全基因組測(cè)序在結(jié)核分枝桿菌研究中的應(yīng)用

張潔 任怡宣 潘麗萍 張宗德

在全球范圍內(nèi)，結(jié)核病是導(dǎo)致死亡的十大原因之一，據(jù)估計(jì)每年新增的結(jié)核病患者超過1000萬例[1]。越來越多的新發(fā)及復(fù)發(fā)結(jié)核病患者對(duì)一線抗結(jié)核藥品利福平和異煙肼產(chǎn)生了耐藥性(即耐多藥結(jié)核病)[1]。在過去的幾十年中，分子生物學(xué)方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的診斷和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的耐藥性分析?；蚍中图夹g(shù)為許多低發(fā)病率國(guó)家的結(jié)核病分子流行病學(xué)研究提供了重要的幫助，有助于發(fā)現(xiàn)疫情[2]。隨著生物信息的發(fā)展，測(cè)序技術(shù)的日益成熟，且成本逐漸降低。以基因組DNA為基礎(chǔ)、計(jì)算機(jī)技術(shù)為輔助的全基因組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對(duì)MTB的研究中，并迅速從實(shí)驗(yàn)室研究轉(zhuǎn)向臨床和公共衛(wèi)生應(yīng)用, 為解決MTB的傳播和耐藥問題提供了很大的幫助。

一、全基因組測(cè)序在結(jié)核病流行病學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)

高收入且結(jié)核病低流行國(guó)家的結(jié)核病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中，重要的一個(gè)環(huán)節(jié)是接觸者追蹤，針對(duì)的對(duì)象是接觸傳染性結(jié)核病的人群，以便確定應(yīng)接受預(yù)防性治療的接觸者，并減少進(jìn)一步的傳播[3]。但是流行病學(xué)調(diào)查耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，患者之間通過短期或臨時(shí)接觸而產(chǎn)生的流行病學(xué)聯(lián)系不容易被發(fā)現(xiàn)。而分子流行病學(xué)整合了現(xiàn)有的流行病學(xué)數(shù)據(jù)和分子分型結(jié)果，在結(jié)核病傳播鏈的研究中起到了極其重要的作用。

在過去的20年里，分子分型方法極大地提高了大家對(duì)結(jié)核病流行病學(xué)的認(rèn)識(shí)。目前有3種主要的基因分型方法：即IS6110限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)分型法、間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)和多位點(diǎn)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列 (variable number of tandem repeats,VNTR)分型。這些常規(guī)的基因分型方法在評(píng)估同源性方面價(jià)值有限。全基因組測(cè)序(whole-genome sequencing，WGS)方法是利用DNA測(cè)序平臺(tái)重新構(gòu)建生物體基因組的完整DNA序列。瑞士Stucki等[4]在一項(xiàng)全國(guó)性的研究中，對(duì)520例結(jié)核病患者分離出來的標(biāo)本進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)分子分型(Spoligotyping和VNTR分型)，鑒定出來的35個(gè)傳播簇中的18個(gè)被WGS證明大于12個(gè)單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphisms，SNPs)，這表明常規(guī)的基因分型方法可能會(huì)高估MTB在瑞士這種發(fā)病率較低的國(guó)家的傳播[4]。而也有研究認(rèn)為當(dāng)使用常規(guī)基因分型工具時(shí)，外源性再感染而引起的結(jié)核病由于與第一次疾病發(fā)作間期出現(xiàn)的菌株基因型相似，可能會(huì)被錯(cuò)誤地歸類為復(fù)發(fā)。這些錯(cuò)誤分類低估了MTB在高發(fā)病率環(huán)境中的傳播[5]。由于不同的MTB菌株SNPs發(fā)生相同突變的可能性很小，因此，基于鑒定SNPs的WGS基因分型較其他分子分型方法具有更高的分辨率。

二、 WGS在MTB研究中的應(yīng)用

(一)WGS在MTB譜系或亞種鑒定(菌株分型)中的應(yīng)用

有研究認(rèn)為，MTB最有可能起源于非洲，而在全球的傳播主要受人類活動(dòng)的推動(dòng)，即人類的探索、遷徙、貿(mào)易和戰(zhàn)爭(zhēng)等活動(dòng)均可推動(dòng)MTB在全球的傳播[6-7]。人感染的MTB具有高度的克隆性，根據(jù)SNP的差異和缺失可以將MTB復(fù)合群分為7個(gè)主要的適應(yīng)人類的系統(tǒng)發(fā)育譜系，即第1譜系至第7譜系。而東亞地區(qū)占主導(dǎo)地位的是第2譜系，其中“北京家族”菌株是在全球傳播和流行最為廣泛的菌株之一[8]。WGS證實(shí)了東格陵蘭及加拿大魁北克省努納維克分離的MTB菌株大多來自第4譜系(歐美系)[9-10]，越南的研究表明，長(zhǎng)期潛伏性感染的MTB第1譜系以及最近引進(jìn)傳播的“北京家族”和第4譜系菌株,導(dǎo)致了該地區(qū)結(jié)核病傳播的復(fù)雜性[11]。上海的結(jié)果研究表明，雖然我國(guó)結(jié)核病患者數(shù)多，但MTB的遺傳多樣性卻不大，我國(guó)MTB 99.4%屬于第2譜系和第4譜系的3個(gè)子譜系[12]。

(二) WGS在結(jié)核病發(fā)病模式及疫情控制中的應(yīng)用

結(jié)核病患者發(fā)病主要有兩種途徑，一種是既往感染過，之后經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的潛伏而發(fā)病，稱為內(nèi)源性復(fù)燃[13]；另一種為近期傳播導(dǎo)致的結(jié)核病。MTB產(chǎn)生耐藥可能是兩種機(jī)制造成的：一是治療不足引發(fā)的獲得性耐藥；二是感染耐藥MTB(原發(fā)耐藥)。WGS可以通過比較不同患者分離出來的菌株基因型是否相同以及同一患者前后兩次發(fā)病時(shí)分離出來的菌株基因型是否相同從而判斷結(jié)核病發(fā)病原因及耐藥原因。而區(qū)分患者的發(fā)病模式對(duì)結(jié)核病控制策略的制定具有非常重要的意義，如果一個(gè)地區(qū)由于近期傳播導(dǎo)致的結(jié)核病患者比例較高，說明結(jié)核病正在傳播，應(yīng)該將主動(dòng)迅速發(fā)現(xiàn)傳染源、切斷傳播途徑作為防治工作的重點(diǎn)；而如果大部分患者是由于內(nèi)源性復(fù)燃引起的，證明結(jié)核病的傳播發(fā)生在過去，應(yīng)該將對(duì)患者進(jìn)行規(guī)范化治療和管理作為防治工作的重心，可以對(duì)既往感染者中的高危人群進(jìn)行篩查和采取預(yù)防性干預(yù)措施[13]。

結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家的結(jié)核病暴發(fā)調(diào)查往往僅限于調(diào)查家庭成員和其他密切接觸者，而在結(jié)核病發(fā)病率較低的國(guó)家，結(jié)核病控制的目是制止結(jié)核病的傳播，因此，除了結(jié)核病的早期診斷和治療外，調(diào)查結(jié)核病暴發(fā)情況也是非常重要的[14]。越來越多的研究表明WGS在MTB疫情控制方面發(fā)揮著重要的作用[15]。在一項(xiàng)對(duì)倫敦廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)暴發(fā)的調(diào)查中，采用WGS后證實(shí)了患者之間的關(guān)聯(lián)性，并指導(dǎo)了對(duì)早期患者的治療[16]。使用WGS進(jìn)行全國(guó)疫情調(diào)查被越來越多的國(guó)家使用，WGS也被應(yīng)用于國(guó)際跨境疫情的調(diào)查[17]。

在缺乏廣泛的流行病學(xué)數(shù)據(jù)的情況下，基于WGS的系統(tǒng)發(fā)育樹可以用來識(shí)別可能的傳染源、超級(jí)傳播者和確定傳播方向。上海的一項(xiàng)研究表明，大約1/3的耐多藥結(jié)核病患者歸因于最近的傳播，與傳統(tǒng)的基因分型方法相比，WGS目前在區(qū)分臨床MTB分離株基因型方面具有許多優(yōu)勢(shì)，并且可以有效地研究MTB分離株的傳播動(dòng)力學(xué)。WGS可提供更明確的證據(jù)，證明耐藥突變是沿傳輸鏈出現(xiàn)和固定的[18]。

(三)WGS在MTB耐藥性及其預(yù)測(cè)中的應(yīng)用

據(jù)WHO報(bào)道，2017年全世界有55.8萬例結(jié)核病患者對(duì)一線抗結(jié)核藥品利福平耐藥，其中82%的患者為耐多藥結(jié)核病患者；而這些耐多藥結(jié)核病患者中，大約有8.5%為XDR-TB[1]?；谂囵B(yǎng)的傳統(tǒng)技術(shù)方法仍然是耐藥結(jié)核病診斷和藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)的參考標(biāo)準(zhǔn)，但是這些方法耗時(shí)長(zhǎng)，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物安全要求較高。近幾年，在全球以GeneXpert MTB/RIF技術(shù)為代表的快速分子學(xué)方法檢測(cè)MTB及利福平耐藥已經(jīng)普及。WGS技術(shù)已經(jīng)鑒定出與MTB耐藥相關(guān)的許多突變，其中一些突變與適應(yīng)性相關(guān)，而另一些突變與額外的代償性突變有關(guān)，這些突變可能增加適應(yīng)性并能進(jìn)行傳播[19]。

WGS完整地描述了MTB耐藥株的基因組特征，填補(bǔ)了我們對(duì)經(jīng)典抗結(jié)核藥品和新的抗結(jié)核藥品是如何起作用的認(rèn)識(shí)上的空白，并確定了使MTB能夠逃避這些藥物影響的特定突變。一些耐藥基因的存在是眾所周知的，例如，rpoB和rpoC基因突變導(dǎo)致利福平耐藥、KatG和inhA基因的突變導(dǎo)致異煙肼耐藥,dfrA-thyA雙缺失與對(duì)氨基水楊酸耐藥性相關(guān)[20-21]。WGS確認(rèn)外排泵導(dǎo)致的藥物外流是MTB對(duì)氯法齊明和貝達(dá)喹啉的耐藥機(jī)制，這一方法仍然是鑒定正在開發(fā)的抗結(jié)核藥物的作用機(jī)制的主要途徑[22]。WGS還揭示了藥物聯(lián)合化療如何能夠有效地防止結(jié)核病治療期間出現(xiàn)耐藥。Trauner等[23]使用WGS 證明了多種活性藥物的聯(lián)合作用下，能阻止暫時(shí)性突變體在菌株種群內(nèi)的固定而避免成為耐藥優(yōu)勢(shì)菌；使用的藥物越少，耐藥性就越有可能產(chǎn)生并固定下來。

一些將基因組數(shù)據(jù)和其他功能數(shù)據(jù)結(jié)合起來的SNP數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立，MTB耐藥株相關(guān)基因突變的一些開拓性數(shù)據(jù)庫也在不斷完善[24]，基于軟件和網(wǎng)絡(luò)的工具，如MTB復(fù)合群綜合分析服務(wù)器(the comprehensive analysis server for theMycobacteriumtuberculosiscomplex，CASTB)[25]，能夠從WGS數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)中推斷菌株的耐藥性。有研究比較了這些工具在預(yù)測(cè)耐藥性方面的敏感度和特異度，發(fā)現(xiàn)上述工具對(duì)一線抗結(jié)核藥品有很好的效果；但對(duì)于二線藥物則不太理想[26-27]。數(shù)據(jù)集和數(shù)據(jù)庫的創(chuàng)建需要實(shí)施“大數(shù)據(jù)”分析方法(例如機(jī)器學(xué)習(xí)方法)[28]，非參數(shù)機(jī)器學(xué)習(xí)方法，如分類樹(CTs)和梯度提升樹(GBTs)以全基因組關(guān)聯(lián)(GWAS)為基礎(chǔ)，從復(fù)雜數(shù)據(jù)集中提取信息，通過精密的計(jì)算和分析，在預(yù)測(cè)耐藥性和發(fā)現(xiàn)新的基因突變方面將發(fā)揮重要作用。

(四) WGS在MTB微進(jìn)化研究中的應(yīng)用

臨床上從同一患者體內(nèi)分離出來的MTB樣本中同時(shí)存在敏感菌株和耐藥菌株的情況越來越引起重視，這種由于敏感和耐藥菌株共感染或敏感菌株部分亞群通過微進(jìn)化而發(fā)生的耐藥突變稱之為異質(zhì)性耐藥[29]。結(jié)核感染中的微進(jìn)化現(xiàn)象比較復(fù)雜，宿主體內(nèi)多個(gè)MTB亞克隆同時(shí)存在和發(fā)生微進(jìn)化導(dǎo)致的異質(zhì)性耐藥，必將影響患者的治療方案和監(jiān)測(cè)，并使得推斷傳播鏈的工作復(fù)雜化[30-31]。WGS不僅可以區(qū)分患者是否為混合感染，還可以用來掌握MTB的耐藥性形成過程，從而對(duì)MTB的變異程度進(jìn)行更詳盡的分析, 還能夠在傳輸鏈中觀察到變異性, 從而提高我們對(duì)MTB感染動(dòng)力學(xué)的理解[32]。及時(shí)發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，有利于及時(shí)調(diào)整治療方案并進(jìn)行有效的臨床治療。

三、WGS技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)

雖然WGS技術(shù)在MTB的傳播檢測(cè)中敏感度較高，但是用WGS構(gòu)建傳播網(wǎng)絡(luò)的細(xì)節(jié)是很困難的。傳播網(wǎng)映射高度依賴于采樣范圍、對(duì)疫情的全面抽樣，以及宿主內(nèi)環(huán)境的多樣性。不同患者的菌株基因成簇，但卻沒有其他任何直接的流行病學(xué)聯(lián)系，說明這種傳播很大程度上是在社區(qū)環(huán)境中的偶然接觸引起的[33]。傳播網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)發(fā)育重建特別具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)榫曛g關(guān)系非常密切，但是MTB的進(jìn)化速度很慢[24]。

WGS的操作流程還需統(tǒng)一化、標(biāo)準(zhǔn)化。工作流程的所有步驟，從DNA提取到測(cè)序、數(shù)據(jù)分析和報(bào)告，都應(yīng)該標(biāo)準(zhǔn)化，并有良好的文檔記錄，還應(yīng)該建立一個(gè)外部質(zhì)量評(píng)估方案。2016年，美國(guó)食品和藥物管理局發(fā)布了基于測(cè)序的傳染病診斷指南草案，WHO和歐洲疾病預(yù)防控制中心等機(jī)構(gòu)正在采取措施，實(shí)現(xiàn)MTB WGS的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化[34-35]。

WGS用于MTB的檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)共享目前仍沒有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。報(bào)告應(yīng)具有足夠的靈活性，以解決最終用戶對(duì)基因組數(shù)據(jù)解釋的差異，并允許針對(duì)特定地區(qū)的治療準(zhǔn)則和格式要求進(jìn)行定制。報(bào)告單的設(shè)計(jì)要避免使用縮寫，重要信息使用加底色、粗體和其他方式標(biāo)記，必要時(shí)納入簡(jiǎn)要說明解釋關(guān)鍵結(jié)果[36-37]。

WGS起源于一項(xiàng)基礎(chǔ)科研技術(shù)，現(xiàn)在慢慢成為現(xiàn)代臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的一部分，有望快速、更好地防控和診斷結(jié)核病，并對(duì)結(jié)核病暴發(fā)疫情進(jìn)行詳細(xì)、實(shí)時(shí)的流行病學(xué)研究。