piRNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷、治療及預(yù)后評(píng)估方面作用的研究進(jìn)展

俞翀 張琦 陳晗瀟 張大宏

泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率較高，且多數(shù)缺少適宜的標(biāo)志物。PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類小RNA分子，與argonaute蛋白家族的PIWI亞家族相互作用，誘導(dǎo)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄沉默。目前對(duì)piRNA的產(chǎn)生及作用機(jī)制有了初步探索，piRNA/PIWI對(duì)生殖干細(xì)胞干性的維持、配子形成、胚胎發(fā)育等起重要調(diào)控作用。越來(lái)越多的研究表明，piRNA與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為腫瘤診斷與治療的新靶點(diǎn)。本文就piRNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷、治療及預(yù)后評(píng)估方面作用的研究進(jìn)展作一綜述。

1 piRNA概述

piRNA是最近在生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類小型非編碼 RNA，包含 24～31 個(gè)核苷酸（nucleotide，nt），具有5′端尿苷或第10個(gè)位置的腺苷偏倚，缺乏清晰的二級(jí)結(jié)構(gòu)基序[1]。與通常依靠RNaseⅢ型酶將雙鏈RNA前體轉(zhuǎn)化為功能性小RNA的miRNA和siRNA不同，成熟的piRNA通過(guò)獨(dú)特的生物合成過(guò)程從包含piRNA簇的初始轉(zhuǎn)錄物中衍生而來(lái)[2]。piRNA可以與PIWI蛋白結(jié)合形成piRNA/PIWI復(fù)合物，從而影響轉(zhuǎn)座子沉默、精子發(fā)生、基因重排、表觀遺傳調(diào)控、蛋白質(zhì)調(diào)控和生殖干細(xì)胞維持[3]。PIWI家族在多種生物中表現(xiàn)出高度保守的結(jié)構(gòu)和功能[4]，包括果蠅（PIWI、AGO3 蛋白）[5]、小鼠（MILI、MIWI和 MIWI2）[6-7]、線蟲（PRG-1、PRG-2）[8]、斑馬魚（ZILI、ZIWI）[9]和人（HILI、HIWI1、HIWI2、HIWIL3）[5，10-12]。最近研究表明，在某些人類癌癥中存在異常的piRNA或PIWI蛋白表達(dá)；一些piRNA/PIWI參與了腫瘤的發(fā)生，并與癌癥的預(yù)后相關(guān)[13-15]。

1.1 piRNA的生物合成機(jī)制

1.1.1 piRNA簇的轉(zhuǎn)錄 可以定位的大部分piRNA來(lái)自2種類型的擴(kuò)展基因組位點(diǎn)，稱為piRNA簇[16]。與編碼基因相似，單鏈基因簇包含以PolⅡSer5P和H3K4me2標(biāo)記的啟動(dòng)子，通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過(guò)5′末端加帽、3′末端聚腺苷酸化，有時(shí)還進(jìn)行選擇性剪接。相反地，雙鏈簇從2條基因組鏈中轉(zhuǎn)錄，由編碼基因附近的啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[2，16]。

1.1.2 產(chǎn)生piRNA的2條主要途徑 piRNA簇產(chǎn)生的初級(jí)piRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)[17]。Zucchini（Zuc）及其輔因子Minotaur（Mino）切開(kāi)初級(jí)piRNA，產(chǎn)生帶有5′尿嘧啶的piRNA中間體[18]。與PIWI蛋白結(jié)合后，piRNA會(huì)通過(guò)Zuc核糖核酸內(nèi)切酶的3′末端切割[19]或通過(guò)Papi依賴的三聚體而成熟。隨后經(jīng)Hen1介導(dǎo)的甲基化產(chǎn)生成熟的 piRNA/PIWI復(fù)合物[2，20]。

1.2 piRNA/PIWI復(fù)合物在腫瘤中的作用與機(jī)制 關(guān)于piRNA/PIWI復(fù)合物在癌癥中的功能及機(jī)制的研究表明，piRNA在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，并進(jìn)一步影響生理和病理過(guò)程。目前研究發(fā)現(xiàn)的piRNA在癌癥中的功能和機(jī)制可以分為以下3個(gè)方面。

1.2.1 piRNA/PIWI復(fù)合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS） piRNA/PIWI復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，并通過(guò)序列互補(bǔ)通結(jié)合其基因靶標(biāo)。一旦與Panoramix結(jié)合識(shí)別，piRNA/PIWI復(fù)合物就會(huì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因沉默。Eggless及其輔因子Windei在目標(biāo)DNA上添加了抑制性H3組蛋白第9個(gè)賴氨酸三甲基化標(biāo)記（H3K9me3）；隨后，募集異染色質(zhì)蛋白1，導(dǎo)致異染色質(zhì)形成。賴氨酸特異性脫甲基酶1從啟動(dòng)子區(qū)域去除活化的H3K4me2標(biāo)記，從而抑制RNA PolⅡ轉(zhuǎn)錄[21]。piRNA/PIWI復(fù)合物還募集DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）來(lái)甲基化CpG位點(diǎn)（編碼非轉(zhuǎn)座因子蛋白），從而改變轉(zhuǎn)錄活性[22]。在神經(jīng)元中，觀察到內(nèi)源性表達(dá)的piRNA誘導(dǎo)CREB2啟動(dòng)子甲基化[23]。此外，在CD56+自然殺傷細(xì)胞中，與KIR3DL1啟動(dòng)子反義的“piRNA樣”28-nt轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)與KIR3DL1啟動(dòng)子甲基化高度相關(guān)[24]。piR-021285的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了5′非翻譯區(qū)（5′UTR）第一個(gè)外顯子內(nèi)CpG位點(diǎn)的ARHGAP11A甲基化，降低了促凋亡信號(hào)相關(guān)mRNA的表達(dá)，并抑制了乳腺癌細(xì)胞凋亡[25]。在多發(fā)性骨髓瘤中，piRNA-823直接在原代CD138+多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中募集了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B，增加整體DNA甲基化水平并抑制腫瘤抑制因子p16INK4A的表達(dá)[26]。

1.2.2 piRNA/PIWI復(fù)合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS） 研究發(fā)現(xiàn)，許多piRNA會(huì)通過(guò)piRNA-RNA相互作用抑制靶標(biāo)功能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，這與miRNA的機(jī)制類似。這些RNA包括mRNA、轉(zhuǎn)錄的假基因和長(zhǎng)非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）[27]。有效的 mRNA：piRNA 相互作用需要在piRNA的5′端2～11nt內(nèi)進(jìn)行嚴(yán)格的堿基配對(duì)，而在12～21nt的位置進(jìn)行不完全的堿基互補(bǔ)配對(duì)[28]。在小鼠中，功能性piRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（piRNA-induced silencing complexes，pi-RISC）由 MIWI、piRNA和CAF1腺苷酸酶組成，在piRNA和CAF1介導(dǎo)下，通過(guò)類似miRNA的機(jī)制，在精子細(xì)胞中誘發(fā)mRNA的腺苷酸化和衰變。大量mRNA的消除可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞核濃縮和細(xì)胞質(zhì)排斥，從而完成精子的形成[29]。在肺癌中，piR-55490與mTOR 3′UTR結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解并抑制腫瘤的進(jìn)展[30]。piR-30188結(jié)合lncRNA OIP5-AS1并抑制OIP5-AS1表達(dá)，從而通過(guò)miR-367/CEBPA/TRAF4途徑抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性表型[31]。

piRNA/PIWI與核糖核蛋白復(fù)合物還可以通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后沉默來(lái)維持基因的完整性[32]。在piRNA的乒乓擴(kuò)增中，Krimper募集了二甲基精氨酸（sDMA）修飾的成熟核糖核蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物還與未加載的Ago3相互作用，并將它們整合在一起[2]。由于兩者都包含具有RNase H內(nèi)切核酸酶活性的PIWI結(jié)構(gòu)域[33]，使得該復(fù)合物可以選擇性地檢測(cè)轉(zhuǎn)座子RNA并對(duì)其進(jìn)行切片，從而對(duì)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后沉默，保持基因組完整性[2]。

1.2.3 piRNA/PIWI復(fù)合物與蛋白質(zhì)的相互作用 piRNA/PIWI復(fù)合物通過(guò)piRNA或PIWI蛋白PAZ域直接與某些蛋白質(zhì)結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)piRNA/PIWI復(fù)合物與目標(biāo)蛋白質(zhì)共定位。這種作用促進(jìn)了多種蛋白質(zhì)的相互作用，改變了它們的亞細(xì)胞定位。piR-823與熱休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）相互作用，促進(jìn) Ser326 磷酸化和HSF1活化，從而增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[34]。piR-54265/PIWIL2通過(guò)PIWIL2的PAZ域募集STAT3和p-SRC形成PIWIL2/STAT3/p-SRC復(fù)合物，促進(jìn)p-SRC介導(dǎo)的STAT3磷酸化和信號(hào)通路激活，從而促進(jìn)腫瘤形成[35]。

2 piRNA與泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤

細(xì)胞癌變通常伴隨著諸多表觀遺傳修飾的改變，包括DNA甲基化與轉(zhuǎn)座子沉默機(jī)制的異常等。目前相關(guān)研究資料顯示，piRNA不僅參與生殖細(xì)胞的調(diào)控，還與胃癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均較高的一類疾病，目前已開(kāi)展了部分有關(guān)piRNA與泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤關(guān)系的研究。

2.1 睪丸癌 睪丸癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤。由于piRNA與生殖細(xì)胞關(guān)系密切，其與睪丸癌之間關(guān)系的研究開(kāi)展較早。Ferreira等[36]研究了在睪丸癌中PIWI蛋白以及argonaute家族蛋白亞類和piRNA活性的表觀遺傳差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了睪丸生殖細(xì)胞腫瘤（testicular germ cell tumors，TGCT）細(xì)胞系外，在原發(fā)性精原細(xì)胞瘤和非精原細(xì)胞性睪丸腫瘤中都存在PIWI蛋白基因（PIWIL1、PIWIL2、PIWIL4）和與之相關(guān)蛋白 TDRD1 的啟動(dòng)子CpG島超甲基化沉默。這些表觀遺傳損傷發(fā)生在piRNA下調(diào)和LINE-1重復(fù)序列DNA甲基化喪失的背景下，而piRNA/PIWI機(jī)制有助于維持非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中LINE-1重復(fù)序列穩(wěn)定，提示了piRNA在維持細(xì)胞穩(wěn)定方面的可能作用。

Gainetdinov等[37]發(fā)現(xiàn)，與正常睪丸組織相比，piRNA/PIWI相關(guān)蛋白在TGCT細(xì)胞中被下調(diào)，利用小RNA深度測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、挖掘公共RNAseq/小RNA-seq數(shù)據(jù)集等方法分析正常組織、睪丸腫瘤癌旁組織及生殖細(xì)胞原位瘤（germ cell neopla－sia in situ，GCNIS）等樣本，發(fā)現(xiàn)GCNIS細(xì)胞和TGCT細(xì)胞缺乏piRNA/PIWI相關(guān)基因表達(dá)，提示在生殖細(xì)胞向GCNIS細(xì)胞的轉(zhuǎn)變中，傳統(tǒng)的piRNA/PIWI途徑丟失。

2.2 膀胱癌 膀胱癌是最常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、病死率均較高；膀胱鏡檢查活檢是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但缺少敏感、可靠的膀胱癌腫瘤標(biāo)志物。Eckstein等[38]通過(guò)免疫組化技術(shù)分析了95組肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC）樣本，發(fā)現(xiàn)Piwi-like 1和Piwi-like 2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，且2種蛋白與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Piwi-like 1、Piwi-like 2蛋白陽(yáng)性與臨床病理因素及疾病生存有關(guān)，均可作為MIBC患者的生物標(biāo)志物。

Chu等[39]使用piRNA芯片研究了膀胱癌組織及其癌旁正常組織中piRNA表達(dá)，并使用3′UTR的互補(bǔ)序列預(yù)測(cè)piRNA的目標(biāo)基因。結(jié)果顯示在膀胱癌組織中106個(gè)piRNA的表達(dá)水平上調(diào)，而91個(gè)下調(diào)，其中與膀胱癌相關(guān)的piRNA DQ594040下調(diào)最為明顯，是膀胱癌相關(guān)piRNA（piRNA associated with bladder cancer，piRABC）；piRABC過(guò)表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、集落形成并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。piRABC可以增加TNFSF4的螢光素酶活性，而研究證實(shí)，與膀胱癌組織相比，正常組織以及癌旁組織的TNFSF4蛋白表達(dá)上調(diào)，這提示了piRABC促進(jìn)腫瘤凋亡的可能機(jī)制。

2.3 腎癌 腎癌占全球所有成人惡性腫瘤的2.4%，其發(fā)病率不斷提高，癌癥特異性死亡率較高[40]。腎癌較難通過(guò)一般方法檢測(cè)和治療，并且關(guān)于腎腫瘤的深入研究較局限。第17號(hào)染色體上的piRNA簇產(chǎn)生piR-32051、piR-39894和piR-43607過(guò)度表達(dá)與晚期腫瘤，轉(zhuǎn)移和癌癥特異性生存的腎癌顯著相關(guān)[41]。piR-57125在腎癌組織中的表達(dá)較低，在轉(zhuǎn)移中的表達(dá)要低于非轉(zhuǎn)移性腫瘤。piR-30924、piR-38756與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，與正常組織相比，在轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達(dá)更高，在非轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達(dá)降低。轉(zhuǎn)移性原發(fā)腫瘤中piR-30924、piR-38756高表達(dá)以及piR-57125低表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)和總體生存顯著相關(guān)[42]。盡管還需要進(jìn)一步研究這些piRNA，以了解腎癌中新型piRNA的機(jī)制；但它們?cè)诓煌?jí)別腫瘤和正常組織之間的差異表達(dá)，提示有可能作為腎癌診斷、治療和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

piR-823在腎癌中異常表達(dá)。Iliev等[43]分析了588個(gè)生物樣本piR-823水平，包括腎癌腫瘤組織、癌旁組織、血清、尿液及健康對(duì)照樣本，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中piR-823顯著下調(diào)；在血清和尿液中，腎癌患者較健康者的piR-823表達(dá)明顯增高；腫瘤組織中較高的piR-823水平與較短的無(wú)病生存期相關(guān)，血清中較高的piR-823水平與腎癌臨床分期有關(guān)，提示piR-823在腎癌組織中的表達(dá)下調(diào)，與不良預(yù)后呈正相關(guān)，而患者尿液中的piR-823與健康標(biāo)本之間也存在差異，具有早期診斷腫瘤的潛能。Zhao等[44]通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定了透明腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）患者組織和血清中2種線粒體piRNA（piR-34536和piR-51810）的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ccRCC患者與健康對(duì)照組血清中線粒體piRNA水平差異不明顯，而ccRCC組織中piR-34536、piR-51810較正常組織明顯減少，組織中線粒體piRNA水平與ccRCC患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。線粒體piRNA可能成為判斷ccRCC患者預(yù)后的重要標(biāo)志。Sthr等[45]研究了PIWI樣蛋白在腎癌中的可能作用，通過(guò)對(duì)腎癌患者腫瘤樣本的分析和免疫組化方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Piwi-like 1蛋白陽(yáng)性與腫瘤的Fuhrman分級(jí)、腫瘤分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示Piwi-like 1作為腎癌患者預(yù)后不良標(biāo)志的可能。

2.4 前列腺癌 前列腺癌是全球最常見(jiàn)的男性惡性腫瘤之一，也是男性癌癥死亡的第二大主要原因[46]。當(dāng)前，前列腺癌預(yù)后最常見(jiàn)的臨床診斷指標(biāo)包括年齡、前列腺特異性抗原水平、腫瘤體積、神經(jīng)周圍浸潤(rùn)和格里森分級(jí)[47]。但是，僅使用臨床參數(shù)不足以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的預(yù)后評(píng)估。

Zuo等[48]分析了NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中106個(gè)前列腺癌樣本中的piRNA表達(dá)，并鑒定出與前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)的 3 種 piRNA（hsa_pir_000627、hsa_pir_005553、hsa_pir_019346），同時(shí)發(fā)現(xiàn) hsa_pir_000627和 hsa_pir_005553具有343個(gè)共靶向基因，占has_pir_005553靶標(biāo)的92.45%。功能分析表明，它們的2個(gè)靶基因主要與核質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。目前對(duì)于has_pir_019346的靶基因PNPLA7研究較少，尚不能準(zhǔn)確判斷hsa_pir_019346的生物學(xué)功能以及其與人類前列腺癌的關(guān)系。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)Gleason分級(jí)7分的前列腺癌患者中，3+4和4+3的患者腫瘤組織中有4種piRNA存在差異表達(dá)，提示了piRNA在臨床分類中的可能作用ner等[49]通過(guò)施加雄激素刺激雄激素依賴和非雌激素依賴性的前列腺癌細(xì)胞（LNCaP和PC-3）以評(píng)估細(xì)胞增殖、黏附和piRNA的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)雄激素增加了LNCaP和PC-3前列腺癌細(xì)胞中piR-823和piR-651的表達(dá)。這表明piR-651和piR-823的表達(dá)增加可能與某些癌細(xì)胞中的激素水平有關(guān)，可能是激素療法的潛在靶標(biāo)，這有待后續(xù)進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 小結(jié)

針對(duì)癌癥中piRNA的研究仍處于初級(jí)階段，隨著測(cè)序技術(shù)和其他先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，可以更方便地檢測(cè)出腫瘤與正常組織間piRNA的差異表達(dá)，如實(shí)時(shí)定量熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀和芯片檢測(cè)等方法。已知piRNA/PIWI復(fù)合物可以募集其他蛋白質(zhì)形成pi-RISC，后者通過(guò)互補(bǔ)序列降解目標(biāo)RNA，piRNA也募集了DNMT，在特定位點(diǎn)引起DNA甲基化并調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路中蛋白質(zhì)的磷酸化水平?，F(xiàn)階段關(guān)于piRNA的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平，而有關(guān)piRNA翻譯后修飾的進(jìn)一步研究對(duì)于研究腫瘤發(fā)生的機(jī)制來(lái)說(shuō)非常重要。本文著重闡述了目前發(fā)現(xiàn)的piRNA/PIWI及相關(guān)蛋白在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的異常表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，在睪丸癌、膀胱癌、腎癌及前列腺癌組織中均存在piRNA的差異表達(dá)，且與腫瘤分期、預(yù)后相關(guān)，表明piRNA作為腫瘤生物標(biāo)志物的巨大潛能；而且與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物相比，piRNA似乎更精確、靈敏，盡管實(shí)用性尚未得到檢驗(yàn)。piRNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用與機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究，有望為腫瘤的深入認(rèn)識(shí)和臨床診治提供新的靶點(diǎn)和途徑。