腦卒中代謝組學(xué)的研究進(jìn)展

肖 鈺，劉麗麗，鐘 鏑綜述，李國(guó)忠審校

腦卒中的診斷主要依賴病史及查體，輔以影像學(xué)檢查[1]，不同的影像學(xué)檢查有耗時(shí)，成本較高等不足，因此有必要開(kāi)發(fā)有價(jià)值的生物標(biāo)志物以預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)，快速準(zhǔn)確地診斷，在不同類型腦卒中之間及與其他疾病鑒別[2]。它的損傷機(jī)制涉及多條代謝通路，而代謝組學(xué)這一新興技術(shù)在發(fā)現(xiàn)并分析特異性生物標(biāo)志物、研究病理生理機(jī)制方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[3，4]。每年腦卒中的代謝組學(xué)研究不斷更新，本文對(duì)不同類型腦卒中及其病理生理過(guò)程、腦卒中相關(guān)因素的代謝組學(xué)最新研究做一總結(jié)，增進(jìn)對(duì)腦卒中損傷機(jī)制的理解，為其生物標(biāo)志物研究提供參考。

1 代謝組學(xué)

1.1 定義 代謝組學(xué)(Metabolomics)是對(duì)細(xì)胞、組織和體液等生物樣本代謝譜的系統(tǒng)研究技術(shù)，可定性定量分析生物體受干擾后其代謝中間物和終產(chǎn)物的變化，反應(yīng)其代謝動(dòng)態(tài)規(guī)律，從而研究生物體代謝途徑，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門新興組學(xué)[3，4]。

1.2 方法 核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)和質(zhì)譜法(mass spectrometry，MS)是代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)，目前常用的標(biāo)本是最容易收集的血清，血漿，尿液。根據(jù)是否預(yù)設(shè)識(shí)別物和數(shù)據(jù)分析，分為非靶向和靶向兩種方法。非靶向方法可比較不同分組之間的代謝差異，常用于開(kāi)發(fā)新的代謝標(biāo)志物，但準(zhǔn)確性較低，可能得到未知的化學(xué)物質(zhì)，而靶向法可在識(shí)別潛在生物標(biāo)記物之后進(jìn)一步驗(yàn)證，有較高的特異性[4]。

2 腦卒中代謝通路及標(biāo)志物研究

2.1 短暫性腦缺血發(fā)作(TIA，transient cerebral ischemia)及腦梗死 在腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷的過(guò)程中，氧供和能量的迅速耗竭可引起活躍的氧化應(yīng)激、炎癥、血腦屏障受損及興奮性氨基酸釋放等，其中的代謝途徑除了能量和脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、氧化應(yīng)激外[4，5]，還包括葉酸代謝、一氧化氮代謝、嘌呤代謝通路[6，7]。

血漿代謝組學(xué)識(shí)別卒中后不同時(shí)間的代謝物有很高的準(zhǔn)確性[8]。CAMBRAY S等發(fā)現(xiàn)局灶性缺血小鼠血漿中維生素D3水平減低，神經(jīng)酸水平增高，8-氧-dGTP逐漸增加，可輔助估計(jì)卒中發(fā)作時(shí)間和TIA診斷。研究者認(rèn)為維生素D3可減少卒中引起的腦損傷；神經(jīng)酸這一不飽和脂肪酸的增高反映了受損神經(jīng)元膜或其他結(jié)構(gòu)的快速氧化；隨時(shí)間增加的8-氧-dGTP與缺血性組織DNA氧化損傷有關(guān)[8]。ABE T等利用短暫大腦中動(dòng)脈閉塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型對(duì)小鼠大腦進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在缺血組織核心及周圍，磷酸肌酸(P-Cr)和神經(jīng)酰胺(Cer d18：1/18：0)隨著時(shí)間的推移逐漸積累，它們有神經(jīng)保護(hù)作用，是可能的腦缺血生物標(biāo)志物[9]。

Miekus等首次用液相萃取毛細(xì)管電泳法同時(shí)分析多個(gè)小分子生物標(biāo)志物，通過(guò)測(cè)定缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)患者尿液中的生物胺(biogenic amines，BAs)，分析了BAs水平的影響因素如出血，β受體阻滯劑的使用，病程長(zhǎng)短，感染等，并提出BAs及其前體氨基酸和主要代謝物可輔助IS早期診斷[2]。

預(yù)測(cè)高血壓患者IS的研究示，患有高血壓的IS患者血漿代謝物譜與對(duì)照組存在明顯差異，GUO 等篩選出9-順式視黃醛，DL-吲哚-3-乳酸，蓖麻酸甲酯等12種代謝物作為潛在生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)高血壓患者的 IS，代謝途徑包括視黃醇代謝、鞘脂及糖磷脂代謝、賴氨酸及酪氨酸代謝、胰蛋白酶代謝[10]。

缺血灶之外的腦區(qū)對(duì)于卒中后代償很關(guān)鍵[11]。HU等通過(guò)研究大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)腦代謝的影響，發(fā)現(xiàn)幕上缺血可影響對(duì)側(cè)小腦代謝。兩個(gè)腦區(qū)最明顯的差異是右小腦各時(shí)間點(diǎn)N-乙酰天冬氨酸(N-acetyl aspartate，NAA)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異而左腦半球NAA明顯下降。雙側(cè)小腦谷氨酰胺水平明顯升高，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)水平在1 h時(shí)降低，24 h時(shí)明顯升高。作者還提出NMR可用于體外臨床活檢[12]。卒中后代償主要依賴于梗死區(qū)周圍和對(duì)側(cè)同位區(qū)的可塑性[11]，這篇文章為研究梗死對(duì)側(cè)同位區(qū)的代謝變化提供了參考。

2.2 缺血再灌注及缺血耐受 缺血-再灌注損傷(ischemic reperfusion injury，IRI)的機(jī)制包括氧化應(yīng)激、炎癥、白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用、鈣超載、細(xì)胞凋亡等方面，它引起的組織代謝功能的紊亂可表現(xiàn)在體液或組織代謝物質(zhì)譜的變化上[4，7]。Huang等在分析單側(cè)腦組織的代謝組成后發(fā)現(xiàn)，在tMCAO大鼠和永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)缺血再灌注損傷亞急性期，NAA、GABA等減少，乳酸增加。但tMCAO大鼠中，局灶性腦缺血再灌注可減輕病理?yè)p傷程度。這說(shuō)明IS及再灌注在能量代謝、三羧酸循環(huán)、GABA代謝等方面造成了廣泛的影響[13]。BARANOVICOVA E等用全腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯苛嗽俟嘧⒑笊窠?jīng)元遲發(fā)性死亡時(shí)的代謝變化，發(fā)現(xiàn)缺血損傷可導(dǎo)致糖酵解通路的紊亂：酮體水平升高，三酰甘油的利用增加，糖酵解中間體水平隨著葡萄糖的升高而降低，研究者還發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯、丙酮酸、乳酸和亮氨酸可很好的鑒別缺血血漿和對(duì)照組血漿[14]。

其他組織或器官的變化與腦卒中的長(zhǎng)期預(yù)后相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)，健康大鼠的大腦出現(xiàn)明顯代謝變化，但肝臟和血漿的代謝變化較少。而IS急性期，大鼠的大腦，肝臟和血漿代謝都發(fā)生明顯變化。在再灌注期間，代謝變化按組織特異性的順序發(fā)生：首先引起腦內(nèi)代謝改變，血漿代謝物在隨后的急性修復(fù)期發(fā)生變化，周圍器官、肝臟最后出現(xiàn)延遲效應(yīng)。缺血及再灌注和衰老都影響了葡萄糖代謝、氨基酸代謝、炎癥、氧化應(yīng)激等通路，而檸檬酸、賴氨酸和酪氨酸是缺血及再灌注中與年齡無(wú)關(guān)的潛在代謝標(biāo)志物[15]。這不僅提示我們腦卒中會(huì)引起多組織多器官的病生改變，也提示我們?cè)谀X卒中代謝研究中注意代謝物會(huì)受多因素影響。

缺血預(yù)適應(yīng)有較好的臨床前景[16]，在用全腦缺血模型模擬心臟驟停后的腦代謝研究中，研究者還關(guān)注了缺血耐受這一現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理組對(duì)代謝恢復(fù)的保護(hù)作用表現(xiàn)為肌酸水平明顯高于無(wú)預(yù)處理組[14]。

2.3 心源性卒中 心房顫動(dòng)是腦卒中的危險(xiǎn)因素，雖然有多種風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分用來(lái)評(píng)估是否需抗凝治療，但不能用于未診斷出房顫的患者，因此有必要篩選心源性卒中的生物學(xué)標(biāo)志物[17，18]。通過(guò)分析心源性及非心源性的卒中患者代謝譜發(fā)現(xiàn)，在有心臟栓塞高風(fēng)險(xiǎn)的腦卒中患者中，兩種中鏈酰基肉堿(癸酰肉堿，辛酰肉堿)的水平明顯高于低或中等風(fēng)險(xiǎn)組，可作為心源性卒中的標(biāo)志物，它們的升高也與卒中復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)[19]。

2.4 腦出血 ICH代謝標(biāo)志物的相關(guān)研究較缺血少，可能與它容易通過(guò)頭CT進(jìn)行及時(shí)診斷相關(guān)。Zhang等用3-羥基丁酰肉堿(C4-OH)、戊二酰肉堿(C5DC)、十四酰肉堿(C14)等11個(gè)指標(biāo)建立了預(yù)測(cè)模型，以區(qū)別腦出血與IS，可見(jiàn)代謝組學(xué)是一種可分析不同腦卒中代謝物差異的良好工具[20]。

在一篇關(guān)于心肌梗死(myocardial infarction，MI)，IS，ICH的研究中(912 MI，1146 IS，1138 ICH)，作者發(fā)現(xiàn)與脂蛋白在心肌梗死及IS中的顯著作用不同，沒(méi)有脂蛋白顆粒與ICH相關(guān)，但糖蛋白乙酰、酮體、葡萄糖和二十二碳六烯酸的水平與3種疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均相關(guān)[21]。

3 其他腦卒中相關(guān)因素的代謝組學(xué)研究

卒中病因多樣[1]，有些代謝組學(xué)研究雖未直接關(guān)注腦卒中，但與相關(guān)因素如高血壓，攜氧能力等有關(guān)。這再次提示代謝標(biāo)志物易受各種因素影響，應(yīng)進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，統(tǒng)一基線，才能得到特異標(biāo)志物。

攜氧能力是影響心腦血管疾病臨床表現(xiàn)及預(yù)后的因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)，高攝氧量峰值(peak oxygen uptake，VO2)人群中，廣譜?；鈮A、丙氨酸、谷氨酰胺/谷氨酸的水平較低[22]。高血壓是腦卒中的危險(xiǎn)因素，Bai等指出原發(fā)性高血壓患者中，甘氨酸(Gly)、C10、Phe/Tyr較健康人群降低，鳥(niǎo)氨酸(Orn)、Orn/Cit、C5-OH/C8升高[23]?？剐牧字贵w綜合征是一種可引起腦卒中的慢性免疫性疾病，Palisi A等首次分析了其代謝譜，發(fā)現(xiàn)它的代謝異常與甲基群供體、酮體和氨基酸的代謝有關(guān)[24]。

另外，研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸、高香草酸、乳酸等11個(gè)指標(biāo)在清醒狀態(tài)下的水平明顯高于睡眠時(shí)的小鼠，這提示我們覺(jué)醒和睡眠會(huì)影響嘧啶和葡萄糖酸鹽代謝途徑[25]，在腦卒中研究中也應(yīng)該注意留取標(biāo)本時(shí)患者或動(dòng)物模型的狀態(tài)以減少干擾因素。

4 展 望

以上研究的動(dòng)物模型多為動(dòng)脈閉塞，而顱內(nèi)靜脈系統(tǒng)血栓臨床表現(xiàn)多樣，常因不典型的臨床表現(xiàn)影響診斷[26]，其代謝組學(xué)分析較少，一些深靜脈血栓的代謝研究可以為靜脈竇血栓進(jìn)行相關(guān)研究提供參考。Cao等觀察到深靜脈血栓形成后引起糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等途徑的變化，找到7種大鼠模型和人群均有差異的代謝物，有助于診斷深靜脈血栓形成[27]。Sung Y等對(duì)深靜脈血栓小鼠的血清和靜脈壁組織都做了分析，發(fā)現(xiàn)其代謝紊亂集中在能量代謝，鞘脂質(zhì)和腺苷代謝途徑[28]。如能有顱內(nèi)靜脈系統(tǒng)標(biāo)志物，可以為靜脈竇血栓的及時(shí)診斷提供依據(jù)。

也有研究通過(guò)代謝組學(xué)比較腦卒中藥物治療組與對(duì)照組的代謝差異，觀察藥物神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制，如丹參酸-冰片的聯(lián)合使用研究[29]，溶栓后銀杏內(nèi)酯的保護(hù)作用研究[30]。這拓展了代謝組學(xué)的應(yīng)用，如聯(lián)合影像學(xué)，臨床評(píng)分等共同評(píng)價(jià)，可進(jìn)一步完善藥物機(jī)制。

以上多研究發(fā)現(xiàn)腦卒中存在代謝變化，但不同研究的代謝物結(jié)果也不同，原因可能在于技術(shù)平臺(tái)、樣本及采樣時(shí)間不同，也可能與人群差異，藥物等相關(guān)[4]。選擇合適的實(shí)驗(yàn)方法和嚴(yán)密的設(shè)計(jì)是充分利用代謝組學(xué)的基礎(chǔ)，如何利用它尋找公認(rèn)的差異代謝物是研究的難點(diǎn)，將代謝組學(xué)及其他組學(xué)數(shù)據(jù)整合可能會(huì)提供更全面的評(píng)估[3，4]，從而明確機(jī)制，提高不同類型腦卒中的診斷治療的及時(shí)性。