基于陶瓷膜技術的羊乳酪蛋白和其他組分的高效分級分離

姜竹茂，楊寶雨,，蘆 晶，逄曉陽，吳 政，岳元春，王 童，Eman Saad RAGAB，張書文,，呂加平,

（1.煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264000；2.中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，北京 100193）

羊乳具有“奶白金”的美譽，營養(yǎng)價值豐富，組分接近于母乳，且易于消化吸收[1-2]，不易發(fā)生乳糖不耐癥和過敏反應等特點[3-4]，是開發(fā)嬰幼兒配方奶粉的良好原料[5]。羊乳中主要有酪蛋白和乳清蛋白兩種，酪蛋白分子質量明顯大于乳清蛋白[6]，基于此特點，可利用膜分離技術對鮮羊乳進行高效的分級分離，生產出羊乳全乳蛋白、酪蛋白、乳清粉、脫鹽乳清粉等不同類型的乳蛋白類產品。

膜分離技術是一種高效、純粹的物理分離過程，與蒸發(fā)、冷凍相比能耗較低，生產過程中不需添加任何化學物質，而且操作溫度低，特別適合于對熱敏物質的處理[7]。利用膜分離生產的乳清粉變性程度低，酪蛋白膠束粉的天然膠束結構不會被破壞。膜分離技術制備的羊乳清粉具有較好的營養(yǎng)價值和優(yōu)異的功能特性，可廣泛應用于嬰幼兒配方乳粉、功能性食品、特醫(yī)食品等產品中[8]。

國內，陳建行等[9]通過膜分離建立了牛乳酪蛋白膠束粉的生產工藝；張瑞華等[10]通過膜分離對牛乳酪蛋白膠束粉進行了超聲改性研究，提高了酪蛋白膠束粉的溶解度；李俊柯等[11]通過低溫微濾制備了新型功能性牛乳蛋白配料。Karasu等[12]對比分析了陶瓷膜和卷式有機膜分離脫脂乳，發(fā)現(xiàn)陶瓷膜更適合大規(guī)模工業(yè)化生產；J?rgensen等[5]優(yōu)化了微濾過程中的溫度和陶瓷膜的孔徑；Hurt等[13]在50 ℃條件下，通過恒壓微濾進行酪蛋白膠束濃縮，發(fā)現(xiàn)乳清蛋白脫除率可達98.3%，但關于羊乳的膜分離技術研究報道較少。

以脫脂羊乳為原料，利用膜技術進行高效分級分離，滲透液用來生產高品質的乳清蛋白產品，截留液可以直接用于干酪或酪蛋白膠束粉的生產，與傳統(tǒng)分離蛋白質的方法相比，既提升質量、效率，又減少了環(huán)境的污染。本研究通過建立一個多階段微濾過程，對脫脂羊乳中的酪蛋白和其他組分進行分離，以期為羊乳基料的工業(yè)化生產提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料羊乳40 kg，采集于北京海淀區(qū)。

硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸、硝酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；30%過氧化氫（優(yōu)級純）、調諧溶液、多元素校準標樣 美國Agilent公司；乙醇北京化工廠；8%～16%梯度膠、eStainL1染色液、eStainL1脫色液 南京金斯瑞有限公司；寬范圍彩色預染蛋白質Marker（MP206） 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

圖1 陶瓷膜中試設備Fig. 1 Schematic diagram of pilot-scale ceramic membrane microfiltration

表1 微濾陶瓷膜相關信息Table 1 Operating parameters of ceramic membrane microfiltration

PT-20TS LAB殺菌機 日本東京Powerpoint International有限公司；FT15-A碟片式離心機 英國Armfield公司；陶瓷膜中試設備（圖1）、0.05 μm孔徑管式陶瓷膜（表1） 上海凱鑫分離技術有限公司；2300全自動微量凱氏定氮儀 丹麥FOSS集團有限公司；基礎電泳儀電源、Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽美國Bio-Rad公司；Perfection V39掃描儀 日本Epson公司；DIgieye DigitalImaging System型電子眼英國Verivide公司；HI2214 pH計 意大利HANNA有限公司；MARS5密閉微波消解儀 美國CEM公司；7700X電感耦合等離子體色譜儀 美國Agilent公司；ZLS-4真空低溫離心濃縮儀 湖南赫西儀器裝備有限公司；ICS-3000離子色譜儀 美國Dionex公司；30 L小型濃縮機 北京奈諾科技有限公司；Mobile Minor型噴霧干燥機 德國GEA Nior公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂乳微濾操作工藝

1.3.2 膜通量、濃縮倍數(shù)和脫除率的計算

膜通量根據(jù)公式（1）[14]計算。

式中：J代表膜通量/（L/（m2·h））；60 代表每小時的分鐘數(shù)/（min/h）；m為一定時間內所得滲透液的質量/kg；A代表膜面積/m2；t為時間/min。

濃縮倍數(shù)計算如式（2）所示。

式中：m脫脂乳為脫脂乳的質量/kg；m透過液為濃縮到某一時刻透過液的質量/kg。

膜對物質A（乳清蛋白、乳糖、灰分或礦物質）脫除率的計算如式（3）所示。

式中：m1指滲透液中物質A的質量/kg；m2指脫脂乳中物質A的質量/kg。

1.3.3 料液成分分析

采用凱氏定氮的方法，分別測定脫脂乳、各階段截留液和滲透液中的總氮、非蛋白氮、非酪蛋白氮含量，其中總氮含量采用AOAC 991.20;33.2.11的方法測定；非蛋白氮含量采用AOAC 991.21;33.2.12方法測定；非酪蛋白氮含量的測定采用AOAC 998.05;33.2.64方法測定。各蛋白含量計算如式（4）～（8）所示。

另外固形物含量根據(jù)（AOAC 990.20;33.2.44）方法測定，灰分質量分數(shù)按照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》方法測定，pH值使用pH計直接測定。

1.3.4 顏色分析

采用電子眼來測定脫脂乳、各階段截留液與透過液溶液顏色的變化，儀器使用前先用白板和標準色卡對相機進行白平衡和顏色校正。將樣品置于室溫下，分別測定各樣品的L*、a*和b*值。

1.3.5 乳糖分析

參考文獻[15]的方法并稍加修改。向樣品中加入兩倍體積的4 ℃乙醇，將溶液在5 ℃、4 000×g下離心30 min進行蛋白質脫除。收集上清液，并在48 ℃下通過真空低溫濃縮除去乙醇，最后用超純水定容至原體積。測定采用離子色譜法，Carbo PacTMPA20糖分離柱（3×150 mm）；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；流動相A：超純水，流動相B：250 mmol/L NaOH，檢測器：脈沖安培檢測器，金電極。梯度洗脫條件：0～40 min，92.8%超純水；40～40.1 min，儀器按照程序設定的梯度自動線性變化；40.1 min超純水降至0%，氫氧化鈉增加到100%；維持上述比例至45 min；45.1～55 min儀器按照程序設定的梯度自動線性變化至初始條件。

1.3.6 礦物質分析

采用電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）儀進行檢測。儀器工作條件：射頻功率：1 280 W；霧化室溫：2 ℃；采樣深度：8 mm；冷卻器流速：1.47 L/min，載氣流速：1 L/min。

1.3.7 SDS-PAGE分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）判定各階段截留液和濾過液中蛋白種類和大致含量。梯度膠的質量分數(shù)為8%～16%，其中脫脂乳稀釋15 倍，截留液均稀釋50 倍，滲透液均稀釋2 倍，與2×樣品緩沖液（體積比1∶1）于微量離心管中混合，置于沸水浴中加熱5 min，2 000 r/min離心10 min，取10 μL上樣，電泳結束后，將凝膠置于eStain L1蛋白染色儀中染色3.5 min，脫色2 次，分別是1.5 min和3 min，取出并掃描分析。

1.3.8 毛細管電泳分析

參考文獻[16]的方法，采用毛細管電泳相對定量分析脫脂羊乳與透過液的乳清蛋白含量。將樣品與樣品緩沖溶液按體積比1∶1混合，室溫放置1 h，10 000 r/min離心，取上清液，用0.45 μm的濾膜過濾后直接進樣。其操作條件為分離電壓20 kV、柱溫38 ℃、進樣壓力0.5 psi、時間5 s、紫外檢測波長214 nm。樣品緩沖液：0.295 4 g檸檬酸鈉、0.156 g二硫代蘇糖醇、2.011 1 g三羥甲基胺基甲烷，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，定容至100 mL，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調至pH值為8.0。運行緩沖液：4.208 3 g檸檬酸、0.582 8 g檸檬酸鈉、0.05 g羥丙基甲基纖維素，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，定容至100 mL，用磷酸溶液調至pH值為3.0。

1.3.9 膜的污染程度與清洗效果分析

膜的污染程度使用純水通量衰減系數(shù)（公式（9））來衡量，其值越大表示膜污染越嚴重[17]。

式中：J0和Jt分別為過濾前和過濾結束后僅用水清洗1 次后膜的純水通量/（L/（m2·h））。

膜的清洗效果可采用純水通量恢復系數(shù)（公式（10））來表示[17]。

式中：J0和JQ分別表示膜過濾前和清洗后的純水通量/（L/（m2·h））。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實驗均重復進行3 次，結果表示為 ±s。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.5和Origin Pro 9.1軟件進行統(tǒng)計處理與作圖分析。采用方差分析法進行差異顯著性比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 膜通量的變化

脫脂羊乳酪蛋白和乳清蛋白的粒徑大約為188.5 nm和10.1 nm，因此根據(jù)直徑的不同將乳清蛋白和酪蛋白分開是可行的[18]。國際上一般選用0.1 μm陶瓷膜分離脫脂牛乳。本研究的預實驗表明，0.05 μm陶瓷膜分離脫脂羊乳的效果優(yōu)于0.1 μm。故選用0.05 μm陶瓷膜，通過熱交換使料液溫度保持在50 ℃，調節(jié)進、出口閥門，使三個階段進口壓力保持在0.18 MPa，出口壓力保持在0.08 MPa，壓差△P＝0.1 MPa，錯流速率46 L/h的條件下，階段1、2和3的膜分離時間分別是16、16.5 min和16.65 min，膜通量基本維持在79.74 L/（m2·h）。Zulewska等[19]使用0.1 μm恒壓陶瓷膜、0.1 μm梯度陶瓷膜和0.3 μm卷式有機膜將脫脂牛乳直接濃縮3 倍，研究結果發(fā)現(xiàn)膜通量分別為54.08、71.79 L/（m2·h）和16.21 L/（m2·h）。Adamas等[20]使用0.14 μm Isoflux陶瓷膜將脫脂牛乳進行3 倍濃縮、2 次清洗過濾，平均膜通量為55 L/（m2·h）。羊乳的微濾很少有文獻報道，本研究結果表明，羊乳的微濾膜通量明顯高于牛乳，工業(yè)化分離羊乳酪蛋白和其他組分具有一定的可行性。由圖2可知，隨著時間的延長各階段膜通量不斷下降（P＜0.05），這是由于截留液不斷濃縮，脫脂羊乳的固形物含量和黏度不斷增大，導致在膜表面的剪切力變小，濃差極化作用增大，陶瓷膜受到一定程度的污染，影響了可透過成分的滲透[21]。階段2、3初始膜通量小于階段1初始膜通量，階段2、3初始膜通量無顯著變化（P＞0.05），這是因為在第1階段過濾后膜污染已經形成，之后的加水稀釋過程并沒有有效消除膜污染[22]。

圖2 稀釋過濾過程中膜通量隨時間的變化Fig. 2 Changes in membrane flux during microfiltration of skim milk and diluted fractions

2.2 料液組成成分的變化

原料乳和巴氏殺菌脫脂乳的物理組成如表2所示。羊乳一般在加熱過程中會造成β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，Lg）和κ-酪蛋白（κ-casein，κ-CN）形成分子間二硫鍵，造成乳清蛋白變性[23]。為了達到巴氏殺菌的條件，并減小乳清蛋白的熱變性，采用較低的溫度和較短的時間進行殺菌（72 ℃、15 s）。在微濾之前，β-Lg和κ-CN的過度熱結合可能降低膜分離乳清蛋白和酪蛋白的能力。因此在巴氏殺菌前后測定酪蛋白和真蛋白的比例是檢測乳清蛋白變性程度的重要指標。從表2中可以看出，巴氏殺菌前后的酪蛋白/真蛋白值（79.50%、78.72%）無顯著性差異（P＞0.05）。Beckman等[24]報道了將殺菌條件從72 ℃、16 s變?yōu)?9 ℃、18 s，酪蛋白/真蛋白值提高了1.8%。雖然提高了2 ℃、2 s，但是也會導致乳清蛋白產生較大的變性，并減少可通過微濾去除的乳清蛋白。用凱氏定氮分析時，也會導致對羊乳中酪蛋白含量的高估[25]。

各階段截留液中各組分含量的變化如表3所述，可以看出各階段截留液酪蛋白、脂肪含量無顯著性差異（P＞0.05），因為稀釋倍數(shù)和濃縮倍數(shù)是相同的，且羊乳脂肪球平均粒徑為3.55 μm，進一步說明0.05 μm陶瓷膜可以將酪蛋白、脂肪有效截留。但是各階段截留液固形物、粗蛋白、非蛋白氮、非酪蛋白氮、真蛋白和乳清蛋白含量不斷降低（P＜0.05），這是因為隨著稀釋過濾的進行，截留液中乳糖、乳清蛋白、小分子氮化合物和礦物質不斷透過膜。另外，當非酪蛋白氮按照1.3.3節(jié)的方法前處理后，樣品的澄清度低，這表明用于截留液中的緩沖液容量不足以使微濾截留液的pH值降到4.6（酪蛋白的等電點）。非酪蛋白氮濾液的渾濁表明存在未沉淀的酪蛋白，并高估了非酪蛋白氮值。因此，認為實際酪蛋白和酪蛋白/真蛋白值被低估，實際乳清蛋白值被高估。研究結果與Admsa等[20]報道的相一致。

表3為各階段透過液中各組分含量的變化，可以看出各階段透過液固形物、粗蛋白、非蛋白氮、非酪蛋白氮、真蛋白和乳清蛋白的含量隨著稀釋過濾階段的增加而不斷下降（P＜0.05），這是因為各階段連續(xù)用去離子水進行稀釋過濾，各階段可以透過的物質逐漸減少。在各階段滲過液中沒有酪蛋白和脂肪（P＞0.05），說明該陶瓷膜可以將酪蛋白和脫脂乳中殘留的脂肪全部截留。此法生產的天然乳清蛋白脂肪含量較少，可生產出功能性能優(yōu)于使用奶酪副產物制作而成的乳清蛋白粉，較好地解決了因脂肪存在造成風味缺陷和起泡性不良的問題[26]。

表2 巴氏殺菌脫脂羊乳與原料乳成分對比Table 2 Compositions of pasteurized skim goat milk and raw goat milk

表3 巴氏殺菌脫脂羊乳與各階段截留液和透過液的成分組成Table 3 Characterization of pasteurized skim goat milk, retentates and permeates from microfiltration of pasteurized skim goat milk

2.3 色度的變化和電泳分析

圖3 脫脂羊乳與各階段截留液及透過液的色度比較Fig. 3 Color of skim goat milk, retentates and permeates

表4 脫脂羊乳、各階段截留液和透過液色度值Table 4 L*, a* and b* values of skim goat milk, retentates and permeates from each microfiltration stage

圖4 脫脂羊乳與各階段截留液及透過液的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE of skim milk, retentates and permeates from each microfiltration stage

圖5 脫脂羊乳與各階段透過液的毛細管電泳圖Fig. 5 Capillary electrophoresis of skim goat milk and filtrates from each sequential microfiltration stage

酪蛋白膠束和脂肪球的折射率與水的折射率有很大不同，這種差異使膠體微粒均勻反射全波長的可見光，因此，在日光下觀察到的牛奶是乳白色[27]。由圖3、表4可知，相對于脫脂羊乳，截留液的顏色隨著階段的增加逐漸變白，各階段截留液L*值、a*值都顯著增大（P＜0.05），這與Zulewska等[19]的研究結果相一致，樣品開始偏亮、偏紅和偏藍，這是因為截留液的酪蛋白含量顯著性高于脫脂羊乳中的酪蛋白含量。透過液顏色逐漸變淺，各階段的透過液L*值無顯著變化，a*和b*值逐漸增大（P＜0.05），這是因為透過液不含有酪蛋白，均澄清透明，不會對明亮值L*產生影響，并且隨著補水稀釋，核黃素含量逐漸降低。由圖4和圖5可知，截留液中隨著微濾階段的增加，酪蛋白條帶基本沒有變化，但乳清蛋白條帶逐漸變淺，說明每個階段逐漸有蛋白脫除。透過液中不含酪蛋白，乳清蛋白條帶逐漸變淺，說明每個階段蛋白的脫除率依次降低，并且0.05 μm陶瓷膜可以對酪蛋白進行有效截留，這與料液組成成分結果相一致。

2.4 pH值的變化

由表5可見，各階段初始液、截留液、透過液pH值隨著微濾階段的增加不斷升高（P＜0.05），這是因為在稀釋過濾過程中氫離子和緩沖鹽離子不斷被去離子水稀釋。滲透液的pH值在各階段之間變化最大，其次是初始液，再次是截留液。這一趨勢可以解釋為乳清相中可溶性鹽不斷被稀釋，與Adams等[20]的研究結果相一致。

表5 各階段初始液、截留液和透過液的pH值變化Table 5 pH of skim goat milk, rententates and permeates from each microfiltration stage

2.5 各階段脫除率的比較

微濾的經濟效率取決于乳清蛋白和酪蛋白的分離效率，因此可以用脫脂羊乳中乳清蛋白的脫除率評價膜的性能。如表6所示，隨著微濾階段的增加，乳清蛋白脫除率不斷降低（P＜0.05）。越來越少的乳清蛋白穿過陶瓷膜，這與圖2的結果相一致。累計脫除率不斷增加，說明乳清蛋白不斷被分離。為了使乳清蛋白的脫除率達95%以上，Adams等[20]使用0.14 μm Isoflux陶瓷膜6 次洗濾，累計運行12 h；Hurt等[13]使用了0.1 μm的恒壓陶瓷膜對脫脂乳進行3 階段微濾；Beckman等[24]使用了0.3 μm卷式有機膜進行了6 次洗濾，但是這樣需要更長的運行時間、更大的膜面積和更多的去離子水。本研究在陶瓷膜不阻擋乳清蛋白穿過的情況下，乳清蛋白的理論累計脫除率為98%，乳清蛋白的脫除率與理論值接近（P＞0.05），說明0.05 μm陶瓷膜對乳清蛋白有較好的分離效果。

如表3所示，除銅外，截留液中其他礦物質含量發(fā)生顯著性變化（P＜0.05），這一發(fā)現(xiàn)可以用α-La和β-Lg具有螯合銅的能力來解釋[28]。乳中的無機鹽有一部分成結合狀態(tài)，乳中大約有60%～70%的鈣和50%的磷以膠體磷酸鈣的形式和酪蛋白膠束結合，不易穿過膜孔，這是造成最后一階段灰分含量低的主要原因。

表6 各組分各階段脫除率比較Table 6 Removal percentages of various components at each microfiltration stage%

2.6 膜的污染程度與清洗效果

稀釋過濾完畢后對0.05 μm陶瓷膜依次進行水、2%氫氧化鈉溶液、1%硝酸溶液清洗，并在操作壓力（進口0.18 MPa、出口0.08 MPa）和50 ℃條件下對純水通量進行測定，結果見表7。根據(jù)表7的數(shù)據(jù)計算得到膜的純水通量衰減系數(shù)為55.57%，可能是脫脂羊乳在膜分離過程中，受到不可逆的膜污染。Zulewska等[19]通過對脫脂乳和超濾液分別進行3 倍微濾，說明小分子的乳清蛋白只會沉積到膜表面或膜孔徑中，但酪蛋白會與膜結合形成不可逆沉淀，進一步說明陶瓷膜隨微濾時間的延長，膜通量會逐漸降低。純水清洗后恢復系數(shù)僅為44.43%，說明純水基本起不到清洗效果。經堿溶液清洗后，膜通量恢復至76.03%。再進行酸洗，膜通量恢復系數(shù)為99.21%，微濾前和清洗后的膜通量無顯著變化（P＜0.05）。說明通過上述清洗方法清洗后，陶瓷膜得到有效恢復。

表7 不同階段陶瓷膜的純水通量Table 7 Water membrane flux before ultrafiltration and after each cleaning step

3 結 論

本研究以脫脂羊乳為原料，在50 ℃條件下，對脫脂乳進行3 倍濃縮、3 階段微濾，發(fā)現(xiàn)陶瓷膜的平均膜通量在79.74 L/（m2·h）左右，高于目前報道的牛乳分離效率。從透過液組分、SDS-PAGE和毛細管電泳圖可以看出酪蛋白和其他組分得到了有效分離。0.05 μm陶瓷膜乳清蛋白的脫除率為96.17%，乳糖脫除率為86.42%，灰分脫除率為73.39%，鈣脫除率為34.90%，磷脫除率為55%，膜通量恢復系數(shù)為99.21%。本研究為羊乳的深加工、功能性羊乳基料開發(fā)提供了理論和應用參考。功能性乳基配料生產是乳制品開發(fā)的核心環(huán)節(jié)，對于大幅度提高原料乳利用率、提升乳品加工附加值和推動乳業(yè)結構轉型升級、產品創(chuàng)新開發(fā)具有重要作用。