非編碼RNA與缺血性腦卒中后血管新生的研究進(jìn)展

黃麗丹，陶華，陳潤(rùn)森，許向明 綜述 鐘望濤，崔理立 審校

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 湛江 524000

目前，治療缺血性腦卒中最有效的方法是靜脈溶栓，但是也僅有不超過(guò)1/3的患者通過(guò)血管再通，病情得到改善。鑒于多數(shù)患者預(yù)后不良，臨床迫切需要更有效的治療手段。已有研究表明，當(dāng)大腦的供血?jiǎng)用}嚴(yán)重狹窄或閉塞時(shí)，血流通過(guò)新生血管側(cè)支循環(huán)的方式，改善受損腦組織中的缺血缺氧狀態(tài)，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)[1]。也有研究證明腦缺血部位毛細(xì)血管密度較高的患者預(yù)后較好，死亡率亦較低[2]。因此，改善缺血區(qū)域的血管新生能力被認(rèn)為是缺血性腦卒中的有效治療方法之一[3]。

1 非編碼RNA在血管新生調(diào)控中的特殊性

已有研究發(fā)現(xiàn)，許多血管生成因子和信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生[4]，例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，是促血管生成的關(guān)鍵調(diào)控分子。在龐大的人類基因組中，編碼蛋白質(zhì)的DNA片段所占比例不超過(guò)2%，其余約98%的DNA 序列無(wú)蛋白質(zhì)編碼功能。后者的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被稱為非編碼RNA(ncRNAs)，這提示ncRNAs 在血管生成過(guò)程中，可能較蛋白編碼分子發(fā)揮更為廣泛的調(diào)控作用。

事實(shí)上，ncRNAs 可根據(jù)長(zhǎng)度劃分為兩類：小ncRNAs (＜200 bp，包 括piRNA、siRNA 和miRNA、snoRNA 等)和長(zhǎng)ncRNA(lncRNA，＞200 bp)[5]。近年來(lái)，大量研究證實(shí)ncRNAs 在血管生成過(guò)程中的功能[6-8]，并且參與缺血性腦卒中后的病理恢復(fù)過(guò)程[9-10]，這提示它們可能是值得關(guān)注的潛在調(diào)控分子。

2 非編碼RNA在腦梗死后血管新生中的研究

2.1 miRNA 與腦梗死后的血管新生 微小RNA(miRNA)是一類保守的非編碼小RNA，通過(guò)靶向結(jié)合mRNA 的3'-非翻譯區(qū)(3'UTR)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。作為轉(zhuǎn)錄后基因沉默的重要介導(dǎo)，miRNA 在缺血性中風(fēng)的病理過(guò)程中起著重要作用。JIN 等[11]通過(guò)檢測(cè)急性腦梗死患者和健康對(duì)照者血漿中5 種血管生成相關(guān)miRNA (miR-126、miR-130a、miR-222、miR-218 和miR-185)的 表達(dá) 水平，發(fā) 現(xiàn)miR-126 和miR-130a 的表達(dá)水平與AIS 患者的疾病風(fēng)險(xiǎn)、嚴(yán)重程度和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平相關(guān)。

2.1.1 miR-126 和miR-210 有學(xué)者認(rèn)為，miR-126是內(nèi)皮細(xì)胞中最豐富的miRNA，在血管生成中起著至關(guān)重要的作用[12]。PAN等[13]觀察到miR-126過(guò)表達(dá)通過(guò)激活PI3K/AKT/eNOS 途徑增加內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的NO 產(chǎn)生，促進(jìn)EPC 的增殖、遷移和管形成能力；轉(zhuǎn)染miR-126的EPC顯著減少M(fèi)CAO小鼠的梗死體積和神經(jīng)功能缺損評(píng)分，并可見(jiàn)腦微血管密度增加、腦血流量的改善和血管生成現(xiàn)象。也有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-126-3p和miR-126-5p的過(guò)表達(dá)通過(guò)下調(diào)PTPN9 和激活A(yù)KT/ERK 信號(hào)通路，促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖、遷移和管形成，改善缺血性小鼠腦梗死體積，促進(jìn)腦缺血后血管重塑，并進(jìn)一步改善神經(jīng)行為恢復(fù)[14]。相反地，在體外和動(dòng)物模型中，miRNA-126受EGFL7干擾后，可導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路下調(diào)，并抑制HUVEC的管形成[15]。據(jù)報(bào)道，缺氧誘導(dǎo)的miR-210 是缺氧反應(yīng)中血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，因其在低氧誘導(dǎo)條件下均一致表達(dá)上調(diào)而被認(rèn)為是低氧標(biāo)志性miRNA。miR-210 過(guò)表達(dá)可通過(guò)調(diào)控其靶蛋白BDNF 的表達(dá)水平，促進(jìn)缺血性小鼠腦的血管生成和神經(jīng)發(fā)生，進(jìn)而改善長(zhǎng)期神經(jīng)行為結(jié)果[12]。有研究以環(huán)肽偶聯(lián)外泌體(RGD-exo)作為遞送系統(tǒng)，將miR-210 遞送至MCAO 小鼠腦部，缺血區(qū)域VEGF表達(dá)增加，誘導(dǎo)局灶性血管生成，從而提高M(jìn)CAO小鼠存活率[16]。

2.1.2 miR-26a、miR-195 和miR-150 如前 所述，VEGF 是促血管生成的關(guān)鍵調(diào)控分子，miRNA 通過(guò)直接或間接作用于VEGF 及其相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)控血管生成的過(guò)程[7]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-26a 通過(guò)激活A(yù)KT 和ERK1/2 途 徑 上 調(diào)HIF-1a 的表達(dá)，從而介導(dǎo)VEGF 的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)中細(xì)胞增殖和血管生成[17]。與此相反，miR-195 通過(guò)下調(diào)其靶基因VEGFA 的表達(dá)水平，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞侵襲能力和管形成[18]。相似地，miR-150 過(guò)表達(dá)特異性地抑制VEGF的表達(dá)，從而降低MCAO大鼠梗死區(qū)周圍腦組織的血管密度，抑制BMVECs 的血管生成、增殖和遷移[19]。

2.1.3 miR-140-5p 和miR-377 鑒于部分miRNA 對(duì)血管生成具有抑制作用，有多個(gè)研究證實(shí)可通過(guò)敲低或抑制靶miRNA，以促進(jìn)血管生成的基因表達(dá)和增加腦微血管形成。SUN 等[20]研究表明，抑制miR-140-5p 可以增加其靶基因VEGFA 的表達(dá)，從而增強(qiáng)HUVECs的增殖、侵襲、管形成。另有研究報(bào)道，抑制miR-377可調(diào)節(jié)EGR2的抗炎作用和VEGF的血管生成作用，促進(jìn)了BMECs細(xì)胞增殖、遷移和毛細(xì)血管形成，并通過(guò)抑制MCAO大鼠的腦炎癥和促進(jìn)血管生成來(lái)減輕缺血性腦損傷[21]。

2.1.4 miR-124、miR-137 和miR-191 等 除了VEGF，miRNA 亦可通過(guò)其他血管生成因子及信號(hào)通路，調(diào)控血管新生過(guò)程。DOEPPNER等[22]證明鋰通過(guò)增加miR-124 表達(dá)，降低RE1 沉默轉(zhuǎn)錄因子豐度，從而促進(jìn)缺血后神經(jīng)重塑和血管生成，進(jìn)而改善腦卒中小鼠神經(jīng)功能缺損及長(zhǎng)期預(yù)后。也有研究表明，miR-137在MCAO小鼠中通過(guò)Notch信號(hào)通路靶向調(diào)控NR4A2，增加內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和血管生成[23]，而miR-191 則直接調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮鋅指1 (VEZF1)，導(dǎo)致VEZF1下游的各種血管生成因子發(fā)生變化，進(jìn)而抑制缺血性腦損傷后血管生成[24]。此外，下調(diào)miRNA-27b通過(guò)誘導(dǎo)AMPK 的活化，增加了BMEC 管形成和遷移，增強(qiáng)MCAO 小鼠腦缺血邊界區(qū)血管生成，進(jìn)而促進(jìn)缺血性中風(fēng)后的恢復(fù)[25]，而miR-493 則通過(guò)直接靶向MIF 抑制RBMEC 的管形成和遷移，當(dāng)其表達(dá)水平被下調(diào)后，缺血腦組織的毛細(xì)血管密度增加，梗塞體積減少并可見(jiàn)MCAO 大鼠的神經(jīng)功能缺損得到明顯改善[26]。

2.2 lncRNA 與腦梗死后的血管新生 LncRNA被定義為超過(guò)200 個(gè)核苷酸，沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，曾被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的噪音。然而，越來(lái)越多的研究提示，lncRNA 是血管生成過(guò)程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，參與缺血性腦卒中后的血管生成過(guò)程[27-28]。

2.2.1 Meg3 Meg3 廣泛表達(dá)于腦和內(nèi)皮細(xì)胞。Meg3失活可促進(jìn)血管生成的基因表達(dá)和增加腦微血管形成。研究報(bào)道，lncRNA Meg3 在體內(nèi)和體外均負(fù)調(diào)節(jié)Notch 信號(hào)通路，減少缺血性腦組織的血管生成。Meg3 的沉默增加了內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和管形成[27]。SHEN 等[29]證明敲 除Meg3 促 使 血 管生成 相 關(guān)基因Vegfa 和Vegfr2 上調(diào)，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管形成，增加缺血腦的毛細(xì)血管密度，也可通過(guò)調(diào)節(jié)p53/NOX4 軸增強(qiáng)促HIF-1α和VEGF 表達(dá)，促進(jìn)腦梗死后的血管生成，減少由OGD/R誘導(dǎo)的RBMVECs凋亡[30]。

2.2.2 MALAT1 MALAT1 也稱為核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本2(NEAT2)，是高度保守的lncRNA。在腦缺血后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Malat1是上調(diào)程度最高的lncRNA 之一，其參與保護(hù)BMECs[31]。有報(bào)道認(rèn)為Malat1在體外和體內(nèi)均與Bim和E-選擇素結(jié)合，在腦微血管系統(tǒng)中發(fā)揮抗凋亡和抗炎作用，以減少缺血性腦 損 傷[9]。REN 等[32]進(jìn) 一 步 發(fā) 現(xiàn)，Malat1 通 過(guò) 靶 向miR-145 直接上調(diào)VEGF-A 和ANGPT2，促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，減少由OGD 誘導(dǎo)的BMECs 凋亡。此外，通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染，可見(jiàn)shMALAT1 降低了15-脂氧合酶1(15-LOX1)、VEGF 的表達(dá)以及信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(pSTAT3)的磷酸化，揭示了MALAT1 可能通過(guò)15-LOX1/STAT3 信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管生成[33]。

2.2.3 SNHG12 SNHG12 是一種新型的lncRNA，在OGD處理后的BMEC和MCAO小鼠腦中表達(dá)均顯著增加。在OGD/R 條件下，SNHG12 作為miR-150的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并促進(jìn)促血管生成因子VEGFA 和FGFb 的表達(dá)，從而改善MCAO 小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)[34]。值得一提的是，MALAT1 在OGD 期間和之后，也可見(jiàn)VEGFA和FGFb mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平增加，進(jìn)而促進(jìn)BMEC血管生成，其對(duì)抗缺血性腦損傷的保護(hù)作用的潛在機(jī)制是通過(guò)miR-199a介導(dǎo)的[35]。

2.2.4 其他lncRNAs 除此之外，尚有部分lncRNAs充當(dāng)miRNA海綿，作用于血管生成因子VEGF及Notch 等通路，參與腦缺血后血管生成的過(guò)程。SNGH1在OGD/R條件下，直接靶向吸附miR-199a，促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管生成[36]。HIF1A-AS2則充當(dāng)miR-153-3p的海綿，促進(jìn)HIF-1α/VEGFA/Notch1級(jí)聯(lián)的激活，上調(diào)HIF-1α，從而促進(jìn)缺氧時(shí)HUVEC的活力、遷移能力和管形成[37]。NEAT1 通過(guò)靶向miR-377，上調(diào)VEGFA、SIRT1 和BCL-XL 的表達(dá)，從而促進(jìn)了OGD誘導(dǎo)的BMEC的存活和血管生成[38]。

2.3 cirRNA 與腦梗死后的血管新生 環(huán)狀RNA(cirRNA)是一類特殊的非編碼RNA，近年來(lái)被證實(shí)在生物活動(dòng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用?；诨蛐酒纳镄畔W(xué)分析表明，腦缺血后大量cirRNAs異常表達(dá)，提示circRNAs和腦梗死后病理?yè)p傷和修復(fù)過(guò)程密切相關(guān)[39-42]。

2.3.1 cirRNA 參與腦梗死恢復(fù)過(guò)程 既往研究表明，circRNA 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)機(jī)制在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。據(jù)報(bào)道，circTLK1作為ceRNA 抑制miR-335-3p 的活性，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。敲除circTLK1 可顯著減少M(fèi)CAO 小鼠腦梗死體積，減輕神經(jīng)元損傷，并改善隨后的長(zhǎng)期神經(jīng)功能缺損[43]。circDLGAP4 抑 制miR-143 活 性，從 而 導(dǎo) 致HECTD1 表達(dá)增加，而circDLGAP4 的過(guò)表達(dá)顯著減少了MACO 小鼠梗塞面積并改善神經(jīng)功能缺損[44]。circHectd1在MCAO小鼠腦和AIS患者血液中表達(dá)增加，其作為ceRNA抑制miR-142活性，導(dǎo)致TIPARP表達(dá)的抑制，進(jìn)一步將其敲除后，可見(jiàn)tMCAO小鼠的梗死面積顯著減少，神經(jīng)元損傷減輕[45]。另有人體研究發(fā)現(xiàn)，circ Hectd1 的表達(dá)與腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、嚴(yán)重程度、炎癥和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[46]，這提示其是腦梗死疾病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的潛在生物標(biāo)記。

2.3.2 cirRNA 參與血管新生過(guò)程 目前，circRNAs參與血管新生過(guò)程的機(jī)制研究不多，主要集中于腫瘤及病理性血管生成領(lǐng)域，例如通過(guò)HIF-1α信號(hào)通路參與Moyamoya病的血管生成[47-48]，通過(guò)激活VEGF/VEGFA等信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤血管生成和發(fā)展[49-50]。此外，也有大量研究發(fā)現(xiàn)，circRNA參與調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病的HUVECs 增殖、凋亡和血管生成基因的表達(dá)[51-53]。

3 臨床轉(zhuǎn)化的前景與挑戰(zhàn)

如上所述，大量ncRNAs 被證實(shí)參與腦梗死后的血管新生過(guò)程，但是尚無(wú)相關(guān)臨床轉(zhuǎn)化研究，故而這些ncRNAs 是否可以作為腦梗死后的新治療靶點(diǎn)，以及預(yù)后的生物標(biāo)志物尚不清楚。盡管如此，根據(jù)現(xiàn)有研究，在開(kāi)展臨床轉(zhuǎn)化研究前需要考慮如下因素。

首先，許多microRNA 和lncRNA 在神經(jīng)元細(xì)胞，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞中差異表達(dá)，circRNA是否有同樣的細(xì)胞特異性表達(dá)方式尚不清楚。其次，microRNA 和lncRNA 的表達(dá)因其不同的半衰期而具有時(shí)間依賴性，提示其作為中風(fēng)患者的診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物可能不太可靠，但是circRNA 因具有相對(duì)更長(zhǎng)的半衰期，而使得它們可能成為用于中風(fēng)診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物的理想候選者。最后，已有動(dòng)物研究通過(guò)慢病毒載體攜帶相關(guān)miRNA經(jīng)顱入腦，促進(jìn)血管生成從而改善神經(jīng)功能缺損，但是這種方法因?yàn)榘踩詿o(wú)法臨床轉(zhuǎn)化。因此，如何應(yīng)對(duì)血-腦屏障對(duì)ncRNAs的阻滯作用也很關(guān)鍵。

總之，盡管面臨各種挑戰(zhàn)，但靶向調(diào)控ncRNAs仍然是腦梗死后血管新生的潛在治療策略。隨著對(duì)ncRNAs 調(diào)控機(jī)制的深入研究，相信在不久的將來(lái)可找到合適的調(diào)控分子，實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化，并有機(jī)會(huì)發(fā)展成為腦梗死重要的治療策略。