線粒體功能障礙在脊髓損傷疾病進展中的作用及機制研究*

周慧宇，崔帆，雙衛(wèi)兵

（1.山西醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院 泌尿外科，山西 太原 030001）

脊髓損傷（spinal cord injury,SCI）是由于各種不同的致病因素引起的脊髓結構、功能損害，造成損傷水平以下運動、感覺及自主神經(jīng)功能的障礙。嚴重影響患者及其家庭乃至整個社會的和諧。SCI 在全球范圍內有著較高的發(fā)病率，一直是醫(yī)學領域的研究熱點［1-3］。按照時間進程，SCI 的病理生理過程可劃分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個階段：前者大多是不可逆的損傷；后者是在原發(fā)性損傷的基礎上繼發(fā)性出現(xiàn)的病理生理改變，主要由氧化應激和炎癥反應的級聯(lián)放大效應所致［4-5］，損害多數(shù)可逆［6-7］，繼發(fā)性損害階段是SCI治療的關鍵［8］。許多研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙在SCI 的疾病進展過程中發(fā)揮了重要作用［9-13］。本文對SCI 后傷段脊髓組織細胞線粒體功能障礙的各種病理機制進行總結，以期通過對這些機制深入探索，尋找新的治療SCI 藥理學靶點。

1 概述

線粒體是所有真核細胞制造能量的細胞器，是細胞進行有氧氧化的主要場所，線粒體的氧化磷酸化可以滿足細胞活動所需能量90%［14］。線粒體的氧化磷酸化過程主要通過內膜完整的呼吸電子傳遞鏈來完成［13-15］。在生理狀態(tài)下，葡萄糖、蛋白質和脂肪等營養(yǎng)物質在細胞內水解為丙酮酸和脂肪酸后進入線粒體，并生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體（FADH2）等具有還原性的高能分子，這些高能分子通過氧化呼吸鏈逐級傳遞，生成水和二氧化碳，并釋放能量。三磷酸腺苷（ATP）作為直接能源物質，為細胞各項生命活動的提供能量供應［16-17］。線粒體不僅是能量代謝工廠［18］，而且還參與多項細胞活動，如調節(jié)Ca2+濃度和誘導細胞凋亡等［19］。研究發(fā)現(xiàn)，SCI 后損傷段脊髓組織的細胞線粒體氧化磷酸化作用減弱，通過氧化釋放能量并生成ATP 的效率顯著降低［9-10］，而且損傷段脊髓細胞線粒體功能的恢復還具有一定的神經(jīng)保護作用［11］。

2 SCI 后線粒體形態(tài)學改變

脊髓損傷段的細胞線粒體形態(tài)的改變，使能量代謝的結構基礎遭到破壞，能量合成受限，從而加快脊髓的繼發(fā)性損傷。透射電鏡發(fā)現(xiàn)，在SCI早期傷段脊髓細胞的線粒體形態(tài)發(fā)生顯著變化［20］。其在4、8 h 可以觀察到線粒體體積明顯增大，嵴排列不整或發(fā)生腫脹。隨著時間的延長，在16 h甚至發(fā)現(xiàn)有部分線粒體膜產(chǎn)生破裂，出現(xiàn)空泡化。出現(xiàn)這種變化的原因是SCI 后促使Ca2+等進入線粒體，線粒體膜內外出現(xiàn)離子濃度差，在濃度梯度的作用下大量水分子進入線粒體內，造成腫脹。

3 SCI 后線粒體膜功能改變

線粒體的多種生理功能都依賴于膜的流動性。正常情況下，線粒體膜處于動態(tài)的平衡狀態(tài)。頸髓損傷后受損細胞的線粒體膜磷脂酶A2（phospholipase A2,PLA2）活性在早期顯著增高，傷后6 h 達到高峰，并且與代表線粒體膜流動性的η值升降幅度基本一致，提示線粒體膜流動性與PLA2活性具有相關性。這種情況可能是由于頸髓損傷早期PLA2活性增高，引起膜磷脂降解，從而導致線粒體膜流動性下降，這與早期的脂質過氧化反應密切相關［21］。受損細胞線粒體膜流動性的降低不僅會使Na+-K+-ATP 酶和細胞色素氧化酶的活性下降，還會損傷膜受體，使其不能發(fā)揮正常的生理功能，進而抑制了線粒體的能量代謝［22］。

SCI 后傷段脊髓細胞線粒體膜的改變主要體現(xiàn)在膜電位和膜流動性的下降。線粒體將所產(chǎn)生的部分能量以電化學勢能形式儲存于內膜，促使質子和其他離子在內膜兩側發(fā)生轉移，最終由于他們的不對稱分布而形成線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）。正常的MMP 對線粒體氧化磷酸化和ATP 的合成都至關重要，可以作為評價線粒體功能的重要指標［23-25］。MMP 下降不僅會使ATP 合成終止，還可以使胞質內的ATP 快速水解，從而加快ATP 的耗竭，能量供應嚴重不足［23］，加重脊髓細胞的損傷。

線粒體通透性轉變孔道（mitochondrial permeablity transition pore,mPTP）在調節(jié)線粒體能量代謝、細胞凋亡和細胞壞死方面發(fā)揮了重要作用。mPTP 在生理狀態(tài)下處于失活狀態(tài)，從而保證線粒體內膜的低通透性，維持MMP 和膜內外的離子梯度，這對線粒體的能量合成至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，SCI 后MMP 呈現(xiàn)下降趨勢，脊髓損傷段細胞的mPTP 轉變?yōu)殚_放狀態(tài)［16，20，26］，其進一步導致電子傳遞和氧化磷酸化發(fā)生障礙［20］，游離脂肪酸增加、氧化應激以及Ca2+超載等［16，26］，阻斷了ATP 的合成途徑［20］。SCI 造成MMP 下降mPTP 開放后，細胞質中H+等小分子物質會透過線粒體內膜進入基質，引起內膜電位崩潰，氧化磷酸化完全脫偶聯(lián)，ATP 合成終止；同時由于基質滲透壓升高，線粒體明顯腫脹，使外膜發(fā)生破裂，細胞色素c 以及其他凋亡誘導因子大量釋放，進而激活Caspase 通路誘導細胞凋亡［16，26］。因此mPTP 或許可以成為防治SCI 疾病進展的一個新靶點。

4 SCI 后線粒體中Ca2+紊亂

細胞的各項生理功能都需要電解質平衡來維持，其中Ca2+的穩(wěn)態(tài)尤為重要。SCI 后由于細胞膜損傷和Ca2+通道異常開放，細胞外大量Ca2+會發(fā)生內流；同時細胞內鈣庫的釋放也會進一步提高Ca2+水平，最終導致細胞內發(fā)生Ca2+超載。而胞內Ca2+超載會造成Ca2+沉積于線粒體內［27］。研究發(fā)現(xiàn)SCI 6 h，脊髓損傷段的細胞線粒體中游離的Ca2+水平較對照組明顯升高，隨著損傷后的時間推移，盡管Ca2+水平呈現(xiàn)出下降的趨勢，但是其線粒體內仍然維持著較高水平［9］?？梢娂毎麅群途€粒體內Ca2+超載是SCI 后線粒體功能障礙和結構受損的重要原因［28］。

線粒體膜損傷與細胞內和線粒體內高濃度Ca2+激活的磷脂酶有密切關系［27，29］。Ca2+超載對脊髓損傷段的細胞線粒體的破壞主要體現(xiàn)在以下幾個方面［27，29-30］：①引起鈣依賴性蛋白酶的活化，使核酸酶失去作用；②激活磷脂酶A 和磷脂酶C，催化膜磷脂水解，使細胞膜和線粒體膜結構遭到破壞，引起膜流動性降低、通透性增加；③誘導mPTP 開放，使線粒體發(fā)生腫脹、MMP 降低；④線粒體內發(fā)生Ca2+超載后會影響氧化磷酸化過程，使呼吸鏈電子傳遞發(fā)生障礙。以上這些變化均可導致線粒體能量代謝障礙，使ATP 合成減少，加重脊髓細胞的損傷。Ca2+、自由基和能量代謝可以相互影響，其中任何一方的異常都會誘發(fā)或加重另外兩方的損傷［31］。

5 SCI 后線粒體中氧自由基損傷

氧自由基主要包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫及一氧化氮等。在生理條件下，氧自由基的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡，維持著神經(jīng)細胞的正常功能［32］。然而有研究發(fā)現(xiàn)，在SCI 的4 h后，傷段脊髓細胞內氧自由基水平較對照組明顯升高［33］。SCI 后氧自由基主要通過三個途徑大量生成：由于局部組織缺血缺氧，傷段脊髓細胞的線粒體呼吸鏈電子傳遞發(fā)生障礙，NADH 無法進行氧化反應，造成大量堆積，過多的NADH 使膜脂質中的氧分子單價還原，產(chǎn)生氧自由基［21］；SCI后發(fā)生炎癥應答，引起中性粒細胞活化，通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生了大量氧自由基［30］；同時補體活化和Ca2+超載也會引起氧自由基的增加［34］。氧自由基的大量生成，以及抗氧化防御系統(tǒng)的損傷，極易導致氧化應激的發(fā)生［35］。氧化應激是SCI 發(fā)病機制中的主要假說之一［36］，其不僅能使線粒體呼吸酶的活性降低，減慢呼吸鏈的電子傳遞，增加氧自由基生成，形成惡性循壞；其還可以通過增強解偶聯(lián)蛋白的表達，產(chǎn)生質子漏，從而降低MMP，氧化磷酸化發(fā)生解偶聯(lián)，最終使ATP 合成減少［16］。除此之外，氧自由基還可以通過脂質過氧化破壞脂質雙分子層的完整性，使傷段脊髓細胞線粒體膜的流動性降低，通透性增加以及Na+-K+-ATP酶活性下降，進而引起受損細胞的能量代謝障礙［37-38］。目前臨床使用的甲基強的松龍可通過阻斷PGF-2α 途徑，降低受損細胞的ROS 水平，減輕脂質過氧化反應，從而達到治療SCI 的效果［10，39］，這也進一步驗證了氧自由基對線粒體的損傷作用。

6 SCI 后線粒體中相關酶活性降低

線粒體正常的能量代謝需要多種酶的共同參與，這些酶活性的變化直接影響著能量代謝。Na+-K+-ATP 酶主要在ATP 的作用下通過轉運Na+、K+，維持細胞膜內外正常的滲透壓差，防止細胞水腫。SCI 后脊髓損傷段的細胞內Na+-K+-ATP 酶活性明顯降低。研究發(fā)現(xiàn)，依達拉奉可增強Na+-K+-ATP酶活性，減輕細胞水腫，進而改善受損細胞的能量代謝，減輕繼發(fā)性SCI 的疾病進展［40］。已糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是糖酵解過程中的3 個限速酶，乳酸脫氫酶可催化丙酮酸轉變?yōu)槿樗?。研究顯示，頸髓損傷后受損的脊髓組織細胞中這四種酶的活性均明顯增高，表明有氧氧化和氧化磷酸化受到抑制，無氧酵解增強，細胞產(chǎn)能顯著減少，由于無氧酵解在代謝過程發(fā)揮主導作用，故而大量乳酸在體內發(fā)生堆積，進而引起代謝性酸中毒，使細胞和組織再次受到損傷；此外，乳酸還可以抑制糖酵解，使能量產(chǎn)生進一步減少［41］。細胞色素C 氧化酶（COX）是呼吸電子傳遞鏈末端的酶，在細胞有氧氧化和氧化磷酸化偶聯(lián)中發(fā)揮著重要的作用［42］，其活性的改變在一定程度上可以反映脊髓細胞的能量代謝情況［13，43］。超氧化物歧化酶（SOD）是位于線粒體內膜的一種抗氧化金屬酶，能有效抑制氧化應激的發(fā)生［44］。研究發(fā)現(xiàn)，SCI 后傷段脊髓細胞中COX 和SOD 的活性均顯著下降，提示能量代謝受阻［13］。白藜蘆醇能夠通過提高SCI 后傷段脊髓細胞中COX 和SOD 活性的表達，減輕氧化應激反應，改善能量代謝，且白藜蘆醇具有安全有效、毒副作用小等優(yōu)點，有望成為臨床防治SCI 后的損傷進展的重要手段［13，45］。此外脊髓受損細胞中的檸檬酸合酶和ATP 合成酶的活性也在損傷后發(fā)生數(shù)量和功能降低，從而減少了ATP 的生成［46］。

7 SCI 后線粒體中線粒體DNA 突變

線粒體DNA（mitochondrial DNA,mt DNA）位于線粒體內膜基質側，鄰近氧自由基產(chǎn)生部位，而且缺乏保護蛋白和DNA 修復機制，因此在線粒體呼吸過程中產(chǎn)生的氧自由基易引起mt DNA 的氧化損傷，發(fā)生突變［47-49］。SCI 后由于傷段脊髓細胞中氧自由基大量堆積［33］，以及抗氧化防御系統(tǒng)嚴重損傷，mt DNA 發(fā)生突變的概率會大大增加。傷段脊髓細胞的mt DNA 突變后易損害基因組內重要的功能區(qū)，如氧化磷酸化酶基因密碼區(qū)等，造成經(jīng)轉錄和翻譯形成的線粒體氧化磷酸化相關酶的功能受損，從而影響能量代謝。ATP 的生成減少，嚴重者可以導致細胞損傷及組織壞死［47，50］。而且mt DNA 突變可導致呼吸鏈功能障礙，會進一步增加氧自由基的產(chǎn)生，形成惡性循壞［47］。

8 SCI 后線粒體動力學改變

線粒體動力學是指線粒體不斷進行移動、融合與分裂的過程［51］，與MMP 有密切關系［52］。線粒體動力學對細胞的能量合成有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在SCI 3 h 后，傷段脊髓細胞的線粒體數(shù)目有所減少，而線粒體的截面積明顯增大，ATP含量稍下降［53］；在12 h 后線粒體數(shù)目增多，線粒體的截面積變小，而ATP 含量明顯下降，提示SCI 后脊髓損傷段的細胞線粒體出現(xiàn)了動力學改變，早期以融合為主，晚期以分裂為主［6，53］。SCI后早期線粒體的融合可以看作是一種代償，能在一定程度上保證線粒體形態(tài)和功能的完整性，從而滿足應急狀態(tài)下細胞對ATP 的需求。因此，早期ATP 含量無明顯變化，但隨著線粒體損傷的加重，線粒體分裂增加，使線粒體處于失代償階段，從而ATP 含量發(fā)生明顯下降。選擇性線粒體分裂抑制劑-1 能有效抑制大鼠急性SCI 后脊髓損傷段細胞的線粒體分裂、改善MMP，從而使線粒體的能量代謝障礙得以有效控制［53］。

9 線粒體相關性細胞凋亡

脊髓損傷段的細胞線粒體發(fā)生能量代謝障礙后，可以通過一系列信號傳導通路誘導細胞凋亡，其中最典型的是一磷酸腺苷（AMP）依賴的蛋白激酶（AMPK）信號通路。SCI 后脊髓損傷段的組織細胞能量合成受阻，ATP 生成減少，AMP、二磷酸腺苷（ADP）相對增多，而AMP/ATP 或ADP/ATP 比值的增高可激活AMPK。一方面，活化的AMPK 可以促進ATP 的生成；另一方面，AMPK也能激活其下游的p53 蛋白，誘導細胞表達Bax和Bak，進而使線粒體釋放細胞色素c［54］。此外氧自由基引起的線粒體內膜的心磷脂過氧化，以及mPTP 的開放狀態(tài)也可導致線粒體通透性增加，從而加速細胞色素c 進入到細胞質內［55］，最終細胞色素c 與凋亡蛋白活化因子結合，激活caspase，啟動細胞凋亡程序［56］，進而加速SCI 的進展。

10 總結與展望

SCI 早期由于局部組織缺血缺氧，損傷節(jié)段的脊髓細胞的線粒體在形態(tài)和功能上會發(fā)生一系列病理生理改變，引起能量代謝障礙，最終導致繼發(fā)性SCI 的范圍擴大、程度加重。值得注意的是，造成傷段脊髓細胞線粒體功能障礙的眾多因素或環(huán)節(jié)是相互作用，互為因果。目前臨床尚無安全有效的方法幫助患者實現(xiàn)神經(jīng)功能完全恢復［57］。甲基強的松龍是最早被批準用于SCI 治療的藥物，但是不良反應多，患者難以長久使用［58-59］。目前在亞細胞水平上的藥物研發(fā)和機制研究已成為熱門課題之一，線粒體在疾病中的作用也逐漸受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙與神經(jīng)退行性疾病、腫瘤及脂肪肝等多種疾病發(fā)病相關［16］。目前針對SCI 后傷段脊髓細胞的線粒體功能改變已經(jīng)開展了許多研究，但由于其機制復雜，不同環(huán)節(jié)間還存在著相互交叉，因此要達到保護脊髓功能的目的就需要從多個靶點和環(huán)節(jié)來防止線粒體功能障礙的發(fā)生。隨著基因組學和蛋白組學研究的不斷深入，SCI 后線粒體功能的致病機制將會被進一步闡明，因此通過改善傷段脊髓細胞的線粒體功能變化途徑來治療SCI 有著巨大的研究前景。