異基因造血干細(xì)胞移植對(duì)腸道菌群的影響

張 麒，王月嬋，項(xiàng) 燕，徐建清，李佳琪，魏天蕊，劉 偉

異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是一種治療各種血液惡性腫瘤、骨髓衰竭性疾病以及遺傳代謝或缺陷異常的免疫治療方法[1]。治療策略是術(shù)前采用超大劑量化療和全身放療，清除腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞，然后將正常供者的造血干細(xì)胞植入到患者體內(nèi)，使患者得以重建正常的造血和免疫功能，從而治愈疾病，移植期間需要使用大量抗生素來(lái)預(yù)防和治療感染。由于allo-HSCT會(huì)出現(xiàn)許多嚴(yán)重的并發(fā)癥，如移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)(22%)、感染(11%)、繼發(fā)性惡性腫瘤(7%)、肺部并發(fā)癥(5%)、心臟毒性(2%)和其他治療相關(guān)的事件(8%)[2],限制其臨床應(yīng)用。其中，腸道GVHD最為嚴(yán)重，也是最難治療的，亦是allo-HSCT術(shù)后死亡的主要原因之一[3]。近30年來(lái)的研究表明，腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與allo-HSCT后患者的感染風(fēng)險(xiǎn)、GVHD以及死亡率密切相關(guān)[4]。腸道菌群不僅在患者免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，而且還可以保護(hù)患者免受病原體的影響[5]。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群有望成為改善allo-HSCT預(yù)后的主要突破口。作者對(duì)allo-HSCT后患者的腸道菌群與GVHD之間的關(guān)系作一綜述，進(jìn)一步總結(jié)通過(guò)平衡腸道菌群的多種治療方法，為臨床上改善移植預(yù)后，降低死亡率提供治療策略。

1 腸道菌群與allo-HSCT后GVHD的研究

1.1 腸道菌群失衡導(dǎo)致GVHD產(chǎn)生 導(dǎo)致allo-HSCT后出現(xiàn)GVHD的主要原因，除了供體和受體之間的組織相容性抗原的差異外，腸道菌群的失衡也是原因之一。在正常機(jī)體內(nèi)，腸道免疫上皮細(xì)胞位于胃腸道內(nèi)腔邊緣，作為屏障橋接傳送從腸道微生物群發(fā)送到免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞的關(guān)鍵信息[6]。腸道免疫上皮細(xì)胞具有模式識(shí)別受體，如Toll樣受體和NOD樣受體，這些受體是識(shí)別與微生物相關(guān)的病原體相關(guān)模式分子(包括脂多糖、肽聚糖等)的必需元素[7]。最重要的是，模式識(shí)別受體還可以感知被破壞的宿主組織的危險(xiǎn)相關(guān)分子模式信號(hào)，是重要防御屏障。另一方面，腸道免疫系統(tǒng)還發(fā)揮持續(xù)監(jiān)測(cè)微生物群結(jié)構(gòu)和豐度的作用[6]。

Allo-HSCT術(shù)前采用超大劑量化療和全身放療以及治療過(guò)程中使用大量抗生素，導(dǎo)致腸道菌群失衡，出現(xiàn)一些微生物菌群的過(guò)度生長(zhǎng)，例如屬于變形菌門(mén)的細(xì)菌，可能會(huì)產(chǎn)生過(guò)量病原體相關(guān)模式分子，導(dǎo)致炎癥加劇和免疫耐受性喪失。腸道完整性的破壞，導(dǎo)致腸道滲漏現(xiàn)象[8]，使得細(xì)菌脂多糖等物質(zhì)從受損的腸道中釋放出來(lái)，進(jìn)入血液循環(huán)并到達(dá)全身組織器官，與免疫細(xì)胞表面的受體(即Toll樣受體4和CD14)的相互作用激活機(jī)體相關(guān)淋巴組織、單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)等，分泌大量炎性因子，引發(fā)全身性低度炎癥[9]，導(dǎo)致代謝性?xún)?nèi)毒素血癥，包括胰島素抵抗，葡萄糖耐受不良，血脂異常和肝臟脂肪變性[6]，引起皮疹、胃腸功能紊亂及出血和黃疸等疾病。

1.2 GVHD加重腸道菌群失衡 GVHD對(duì)腸道菌群的影響受到越來(lái)越多的關(guān)注。最近的報(bào)道表明，在allo-HSCT后出現(xiàn)的GVHD可進(jìn)一步加重具有重要體內(nèi)平衡作用的細(xì)菌數(shù)量失調(diào)，特別是在中性粒細(xì)胞減少期[10]。與移植前相比，腸道生態(tài)系統(tǒng)的物種豐富度下降了約30%，主要是厚壁菌門(mén)和擬桿菌比例減少、腸球菌和乳桿菌比例增加以及細(xì)菌多樣性改變，這些變化與死亡率呈正相關(guān)[4]。例如，研究發(fā)現(xiàn)GVHD可能通過(guò)減少梭狀芽胞桿菌的豐度來(lái)消耗消炎細(xì)胞群，從而加重GVHD的嚴(yán)重程度[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明：從人類(lèi)糞便中重新引入17種梭狀芽胞桿菌分離物，可以延長(zhǎng)GVHD小鼠的存活時(shí)間。

2 腸道微生物的檢測(cè)及未來(lái)的研究方向

2.1 微生物治療新型疾病 由于過(guò)去15年中先進(jìn)基因測(cè)序工具和生物信息學(xué)平臺(tái)的快速發(fā)展，科學(xué)家們能夠較好描述腸道微生物群和微生物組的組成和功能。收集到的這些大數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明腸道細(xì)菌在維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)宿主代謝方面發(fā)揮重要作用。在對(duì)微生物群研究過(guò)程中，一些腸道細(xì)菌成為了新型疾病治療的潛在來(lái)源，例如頑固性便秘[12]。只是大多數(shù)研究還都集中在細(xì)菌對(duì)這些疾病的作用上，關(guān)于真菌和病毒對(duì)這些疾病以及微生物組的微妙平衡知之甚少，預(yù)計(jì)這將是未來(lái)一個(gè)廣闊且富有成效的研究領(lǐng)域[13]。

2.2 腸道菌群多樣性檢測(cè)新途徑 最近，許多關(guān)于微生物組研究的學(xué)科重新崛起，比如用于表征微生物組的高通量方法的進(jìn)步，促進(jìn)了與HSCT有關(guān)的微生物組研究的快速增長(zhǎng)，推動(dòng)了醫(yī)學(xué)的向前發(fā)展。常用的方法包括用于細(xì)菌分類(lèi)學(xué)分類(lèi)的16SrRNA基因測(cè)序，代謝組學(xué)，以及基因組測(cè)序和隨后的微生物基因的分類(lèi)學(xué)和功能分類(lèi)等[14]。其中利用細(xì)菌的16SrRNA具有保守序列和特異序列的特點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，可以檢測(cè)已知甚至未知的微生物種類(lèi)，也可以檢測(cè)到低豐度的細(xì)菌，進(jìn)而可以全面、系統(tǒng)地通過(guò)α-多樣性和β-多樣性進(jìn)行組內(nèi)和組間的多樣性分析，因此可以更好的發(fā)現(xiàn)菌群結(jié)構(gòu)差異。相對(duì)其他幾種方法，其結(jié)果準(zhǔn)確度更高，是目前腸道微生物領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的方法[5]。

大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的最新進(jìn)展使得能夠徹底評(píng)估接受allo-HSCT患者的微生物群的變化，并且在allo-HSCT背景下微生物群的有益和有害變化的證據(jù)也開(kāi)始積累[4]。對(duì)于一些復(fù)雜的可引起腸道菌群較大改變的代謝疾病,高通量測(cè)序技術(shù)可以準(zhǔn)確地分析菌群多樣性的改變。例如在關(guān)于糖尿病的研究中,Wirth等[15]采用高通量技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1型糖尿病大鼠和胰島素治療大鼠在不同的腸道區(qū)域有特異性腸道微生物群的組成。這些新途徑提高了我們對(duì)復(fù)雜的人類(lèi)相關(guān)微生物群落的理解，包括微生物群落結(jié)構(gòu)，功能潛力和實(shí)現(xiàn)的基因表達(dá)活動(dòng)等方面[16]。

2.3 宏蛋白組學(xué)為微生物治療預(yù)后提供幫助 在移植期間，腸道菌群組成有著顯著變化，物種豐度的變化和多樣性的測(cè)量已被提出作為臨床移植后患者預(yù)后相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。宏蛋白質(zhì)組學(xué)即是在特定時(shí)間，通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)檢測(cè)環(huán)境微生物群完整的蛋白質(zhì)組成，其可以將腸道菌群蛋白的差異表達(dá)與腸道菌群功能聯(lián)系起來(lái)，以達(dá)到預(yù)測(cè)菌群功能差異的作用。宏蛋白質(zhì)組學(xué)可以直接說(shuō)明腸道菌群的功能，其檢測(cè)出的一些特異的蛋白質(zhì)可以作為疾病診斷、預(yù)后和治療的生物標(biāo)志物[5]。如果可以確定微生物群和移植結(jié)果之間的因果關(guān)系，這些關(guān)系可以為基于微生物群的治療的預(yù)后發(fā)展提供有效信息，以改善移植結(jié)果。

3 Allo-HSCT后GVHD的常用治療方法

3.1 益生菌療法 多項(xiàng)研究表明，微生物群多樣性的改變?cè)黾恿耸荏w對(duì)腸道介導(dǎo)疾病(如腹瀉、感染和急性GVHD)的敏感性[17]。益生菌可以改變腸道菌群多樣性，改善腸道的屏障功能[18]，調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答，降低腸道細(xì)菌感染率，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)各種信號(hào)通路，誘導(dǎo)粘液和抗菌肽的產(chǎn)生。益生菌治療主要包括直接引入一種菌種或選定特定微生物群，常用益生菌包括雙歧桿菌、芽孢桿菌和乳酸菌。其中，口服鼠李糖乳桿菌GG株效果較為顯著，在同種異體移植小鼠模型中，接受鼠李糖乳桿菌GG株治療的小鼠組術(shù)后GVHD明顯減輕，存活率較高。而未接受鼠李糖乳桿菌GG株組小鼠術(shù)后GVHD發(fā)生率高，常伴隨多種腸道細(xì)菌感染(如艱難梭菌)[19]。另一個(gè)重要研究發(fā)現(xiàn)，梭狀芽孢桿菌通過(guò)上調(diào)腸道中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來(lái)預(yù)防炎癥，表明GVHD可能通過(guò)減少梭狀芽孢桿菌的豐度來(lái)消耗消炎細(xì)胞群[11]，這對(duì)用益生菌治療allo-HSCT后GVHD具有重要意義。

然而，益生菌治療也有其局限性。首先，將益生菌運(yùn)到下消化道，會(huì)因?yàn)槲傅膹?qiáng)酸環(huán)境而使其明顯喪失活力和代謝特征。其次，在患者免疫功能過(guò)度低下時(shí)，引入益生菌可能會(huì)增加患菌血癥或敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 糞便菌群移植療法 目前,糞便菌群移植(fecal microbiota transplantation,FMT)可能成為治療allo-HSCT后腸道菌群感染的有效方法。FMT是指將健康個(gè)體的糞便懸浮液通過(guò)鼻胃管插管或內(nèi)鏡下注入患者消化道中，來(lái)恢復(fù)患者微生物群落多樣性[20]，目前已成功應(yīng)用于非HSCT患者復(fù)發(fā)艱難梭菌感染的治療。但FMT也存在較大風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榕判刮镏泻写罅坑泻?xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)，可能會(huì)危害到機(jī)體健康[21]?，F(xiàn)有1種新的FMT，是通過(guò)第三方冷凍、封裝的接種，以口服膠囊的途徑進(jìn)行[11]，這種途徑的好處在于膠囊制備前，對(duì)供體血液和糞便進(jìn)行了大量篩選實(shí)驗(yàn)，從而保證所有感染篩選實(shí)驗(yàn)均在正常范圍或陰性范圍內(nèi)，降低了患者接受FMT后細(xì)菌感染率。同時(shí)口服冷凍FMT膠囊還可以避免心理創(chuàng)傷，緩解心理壓力，減少痛苦。在1項(xiàng)開(kāi)放標(biāo)簽單組試驗(yàn)研究中，數(shù)名接受allo-HSCT后受試者再接受FMT治療，12個(gè)月的總體生存率和無(wú)進(jìn)展生存率分別為85%(95%CI:51%～96%)和85%(95%CI:51%～96%)，其中1例死于急性胃腸道GVHD;另外1項(xiàng)針對(duì)血液疾病患者進(jìn)行HSCT時(shí)使用FMT的前瞻性研究表明，F(xiàn)MT可以清除受體的胃腸道中耐抗生素細(xì)菌[22]，相比萬(wàn)古霉素的治療，F(xiàn)MT治療明顯改善了與反復(fù)艱難梭菌感染相關(guān)的腹瀉(OR=3.24，95%CI:1.85～5.68)[3]。由于缺乏臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，而且FMT長(zhǎng)期安全性尚不清楚，因此，患者在接受FMT后，長(zhǎng)期隨訪(fǎng)有一定必要性[23]。

3.3 選擇性消化道去污療法 選擇性消化道去污(selective digestive decontamination,SDD)即通過(guò)口服腸道不吸收的抗菌藥和抗生素，選擇性清除腸道中可能致病的需氧革蘭陰性細(xì)菌及其他細(xì)菌，以達(dá)到預(yù)防感染的目的。由于allo-HSCT患者在術(shù)后會(huì)因自身口咽與胃腸道潛在致病微生物(potentially pathogenic microorganisms,PPMs)移生而易發(fā)生感染，因此SDD可能成為治療allo-HSCT后PMMs感染的有效方法之一。在1項(xiàng)研究中，63名患者被選擇性地用不可吸收的抗生素去污，大多數(shù)患者的口腔在3 d內(nèi)就無(wú)PPMs存在，5 d后直腸感染率明顯下降，其中9例患者發(fā)生了PPMs二次感染[24]。新的研究發(fā)現(xiàn)，112名兒童因血液系統(tǒng)惡性腫瘤接受allo-HSCT，為清除胃腸道內(nèi)兼性嚴(yán)格厭氧微生物，使用大劑量非吸收性抗菌藥物進(jìn)行全胃腸道去污，大約一半的兒童被證明成功去污，術(shù)后GVHD發(fā)生率顯著降低，預(yù)防方案包括使用利福昔明以及全身性頭孢噻肟鈉[25]。在HSCT患者中使用利福昔明可以保持腸道菌群多樣性，并與使用環(huán)丙沙星和甲硝唑聯(lián)合治療的患者相比降低了治療相關(guān)死亡率。但是SDD的臨床應(yīng)用也存在潛在危險(xiǎn)，特別是耐藥細(xì)菌的誘導(dǎo)產(chǎn)生?？股厥褂貌划?dāng)將導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，一旦耐藥產(chǎn)生，逆轉(zhuǎn)是艱難而緩慢的，可以說(shuō)目前阻礙SDD的最大障礙就是對(duì)SDD是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。

3.4 吲哚和吲哚衍生物治療 由共生細(xì)菌利用色氨酸酶產(chǎn)生的吲哚和吲哚衍生物可以通過(guò)誘導(dǎo)抗透明質(zhì)酸酶反應(yīng)依賴(lài)性的IL-22的轉(zhuǎn)錄和黏膜免疫穩(wěn)態(tài)，從而增強(qiáng)上皮屏障的完整性、減輕炎癥。最新的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是由大腸桿菌菌株產(chǎn)生的吲哚還是由外源性給藥產(chǎn)生的吲哚和吲哚衍生物都被證明能顯著降低GVHD的嚴(yán)重程度、腸上皮的損傷以及跨上皮細(xì)菌的易位[23]。因此，利用吲哚及其衍生物是未來(lái)治療GVHD的另一個(gè)方向。

4 總結(jié)與展望

由于研究和應(yīng)用條件的差異，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的種屬差別、臨床樣本量偏小、取樣樣本單一(大多數(shù)評(píng)估allo-HSCT后腸道微生物特征的研究?jī)H依靠直腸取樣)以及腸道微生物群可能受到許多其他因素的影響，使得我們需要更多的研究來(lái)揭示這些機(jī)制，更好地描述腸道細(xì)菌介質(zhì)對(duì)GVHD的作用，最終建立新策略來(lái)調(diào)節(jié)腸道菌群，減輕GVHD，同時(shí)維持宿主免疫功能，改善allo-HSCT的預(yù)后。