安徽省非結(jié)核分枝桿菌臨床分離率及人群分布和耐藥性分析

包訓(xùn)迪 江躍 梁鎖 程紅燕 夏廣秀 王超 葉倩 王舒 王慶

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌外的分枝桿菌，在自然界中廣泛分布，已知的NTM數(shù)量可達(dá)190余種[1]。人和動(dòng)物均可感染NTM，主要引起肺部和皮膚病變等，臨床表現(xiàn)與肺結(jié)核相似，而且傳統(tǒng)的痰涂片、痰培養(yǎng)均不能與結(jié)核分枝桿菌相鑒別，導(dǎo)致NTM感染常被誤診為結(jié)核病或耐藥結(jié)核病，引起治療不當(dāng)，病情延誤，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[2]。隨著近年來(lái)NTM菌株分離率的增高，其危害性也越來(lái)越受到大家的重視[3]。筆者對(duì)安徽省2015—2016年度結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查收集的菌株進(jìn)行分離鑒定，初步了解安徽省NTM臨床分離株在不同人群中的分布特征及其耐藥性，為我省NTM的防治提供有效參考。

材料和方法

1.研究材料：參照《WHO耐藥監(jiān)測(cè)指南(第4版)》[4]按照分層整群抽樣的方法，在全省86個(gè)結(jié)核病門(mén)診抽取42個(gè)調(diào)查點(diǎn)，連續(xù)納入2015年9月15日至2016年8月31日的涂陽(yáng)疑似肺結(jié)核患者3047例，按照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行痰標(biāo)本酸性羅氏培養(yǎng)，對(duì)獲得的2652株培養(yǎng)陽(yáng)性菌株行菌種鑒定[對(duì)硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)和早期分泌蛋白(MPB64)膠體金法]和基因測(cè)序(16S rRNA和hsp65 DNA測(cè)序)，再對(duì)其中的NTM臨床分離株在不同人群中的分布特征和耐藥性檢測(cè)(微孔板法)進(jìn)行研究和分析。

2.試劑和儀器：(1)羅氏培養(yǎng)基(L-J)、PNB (500 mg/L)培養(yǎng)基均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異性早期分泌蛋白(MPB64)檢測(cè)試劑盒(膠體金法)購(gòu)自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司；分枝桿菌菌種鑒定采用16S rRNA 和hsp65兩個(gè)同源序列分析同源DNA序列組成差異鑒定細(xì)菌至種水平，引物合成及測(cè)序測(cè)定由上海生工生物工程有限公司完成；NTM藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)檢測(cè)試劑盒(微孔板法)由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供(含15種藥品)。(2)BACspreaderTM1100c細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀由廣東體必康生物科技有限公司提供；YK-909分枝桿菌微孔板藥敏讀儀、YK-96小型全自動(dòng)移液平臺(tái)均由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供。

3.菌種鑒定方法：(1)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)和結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行操作，應(yīng)用MPB64抗原和PNB鑒別培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性菌株進(jìn)行初步鑒定。當(dāng)PNB培養(yǎng)基有細(xì)菌生長(zhǎng)或MPB64抗原檢測(cè)呈陰性則初步鑒定為NTM。(2)挑取初步鑒定為NTM的菌株接種環(huán)一環(huán)，加入100 μl純水，渦旋振蕩重懸。95 ℃金屬浴孵育30 min，37 kHz 80 W超聲裂解15 min；離心半徑8.2 cm，12 000 r/min 離心5 min，上清液即為DNA。(3)NTM菌種鑒定的DNA引物采用16S rRNA和hsp65兩個(gè)同源序列，分析鑒定細(xì)菌至種水平。將16S rRNA和hsp65測(cè)序序列提交NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比較。依據(jù)鑒定菌種的DNA序列與參照菌種的同源性≥97%[6]來(lái)確定菌種。

4. NTM的藥敏試驗(yàn)：采用液基微孔板法[7]對(duì)選取的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株進(jìn)行15種藥品的NTM藥敏試驗(yàn)，應(yīng)用細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)菌的超聲比濁定量，按照NTM藥敏檢測(cè)試劑盒(微孔板法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作判讀。不同藥品的最低抑菌濃度(MIC)判讀耐藥的標(biāo)準(zhǔn)為：利福平：≥6 μg/ml；克拉霉素：≥16 μg/ml；亞胺培南-西司他?。骸?6 μg/ml；阿奇霉素：≥16 μg/ml；利奈唑胺：≥32 μg/ml；阿米卡星：≥64 μg/ml；乙胺丁醇：≥2.5 μg/ml；利福布?。骸? μg/ml；頭孢西?。骸?0 μg/ml；妥布霉素：≥16 μg/ml；莫西沙星：≥8 μg/ml；加替沙星：≥1 μg/ml；多西環(huán)素：≥8 μg/ml；米諾環(huán)素：≥8 μg/ml；磺胺甲唑：≥80 μg/ml。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 菌種鑒定及流行病學(xué)分布特征：對(duì)2652株培養(yǎng)陽(yáng)性菌株采用PNB培養(yǎng)和MPB64膠體金法行初步菌種鑒定，結(jié)果顯示：2530株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，122株為NTM，其中115株菌株在PNB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，116株菌株MPB64抗原檢測(cè)呈陰性(表1)；進(jìn)一步對(duì)122株NTM菌株進(jìn)行基因測(cè)序(16S rRNA和hsp65 DNA測(cè)序)，最終鑒定為NTM分離株107株[符合率為87.70%(107/122)]、結(jié)核分枝桿菌12株、諾卡菌1株、污染菌2株，NTM分離率為4.03%。不同臨床特征人群結(jié)核分枝桿菌和NTM菌株的分布情況見(jiàn)表2。

表1 MPB64抗原和PNB培養(yǎng)對(duì)NTM的檢測(cè)結(jié)果(株)

表2 不同臨床特征研究對(duì)象的結(jié)核分枝桿菌和NTM菌株分離情況

續(xù)表2

注分離率=NTM菌株數(shù)/培陽(yáng)菌株數(shù)×100%；統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)為NTM分離率在不同特征研究對(duì)象中的差異。a:指除農(nóng)民、工人、退休、待崗以外的人員，如事業(yè)單位員工、商業(yè)人員等；b：安徽省地區(qū)行政區(qū)域分布以長(zhǎng)江和淮河為界，劃分為皖北、皖中和皖南三個(gè)地區(qū)

2.NTM菌種特征序列比對(duì)結(jié)果：107株NTM經(jīng)菌種鑒定共計(jì)分離出6種優(yōu)勢(shì)流行菌種(表3)。

表3 基因測(cè)序鑒定的NTM菌種結(jié)果

3. NTM藥敏試驗(yàn)檢測(cè)：對(duì)107株NTM菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，106株獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果，1例胞內(nèi)分枝桿菌菌株復(fù)蘇失敗未獲得菌株。除外草分枝桿菌和馬賽分枝桿菌各1株，僅統(tǒng)計(jì)其他4種104株NTM的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示不同NTM對(duì)阿米卡星、利福布汀、克拉霉素和利福平的敏感度較高[分別為87.50%(91/104)、86.54%(90/104)、83.65%(87/104)、75.00%(78/104)]，對(duì)亞胺培南/西司他丁、頭孢西丁、米諾環(huán)素、多西環(huán)素等的耐藥率較高[分別為100.00%(104/104)、95.19%(99/104)、94.23%(98/104)、93.27%(97/104)](表4)。

討 論

近些年，隨著各種新診斷技術(shù)在結(jié)核病檢測(cè)中的推廣和應(yīng)用，NTM的分離率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于NTM及NTM肺病報(bào)道和研究也越來(lái)越多。NTM肺病的臨床癥狀與肺結(jié)核非常相似，極易發(fā)生誤診；又因其對(duì)傳統(tǒng)的抗結(jié)核藥品耐藥率較高，如錯(cuò)誤使用抗結(jié)核藥品治療，則效果多不理想[8-9]，易被誤診為耐藥結(jié)核分枝桿菌感染，給臨床診治帶來(lái)很大困惑。因此，NTM的鑒定和耐藥性檢測(cè)將會(huì)為區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和NTM的鑒別診斷和治療提供有力保證。

表4 不同藥品在104株不同NTM中的耐藥情況[株(耐藥率，%)]

我國(guó)2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查[10]結(jié)果顯示，NTM的分離率從1990年的4.9%升高至2000年的11.1%，繼而升高至2010年的22.9%，說(shuō)明我國(guó)的NTM病疫情呈明顯上升態(tài)勢(shì)。本研究對(duì)2652株分枝桿菌菌株，經(jīng)PNB和MPB64抗原初步鑒定分離出NTM菌株122株，經(jīng)基因測(cè)序方法最終確認(rèn)107株為NTM，檢出率為4.03%，遠(yuǎn)低于22.9%的全國(guó)平均水平，可能是本次納入的患者僅為涂陽(yáng)患者，而未納入癥狀較輕或涂陰疑似患者，從而導(dǎo)致NTM的檢出率低于實(shí)際發(fā)病率。另外，我省NTM的檢出率也低于多數(shù)沿海省份的分離率(10.20%～15.13%)[11-13]，但與周邊河南(2.9%，5/171)[14]、江蘇地區(qū)(3.37%)[15]的NTM分離率基本接近，可能與NTM的地域和地形分布有關(guān)。近年來(lái)的一些文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為，NTM分離率呈現(xiàn)沿海高于內(nèi)地、南方高于北方的地區(qū)流行特點(diǎn)[16]，提示NTM分布受地區(qū)影響；安徽省地處江淮平原，長(zhǎng)江以北多為平原地區(qū)，長(zhǎng)江以南為丘陵地區(qū)，平原地區(qū)人口眾多，結(jié)核病患者數(shù)量也較多[17]，本研究皖北皖中地區(qū)的NTM檢出率高于皖南地區(qū)，與本地區(qū)結(jié)核病的發(fā)病情況基本一致。

在不同特征人群中，NTM的檢出率也有差異。有研究指出，在60歲以上人群中分離出NTM較多，可能與該人群免疫力降低有關(guān)，也可能與疾病的相關(guān)性下降(即感染NTM并不一定發(fā)生NTM病)考慮呼吸道NTM定植有關(guān)[18]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，NTM的分離率在60歲及以上、農(nóng)民、低收入、低文化程度人群中的檢出率較高，這與本地區(qū)結(jié)核病患者的發(fā)病人群比例[10]也基本一致，提示在上述分類(lèi)人群中，結(jié)核病和NTM病的患病率均較高，在診治過(guò)程中應(yīng)重視兩病的鑒別。本研究還發(fā)現(xiàn)，復(fù)治患者的NTM分離率明顯高于初治患者，但目前尚未發(fā)現(xiàn)其他相關(guān)研究，可能與復(fù)治結(jié)核病患者更關(guān)注呼吸系統(tǒng)疾病，就醫(yī)意愿及頻率更高有關(guān)；女性NTM病患者的檢出率明顯高于男性，與Cassidy等[19]的研究結(jié)果基本一致，可能與女性壽命更長(zhǎng)、身體免疫力較弱、就醫(yī)意愿更強(qiáng)等有關(guān)，提示應(yīng)重視我省復(fù)治、女性結(jié)核病患者NTM的鑒定，以避免誤診。

不同地區(qū)的NTM感染種群類(lèi)型存在地區(qū)差異。有研究顯示，廣東地區(qū)的NTM優(yōu)勢(shì)菌為龜膿腫分枝桿菌、鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群[20]，而上海地區(qū)優(yōu)勢(shì)流行菌種為龜分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和膿腫分枝桿菌[21]。本研究107株NTM分離株中，胞內(nèi)分枝桿菌占比最高，與Pang等[22]多中心研究基本一致，說(shuō)明胞內(nèi)分枝桿菌在我國(guó)可能是優(yōu)勢(shì)NTM菌株[23-26]；其次為膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌，草分枝桿菌和馬賽分枝桿菌各分離出1株，與上述研究的NTM分布有較大差距，說(shuō)明不同的NTM在不同的生長(zhǎng)環(huán)境下有其不同的生長(zhǎng)特性，本研究NTM分布及耐藥性結(jié)果可為本省NTM的流行趨勢(shì)提供參考。

既往研究證明，NTM對(duì)大多數(shù)的抗生素基本耐藥[27]，耐藥率較高。本研究根據(jù)CLSI M24-A第三版標(biāo)準(zhǔn)[28]，對(duì)獲得的107株NTM分離株采用液基微孔板法檢測(cè)了不同NTM對(duì)15種抗生素的耐藥性。結(jié)果顯示，胞內(nèi)和鳥(niǎo)分枝桿菌對(duì)于抗生素的耐藥率要高于膿腫分枝桿菌，其中胞內(nèi)分枝桿菌對(duì)米諾環(huán)素、磺胺甲唑、多西環(huán)素、頭孢西丁、阿奇霉素等抗生素的耐藥率均達(dá)到90%以上；膿腫分枝桿菌對(duì)乙胺丁醇、加替沙星、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、磺胺甲唑等抗生素的耐藥率也達(dá)到了80%以上；而不同分枝桿菌對(duì)亞胺培南/西司他丁的耐藥率均高達(dá)100.00%。另外，胞內(nèi)和鳥(niǎo)分枝桿菌對(duì)阿米卡星和克拉霉素的敏感性均較高，與曹楊榮[29]的研究認(rèn)為阿米卡星和克拉霉素的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NTM的治療效果較好的結(jié)論基本一致；提示對(duì)我省NTM感染患者在沒(méi)有藥敏試驗(yàn)結(jié)果而需要進(jìn)行臨床治療時(shí)，可優(yōu)先使用這些抗生素進(jìn)行治療。目前，關(guān)于NTM的藥敏試驗(yàn)研究主要集中于對(duì)抗結(jié)核藥品的耐藥性分析，而NTM對(duì)于抗結(jié)核藥品的耐藥率普遍較高[27,30]，研究意義不大。也說(shuō)明對(duì)NTM應(yīng)選擇合適的治療藥品進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)抗結(jié)核藥品的藥敏試驗(yàn)并不適用于NTM。

目前，基層實(shí)驗(yàn)室的NTM鑒定主要依靠傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和菌種鑒定技術(shù)，耗時(shí)較長(zhǎng)，且方法較為繁瑣，現(xiàn)有的一些分子生物學(xué)方法可以快速鑒別，但設(shè)備昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)室及檢驗(yàn)人員要求較高，在基層開(kāi)展較為困難。本研究結(jié)合傳統(tǒng)的病原學(xué)和免疫學(xué)方法(PNB和MPB64抗原聯(lián)合檢測(cè))，從2652株培養(yǎng)陽(yáng)性分枝桿菌菌株中初步篩選出122株NTM菌株，再經(jīng)16S rRNA和hsp65兩個(gè)引物進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，最終獲得107株NTM菌株，符合率為87.70%，與其他研究基本一致[31-32]。說(shuō)明在基層實(shí)驗(yàn)室，如果受條件限制，不能開(kāi)展分子生物學(xué)檢測(cè)，可以先開(kāi)展較為簡(jiǎn)便且易操作的病原學(xué)和免疫學(xué)方法檢測(cè)，如果初篩檢測(cè)出NTM感染，可以先考慮按照NTM標(biāo)準(zhǔn)診療方案進(jìn)行治療，再將標(biāo)本送至有檢測(cè)能力的實(shí)驗(yàn)室，根據(jù)分子生物學(xué)方法鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整治療方案，這樣可大大優(yōu)化診治流程，縮短診療時(shí)間，為患者的診斷和治療提供方便。此外，微孔板法藥敏試驗(yàn)是近年發(fā)展出來(lái)的檢測(cè)技術(shù)，需要加強(qiáng)質(zhì)量控制工作。本研究的藥敏試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中，參加了中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室的藥敏室間質(zhì)量控制項(xiàng)目，取得了優(yōu)秀成績(jī)；但此次質(zhì)量控制覆蓋的藥品種類(lèi)較少，主要是常見(jiàn)的抗結(jié)核藥品，對(duì)于NTM藥敏試驗(yàn)檢測(cè)的質(zhì)量控制較少，期望未來(lái)將NTM藥敏試驗(yàn)檢測(cè)室間質(zhì)量控制作為重點(diǎn)發(fā)展方向。

本研究是安徽省第一次進(jìn)行系統(tǒng)性的NTM監(jiān)測(cè)分析，由于條件限制，在患者納入、菌種鑒定方法的選擇上存在一定的局限，可能會(huì)導(dǎo)致NTM分離率存在一定的誤差。但筆者認(rèn)為研究結(jié)果仍可為安徽省NTM的病原譜和耐藥性提供初步的基線數(shù)據(jù)，為以后的持續(xù)性監(jiān)測(cè)提供參考。隨著各種檢測(cè)技術(shù)的不斷更新發(fā)展，鑒定出的NTM菌種也會(huì)不斷增多，可能會(huì)對(duì)NTM病的臨床診斷造成一定干擾。因此，提升實(shí)驗(yàn)室的鑒別診斷水平，監(jiān)測(cè)分析NTM的流行病學(xué)特征、菌種特性和耐藥性，以便為NTM病的早期診斷和治療提供依據(jù)。