋亡等功能，在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGFβ1）是參與腫瘤增值、侵襲轉(zhuǎn)移的重要生物因子，在HCC增殖和轉(zhuǎn)移中轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞的生長因子，與HCC的進(jìn)展有關(guān)。

研究者揭示HCC的轉(zhuǎn)移與骨橋蛋白（OPN）高表達(dá)有關(guān)，OPN通過與整合素αvβ3或 CD44結(jié)合，參與細(xì)胞黏附、信號傳導(dǎo)及運(yùn)動等生物學(xué)過程；OPN在伴轉(zhuǎn)移的HCC組織中呈顯著高表達(dá)，通過阻斷OPN的表達(dá)可延緩HCC的轉(zhuǎn)移[17]。經(jīng)OPN和 TGFβ1基因干擾的高轉(zhuǎn)移潛能HCC的肺轉(zhuǎn)移能力有明顯下降，且后者下降更加明顯，研究表明HCC轉(zhuǎn)移潛能的下降與 OPN和TGFβ1表達(dá)減少有關(guān)，此研究成果為HCC轉(zhuǎn)移和預(yù)后的基因預(yù)測奠定了基礎(chǔ)[18]。亦有研究者發(fā)現(xiàn)HCC組織和細(xì)胞系中母系表達(dá)基因2（MEG2）表達(dá)降低，MEG2通過抑制AKT磷酸化從而抑制HCC的生長和轉(zhuǎn)移，且MEG2表達(dá)的下調(diào)預(yù)示HCC患者的總生存率和無病生存率降低[19]。HCC的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)都離不開新生血管的形成，載脂蛋白 A-I結(jié)合蛋白（apoA-I binding protein,AIBP）可促進(jìn)清除內(nèi)皮細(xì)胞中的膽固醇，此過程可干擾血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR-2）的功能，進(jìn)而抑制血管生成[20]。HCC易發(fā)生肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移，如果能掌握HCC轉(zhuǎn)移機(jī)制，就能為HCC治療新靶點、為新型藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)，從而控制HCC復(fù)發(fā)、延長患者無病生存時間。

1.5 肝癌其他相關(guān)基因研究 HCC的形成過程極其復(fù)雜，包括染色體不穩(wěn)定性、癌基因表達(dá)激活、抑癌基因沉默和DNA修復(fù)系統(tǒng)失活等。DNA甲基化是指胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化，是重要的表觀遺傳學(xué)改變。通過檢測轉(zhuǎn)移抑制基因p15、SYK、TIMP-3、E-cadherin、RASSAF1 和腫瘤相關(guān)基因p53、RB1、WT1、p14、p16 啟動子區(qū)在肝癌、癌旁和正常肝組織的甲基化情況，研究者發(fā)現(xiàn)HCC組織有多個基因存在甲基化，且HCC組織甲基化水平較癌旁組織高[21]。

另外影響細(xì)胞增殖、侵襲的一些基因也與HCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。亮氨酸拉鏈EF-hand結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白1（LETM1）和叉頭框蛋白 Q1（FOXQ1）是與 HCC 細(xì)胞增殖密切相關(guān)的兩類基因。LETM1編碼產(chǎn)物是一類線粒體內(nèi)膜結(jié)合蛋白，其高表達(dá)可引起線粒體糖酵解增加、腺苷三磷酸（ATP）生成增多，引起磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）/AKT信號通路處于持續(xù)激活的狀態(tài)，PI3K/AKT是介導(dǎo)細(xì)胞增殖的信號通路，與多種細(xì)胞的異常增殖相關(guān)[22]。FOXQ1是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，涉及胚胎發(fā)育、糖類和脂類代謝、細(xì)胞周期調(diào)控等過程；其突變與腫瘤發(fā)生有關(guān)。FOXQ1可靶向下游cyclinD1、cmyc的啟動子區(qū)域并啟動基因的轉(zhuǎn)錄過程[23]。

跨膜蛋白3（IFITM3）是與HCC細(xì)胞侵襲相關(guān)的基因，IFITM3屬于干擾素誘導(dǎo)基因ISG，可以被干擾素和病毒誘導(dǎo)表達(dá)。IFITM3編碼產(chǎn)物是一類跨膜蛋白，可通過酪氨酸激酶（JAK）/STAT3信號通路增加基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)，通過MMP-9水解膠原蛋白和層粘連蛋白的功能造成胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)細(xì)胞侵襲[24]。

多種基因相關(guān)研究為解開HCC的發(fā)生、發(fā)展打開了大門，通過人類的逐步認(rèn)識及持續(xù)研究，HCC基因靶向治療相關(guān)研究也取得較快的發(fā)展。

2 HCC基因靶向治療相關(guān)研究

實驗常規(guī)細(xì)胞試劑：正常肝細(xì)胞株L02，AFP陽性人肝癌細(xì)胞株HepG2和Hep3B，AFP陰性人肝癌細(xì)胞株SMMC7721，AFP陰性的人宮頸癌 HeLa細(xì)胞。基因載體 pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK、p[HRE]AFP-Luc。

研究者通過構(gòu)建 AFP啟動子驅(qū)動的雙自殺基因（CD，TK）+AIBP基因過表達(dá)載體 pcDNA3.1-AFPAIBP-yCD/TK，并分別轉(zhuǎn)染Hep3B和SMMC7721，轉(zhuǎn)染后Hep3B細(xì)胞生長得到明顯抑制，但SMMC7721細(xì)胞生長不受影響；且AIBP表達(dá)在HCC細(xì)胞中下調(diào)，推測AIBP高表達(dá)可能抑制HCC新血管生成[25]。由此AIBP有望成為HCC抗血管生成的潛在靶點。

Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族成員，特點是其在正常組織沉默，而僅在各類腫瘤中有所表達(dá)，同樣在肝癌組織中 Survivin呈高表達(dá)[26]。研究者通過AFP siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示AFP表達(dá)下調(diào)，證明沉默AFP基因進(jìn)而抑制Survivin表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27]。通過構(gòu)建 pAFP-p53-EGFP重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HepG2、SMMC7721和HeLa細(xì)胞，研究者發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞p53蛋白表達(dá)量明顯高于SMMC7721和HeLa細(xì)胞，證明p53的表達(dá)具有細(xì)胞相對專一性，pAFP-P53-EGFP載體可專一性的作用于 AFP陽性肝癌細(xì)胞，引起HCC細(xì)胞周期阻滯和凋亡[28]。

研究者構(gòu)建靶向HCC自殺基因p[HRE]AFP-HSVTK和腫瘤細(xì)胞成像基因載體p[HRE]AFP-Luc，并將磁性納米顆粒四氧化三鐵-聚乙烯亞胺（Fe3O4@PEI）作為基因治療載體和磁流體熱療的介質(zhì)，結(jié)果顯示Fe3O4@PEI介導(dǎo)的體內(nèi)靶向基因治療和磁流體熱療的聯(lián)合治療能對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異高效的協(xié)同殺傷作用[29]。Fe3O4@PEI即能在交變磁場中可控升溫，同時又能作為基因載體對腫瘤進(jìn)行基因治療[30]。

HCC的發(fā)生、發(fā)展極其復(fù)雜，HBV感染、強(qiáng)致癌劑AFB1等病因研究已取得一定成果，AFP相關(guān)基因、HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等多種基因也進(jìn)入人們視野，但這僅僅是冰山一角。相信隨著HCC基因組學(xué)的開展和深入，將會給HCC研究帶來根本性變化，通過構(gòu)建與HCC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和預(yù)后相關(guān)的指標(biāo)體系分子分型，為臨床治療方案的選擇提供依據(jù)，研究HCC治療新靶點為新型藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)，為HCC的臨床治療及預(yù)防開拓新前景。