靶向膠質(zhì)瘤干細胞及其微環(huán)境的免疫治療進展

王海洋 董軍

高級別膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有廣泛性浸潤生長、強大的新生血管形成能力和對現(xiàn)有治療方法高耐受等生物學特點，患者生存期短、預后不良［1?2］。目前，針對膠質(zhì)瘤的規(guī)范化治療方案（手術(shù)最大限度安全切除腫瘤輔以術(shù)后同步放化療或輔助化療），以及在體部惡性腫瘤治療中已取得顯著療效的的分子靶向治療、免疫治療、腫瘤治療電場（TTF）等方法僅能在有限程度上緩解病情，對總生存率并無明顯改善。對于高度異質(zhì)性膠質(zhì)瘤，針對何種治療靶點才能真正提高療效，是當前臨床治療所關(guān)注的焦點問題。近年對膠質(zhì)瘤起源的研究顯示，膠質(zhì)瘤干細胞（GSCs）在膠質(zhì)瘤發(fā)生、惡性進展、治療抵抗和復發(fā)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3?4］，但此類細胞是起源于室管膜下區(qū)惡性轉(zhuǎn)化的神經(jīng)干細胞（NSCs）還是由腦膠質(zhì)瘤細胞分化而來，尚無定論。在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中，膠質(zhì)瘤干細胞不僅可使微環(huán)境中相關(guān)細胞發(fā)生有利于其組織重構(gòu)的重編程，而且具有高度抑制免疫細胞的抗腫瘤活性作用。近年來，腫瘤免疫治療方法和臨床療效已取得巨大進步［5］，但有關(guān)靶向膠質(zhì)瘤干細胞免疫治療的研究鮮有文獻報道。膠質(zhì)瘤干細胞不僅可以作為靶向治療的理想靶點，而且有望成為免疫治療的首選靶點，有可能從根本上改善膠質(zhì)瘤的治療前景。

一、膠質(zhì)瘤干細胞概述

早在20世紀70年代，Hamburger等學者即已提出導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)的腫瘤干細胞理論，迄今已獲得大量研究證據(jù)的支持［6］。腫瘤干細胞占腫瘤細胞的比例較小，具有自我更新、多系分化潛能和耐受常規(guī)治療的生物學特性。膠質(zhì)瘤干細胞是膠質(zhì)瘤中具有腫瘤起始作用的細胞［3，7］，存在異質(zhì)性，即使起源于同一腫瘤，其生物學特性亦不完全相同［8?9］。膠質(zhì)瘤干細胞具有誘導腫瘤血管生成、促進腫瘤侵襲播散和對放化療高度耐受等特性，并可在常規(guī)治療壓力下迅速重建腫瘤，導致膠質(zhì)瘤快速復發(fā)［10］。越來越多的研究聚焦于與上述生物學特征相關(guān)的重要分子調(diào)控通路，以期獲取高效、可靠的治療靶點。

膠質(zhì)瘤干細胞表面可表達不同的蛋白質(zhì)，與維持其自身穩(wěn)態(tài)息息相關(guān)，這些細胞表面蛋白質(zhì)是篩選和靶向膠質(zhì)瘤干細胞的理想標志物，其中以CD133最為經(jīng)典。體外實驗顯示，膠質(zhì)瘤細胞中的CD133+細胞亞群具有較強的自我更新和增殖能力，且可在腦組織內(nèi)啟動腫瘤細胞之生物學活性［3］。與此同時，CD15、CD36、CD44、SOX2、巢蛋白（Nes）和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子G2（ABCG2）等亞群也為較受關(guān)注的膠質(zhì)瘤干細胞標志物，早期研究多通過制備針對上述標志物的特異性單克隆抗體靶向膠質(zhì)瘤干細胞。然而，正常神經(jīng)干細胞也可表達上述標志物，而且某些膠質(zhì)瘤細胞亞群存在類膠質(zhì)瘤干細胞樣生物學行為，但并不表達膠質(zhì)瘤干細胞標志物，例如，CD133-膠質(zhì)瘤細胞也可表現(xiàn)出較強的組織重構(gòu)等膠質(zhì)瘤干細胞表型［11?12］。有多條關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導通路與膠質(zhì)瘤干細胞生物學特性相關(guān)，其中研究最多的通路是 Notch、Sonic Hedgehog、Wnt/β?連環(huán)蛋白（β?catenin）、磷脂酰肌醇3?激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）、信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）通路。然而，通過上述信號轉(zhuǎn)導通路靶向膠質(zhì)瘤干細胞仍面臨較大困難，這是由于上述通路并非膠質(zhì)瘤干細胞所特有，亦同時存在于正常神經(jīng)干細胞和部分腫瘤細胞中。體外研究顯示，膠質(zhì)瘤細胞過表達POU3F2、SOX2、OLIG2、SALL2基因，可使膠質(zhì)瘤細胞去分化為膠質(zhì)瘤干細胞樣細胞［13］，提示關(guān)鍵促瘤基因可決定膠質(zhì)瘤干細胞分化與否，并進一步調(diào)控膠質(zhì)瘤之進展。胚胎發(fā)育中的功能轉(zhuǎn)錄因子，如雙螺旋絲蛋白20（PHF20）、SOX2、SOX9和鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶4（OCT4）等兼具促腫瘤效應，其中PHF20被鑒定為膠質(zhì)瘤特異性抗原，但臨床研究顯示，接受抗PHF20抗體治療的膠質(zhì)瘤患者并未獲得優(yōu)于對照組的療效［14］。PHF20高表達于神經(jīng)源性腫瘤，通過顯著上調(diào)SOX2和OCT4表達水平以增強神經(jīng)母細胞瘤自我更新和腫瘤啟動能力，在腫瘤發(fā)生中具有重要作用［15］；SOX2和SOX9則高表達于膠質(zhì)瘤干細胞，發(fā)揮維持膠質(zhì)瘤干細胞功能穩(wěn)態(tài)的重要作用［16?17］；SOX2、SOX9 和 OCT4 表達缺失可抑制膠質(zhì)瘤干細胞活性并延緩腫瘤啟動［18?19］。上述研究均提示，PHF20?SOX2?SOX9?OCT4 軸對維持膠質(zhì)瘤干細胞生物學表型具有重要作用，探究上述特定腫瘤干細胞相關(guān)基因之間的相互作用，有助于明確膠質(zhì)瘤起源，從而為靶向膠質(zhì)瘤干細胞的免疫治療提供新的靶點。

二、靶向膠質(zhì)瘤干細胞的免疫治療

目前一直在探尋療效確切的膠質(zhì)瘤免疫治療方案，主要包括被動免疫治療、過繼免疫治療和主動免疫治療。被動免疫治療是利用抗體或毒素等免疫效應分子，在不直接激活免疫系統(tǒng)的情況下靶向殺傷腫瘤細胞；過繼免疫治療是通過過繼性T細胞轉(zhuǎn)移和應用嵌合抗原受體T細胞（CAR?T），在體外以腫瘤抗原激活T細胞，然后再將這種可特異性識別腫瘤的活化T細胞輸入患者體內(nèi)，達到免疫治療目的。主動免疫治療通常稱為疫苗接種，通過各種來源的腫瘤相關(guān)抗原（TAA），如腫瘤裂解物、腫瘤細胞、mRNA或多肽，直接激活患者免疫系統(tǒng)，實現(xiàn)抗腫瘤之目的。

1.靶向膠質(zhì)瘤干細胞的單克隆抗體 由單克隆抗體介導的靶向腫瘤抗原的免疫治療已逾30年，由于單克隆抗體的直接細胞殺傷和免疫調(diào)節(jié)作用而在腫瘤免疫治療中曾占據(jù)重要地位［20］，隨著各種膠質(zhì)瘤干細胞標志物陸續(xù)得到鑒定，各類人源化小分子多功能單克隆抗體被寄予厚望。表皮生長因子受體（EGFR）基因擴增和突變是膠質(zhì)瘤干細胞的重要遺傳學特征［21］，直接靶向EGFR的單克隆抗體已用于膠質(zhì)瘤的治療，其中研究最多、應用最廣泛的是西妥昔單抗，通過干擾配體結(jié)合和EGFR細胞外二聚體形成，阻斷EGFR介導的信號轉(zhuǎn)導通路而發(fā)揮功能［22］。轉(zhuǎn)化生長因子?β（TGF?β）信號轉(zhuǎn)導通路參與膠質(zhì)瘤發(fā)生和惡性進展的多個環(huán)節(jié)，惡性膠質(zhì)瘤患者血清TGF?β表達變化與腫瘤分級和預后呈正相關(guān)［23］，TGF?β信號轉(zhuǎn)導通路主要通過調(diào)控干細胞相關(guān)基因如SOX4、SOX2、LIF，實現(xiàn)膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新并抑制其分化［23?24］。臨床研究顯示，靶向TGF?β的免疫治療無明顯不良反應，復發(fā)膠質(zhì)瘤患者的腫瘤細胞可被抗TGF?β抗體GC1008靶向結(jié)合，并在治療早期即顯示出良好的腫瘤抑制作用，但并不能阻止治療后期臨床和影像學出現(xiàn)的腫瘤進展，故而未能實現(xiàn)長期臨床獲益［25］。貝伐單抗是另一用于治療膠質(zhì)瘤的單克隆抗體，是美國食品與藥品管理局（FDA）批準用于治療高級別膠質(zhì)瘤的人源血管內(nèi)皮生成因子（VEGF）單克隆抗體，具有顯著的抗腫瘤血管生成作用，且可干擾膠質(zhì)瘤干細胞小生境中的血管狀態(tài)，導致膠質(zhì)瘤干細胞易受其他治療方法的損傷［26?27］，但在多項臨床試驗中并未觀察到明顯的生存獲益，僅可在一定時間內(nèi)控制瘤周水腫以改善臨床癥狀，以及在放射治療所致假性進展方面有確切療效［28］。

2.靶向膠質(zhì)瘤干細胞的溶瘤病毒 溶瘤病毒（OVs）是經(jīng)過設計的具有選擇性在腫瘤細胞中繁殖并殺傷腫瘤細胞的治療藥物。其重要設計原則是減弱或刪除病毒毒力因子，使溶瘤病毒無法在正常組織中復制，但仍保留在腫瘤細胞內(nèi)復制并殺傷腫瘤細胞的能力［29］。目前已證實腫瘤特異性基因，如RAS、TP53、RB1、同源性磷酸酶?張力蛋白（PTEN）和Wnt信號轉(zhuǎn)導通路中的編碼基因及其他腫瘤相關(guān)基因，可增加腫瘤細胞對病毒的易感性［30］，這是由于促腫瘤與抗病毒的信號轉(zhuǎn)導通路之間形成干擾，從而為病毒復制提供適宜的環(huán)境。此外，哺乳動物細胞抗病毒過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是由干擾素（IFN）介導的，而腫瘤細胞中IFN信號轉(zhuǎn)導通路缺陷，不具有較強的抗病毒能力［31］。腫瘤干細胞同樣具有腫瘤特異性基因突變和IFN信號轉(zhuǎn)導通路缺陷的特點，故溶瘤病毒可以有效殺傷腫瘤干細胞，該療法已在荷瘤小鼠體內(nèi)顯示出一定的抗腫瘤療效［32］。動物實驗顯示，攜帶白細胞介素?12（IL?12）的溶瘤性單純皰疹病毒（HSV）可使荷瘤小鼠腦腫瘤消退［33］。溶瘤病毒治療膠質(zhì)瘤進展較快，由于膠質(zhì)瘤干細胞高度富集整合素如αvβ3或αvβ5，通過基因工程技術(shù)設計的溶瘤病毒可以通過這些整合素進入膠質(zhì)瘤干細胞而發(fā)揮抗腫瘤作用，其中DNX?2401是一種具有腫瘤特異性和強感染能力的溶瘤病毒，已用于Ⅰ期臨床試驗且安全性良好、腫瘤體積明顯縮小、患者生存期延長［34?35］。除直接的溶瘤作用外，趨化性增強的免疫細胞和細胞毒性T細胞也參與抗腫瘤過程，從而產(chǎn)生明顯的臨床療效［35］。除腦膠質(zhì)瘤外，溶瘤病毒對多種體部惡性腫瘤的腫瘤干細胞亦具有殺傷效應。在乳腺癌模型中，溶瘤病毒GLV?1h68可在腫瘤干細胞內(nèi)選擇性復制并殺傷高表達乙醛脫氫酶 1（ALDH1）的腫瘤干細胞［36］；在卵巢癌模型中，拮抗趨化因子受體4（CXCR4）的溶瘤病毒對CD44+CD117+腫瘤干細胞具有明顯殺傷作用［37］；在結(jié)腸癌模型中，靶向腫瘤干細胞標志物CD133的溶瘤腺病毒可以選擇性感染CD133+腫瘤干細胞［38］，溶瘤病毒與氟尿嘧啶（5?FU）聯(lián)合應用對CD133+和CD44+腫瘤干細胞具有明顯治療效果［39］；在肝癌模型中，溶瘤性麻疹病毒可靶向并裂解CD133+腫瘤干細胞［40］。此外，溶瘤病毒還具有調(diào)節(jié)荷瘤宿主機體免疫力的作用，使免疫系統(tǒng)可以更好地適應病毒抗腫瘤活性［41］。

3.靶向膠質(zhì)瘤干細胞的嵌合抗原受體T細胞過繼性T細胞治療（ACT）是一種個性化治療，這種免疫細胞具有直接抗腫瘤活性。過繼性T細胞治療需首先從患者體內(nèi)分離出浸潤腫瘤的T細胞，在IL?2的刺激下，經(jīng)體外培養(yǎng)使其具備特異性識別腫瘤的能力，然后再將其回輸至患者體內(nèi)［42］。與通過腫瘤相關(guān)抗原刺激固有免疫系統(tǒng)的主動免疫不同，過繼轉(zhuǎn)移的CAR?T細胞可以直接靶向腫瘤相關(guān)抗原而不依賴抗原提呈過程。嵌合抗原受體（CAR）可以靶向腫瘤表面抗原并激活T細胞，從而達到抗腫瘤作用［43］。相對于體內(nèi)固有的數(shù)目少且功能低下的腫瘤特異性T細胞，CAR?T細胞可以在體外擴增至較高水平，從而誘導較強的細胞毒性免疫反應。CAR?T細胞目前已成功用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，由于實體腫瘤表面缺乏特異性抗原，該療法在實體腫瘤中的應用尚待深入探索［44］。晚近靶向腫瘤干細胞的CAR?T細胞療法，已在各種類型腫瘤模型中進行觀察研究，以評價其抗腫瘤活性：在前列腺癌模型中，針對EpCAM抗原的CAR?T細胞可以根除PC3M和PC3腫瘤模型中的腫瘤干細胞［45］；膜嵌合IL?15構(gòu)建的CAR?T細胞在CD19+白血病中可誘導生成靶向腫瘤干細胞的記憶性T細胞［46］；在結(jié)腸癌模型中，過繼轉(zhuǎn)移的CD8+細胞毒性T細胞可特異性識別腫瘤干細胞抗原ASB4，進而選擇性消滅腫瘤干細胞［47］。但是考慮到CAR?T細胞療法對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應，如認知功能障礙、腦積水等，其治療膠質(zhì)瘤的報道尚不多見［48?49］。膠質(zhì)母細胞瘤和膠質(zhì)瘤干細胞中最常見的EGFR基因特異性突變——表皮生長因子受體變異體Ⅲ（EGFRvⅢ）目前已成為CAR?T細胞療法的重要靶點。靶向EGFRvⅢ的CAR?T細胞療法在荷瘤小鼠模型以及Ⅰ期臨床試驗（試驗編號：NCT02209376）中可清除表達EGFRvⅢ的腫瘤細胞［50］，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)導，可使CAR?T細胞表達特異性IL?13Rα2或人表皮生長因子受體2（HER2），進而靶向殺傷膠質(zhì)瘤干細胞；由于CD133+膠質(zhì)瘤干細胞高表達IL?13Rα2和HER2，故可被 CAR?T 細胞識別并殺傷［51?52］。上述研究表明，膠質(zhì)瘤干細胞可能成為CAR?T細胞療法的潛在靶點。

4.靶向膠質(zhì)瘤干細胞的腫瘤疫苗 腫瘤疫苗可以激活宿主免疫系統(tǒng)，識別并殺傷腫瘤細胞，屬主動免疫治療。激活免疫系統(tǒng)的最佳途徑是刺激多功能抗原呈遞細胞（APC），如樹突狀細胞（DC）、巨噬細胞、B淋巴細胞（以下簡稱B細胞），其中以樹突狀細胞為最佳選擇。樹突狀細胞自外周血單個核細胞（PBMC）中分離純化，先由IL?4和粒細胞?巨噬細胞集落刺激因子（GM?CSF）刺激生成未成熟的樹突狀細胞，再以 IL?1b、IL?6、前列腺素 E2（PGE2）和腫瘤壞死因子?α（TNF?α）混合物成分刺激，獲得成熟的樹突狀細胞［53］。樹突狀細胞疫苗治療腫瘤的主要目的是產(chǎn)生特異性輔助性T細胞（Th），從而激活細胞毒性T細胞的抗腫瘤作用［54］。腫瘤細胞中可被樹突狀細胞識別的各種成分稱為腫瘤相關(guān)抗原，激活的樹突狀細胞回輸至患者體內(nèi)后，通過向腫瘤特異性T細胞提呈腫瘤相關(guān)抗原以增強抗腫瘤免疫反應［55］。惡性實體腫瘤動物模型的觀察結(jié)果業(yè)已顯示，靶向腫瘤干細胞相關(guān)抗原的樹突狀細胞疫苗具有明確的療效：在惡性黑色素瘤模型中，由腫瘤干細胞裂解物致敏的樹突狀細胞可使荷瘤小鼠分泌更多的INF?γ和IL?4，抑制腫瘤生長并延長小鼠存活期［56］；在卵巢癌模型中，包含NANOG肽的樹突狀細胞可以識別腫瘤干細胞并誘導高度特異性抗腫瘤T細胞免疫反應［57］；有研究顯示，樹突狀細胞可通過共同提呈腫瘤特異性抗原和Toll樣受體（TLR）激活宿主對黑色素瘤的免疫反應［58］，腫瘤細胞崩解后部分成分又可增強樹突狀細胞對主動免疫的刺激；臨床研究顯示，膠質(zhì)瘤患者術(shù)后接受樹突狀細胞疫苗治療安全、有效［59］。由此可見，腫瘤疫苗通過將腫瘤相關(guān)抗原更多地暴露給免疫細胞，激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生抗腫瘤作用，因此，能否制備出有效識別腫瘤干細胞并激活免疫反應的樹突狀細胞疫苗是提高免疫治療效果的關(guān)鍵。Jachetti等［60］的研究顯示，與經(jīng)分化腫瘤細胞致敏的樹突狀細胞相比，以耐受放射治療的腫瘤干細胞致敏的樹突狀細胞可促使機體產(chǎn)生更強的T細胞毒性并分泌更多的 IFN?γ。Dashti等［56］分別通過小鼠黑色素瘤細胞系B16F10和腫瘤干細胞裂解物致敏樹突狀細胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)后者致敏的樹突狀細胞可明顯延長荷瘤小鼠存活期。Ning等［61］發(fā)現(xiàn)，通過腫瘤干細胞裂解物致敏的樹突狀細胞可使接受免疫治療的荷瘤小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG，從而在補體存在的情況下增強其細胞毒性；此外，在黑色素瘤和鱗狀細胞癌模型中，通過腫瘤干細胞致敏的樹突狀細胞可以使荷瘤小鼠體內(nèi)產(chǎn)生更強的細胞毒性作用。膠質(zhì)瘤干細胞具有相同的樹突狀細胞致敏能力，因此直接靶向這一腫瘤細胞亞群，進而建立針對膠質(zhì)瘤的腫瘤疫苗有望成為有效的治療方案［62］。臨床試驗顯示，膠質(zhì)母細胞瘤患者通過移植轉(zhuǎn)染自體膠質(zhì)瘤干細胞mRNA的樹突狀細胞，激發(fā)適應性免疫反應，使腫瘤消 退 ，延 長 總 生 存 期（OS）［63］。 Finocchiaro 和Pellegatta［62］經(jīng)對一系列臨床前研究結(jié)果的總結(jié)，得出以富含膠質(zhì)瘤干細胞的細胞群致敏樹突狀細胞可以增強膠質(zhì)瘤免疫治療效果的結(jié)論，進而提出膠質(zhì)瘤干細胞高表達的FABP7、GLAST、CD133、SOX2等是腫瘤疫苗免疫治療的良好靶點，有利于提高膠質(zhì)瘤患者整體生存率。制備膠質(zhì)瘤干細胞腫瘤疫苗，需先將手術(shù)切除的腫瘤標本制備為單細胞懸液，然后在干細胞培養(yǎng)條件下分離單個膠質(zhì)瘤干細胞并增殖為干細胞球，再提取膠質(zhì)瘤干細胞mRNA并轉(zhuǎn)染至單個核細胞來源的樹突狀細胞。ICT?107疫苗是由6種合成多肽致敏自體外周血單個核細胞分化的樹突狀細胞，可靶向膠質(zhì)瘤干細胞相關(guān)抗原，例如 HER2、黑色素瘤缺乏因子 2（AIM2）、gp100、IL?13Rα2、酪氨酸相關(guān)蛋白?2（TRP?2）、黑色素瘤抗原基因?1（MAGE1）等。Phuphanich 等［64］在針對新發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤的標準治療方案中增加了ICT?107疫苗治療，結(jié)果顯示，患者中位無進展生存期（PFS）為16.9個月、中位總生存期為38.4個月，部分患者接種該疫苗后經(jīng)歷再次手術(shù)切除，切除標本中膠質(zhì)瘤干細胞數(shù)目明顯減少，提示該疫苗可以誘導機體抗腫瘤免疫靶向殺傷膠質(zhì)瘤干細胞。Wen等［65］的Ⅱ期臨床試驗是首個針對膠質(zhì)瘤干細胞并獲得陽性結(jié)果的免疫治療的隨機對照試驗，觀察新發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者手術(shù)和放化療后加用樹突狀細胞疫苗對患者無進展生存期或總生存期的影響，其結(jié)果顯示，ICT?107組患者中位無進展生存期延長2個月且差異具有統(tǒng)計學意義，總生存期也有所延長但未達到統(tǒng)計學意義。Vik?Mo等［63］研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤患者接受規(guī)范化綜合治療后于皮下注射膠質(zhì)瘤干細胞疫苗，可成功誘導出增強的抗腫瘤免疫反應（7/10例）；接種疫苗的患者無進展生存期較對照者延長2.9倍且無嚴重不良反應。在生理狀態(tài)下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在主動免疫治療過程中激活的樹突狀細胞較少，需補充造血干/祖細胞以提供樹突狀細胞并持續(xù)誘導有效的T細胞反應，造血干/祖細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后分化為CD86+CD11c+MHCⅡ+細胞，呈現(xiàn)出活化樹突狀細胞表型和功能，從而激發(fā)細胞毒性免疫反應。造血干/祖細胞來源的細胞因高表達CD86等共刺激分子而表現(xiàn)出較強的抗腫瘤免疫作用［66］。近年來，SOX2作為一種維持膠質(zhì)瘤干細胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，被認為是主動免疫治療的新靶點，SOX2肽疫苗可以顯著增強全身和局部免疫反應，并在腫瘤模型中延長荷瘤動物存活期，無論是否聯(lián)合化療均可觀察到確切的療效［67］。因此，靶向SOX2等膠質(zhì)瘤干細胞相關(guān)基因的疫苗可以為主動免疫治療提供新的方案。

5.針對膠質(zhì)瘤干細胞的自然殺傷細胞 以自然殺傷（NK）細胞為基礎的過繼免疫治療無論對血液系統(tǒng)腫瘤還是實體腫瘤均是一種有前景的免疫治療策略［68］。NK細胞抗腫瘤的基礎依賴NK細胞及其活化性受體［如NK細胞活化性受體NKG2D、DNAX輔助分子1（DNAM?1）等］對腫瘤細胞表達的對應配體［如主要組織相容性復合物Ⅰ類鏈相關(guān)分子A和B（MICA和MICB）、人類巨細胞病毒糖蛋白UL?16結(jié)合蛋白（ULBP）、脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（PVR）、黏連蛋白2等］的識別，識別并激活后的NK細胞產(chǎn)生細胞毒性，進而殺傷腫瘤細胞。正常細胞可表達較高水平的被NK細胞抑制性受體識別的主要組織相容性復合物Ⅰ（MHCⅠ）類分子，從而免受NK細胞的攻擊［69］。體外研究顯示，膠質(zhì)瘤干細胞可表達高水平的PVR和黏連蛋白2，NK細胞活化性受體DNAM?1可以特異性識別上述兩種配體，進而殺傷膠質(zhì)瘤干細胞［70］。大多數(shù)惡性腫瘤的腫瘤干細胞MHCⅠ類分子表達水平較低，刺激NK細胞抑制性受體的作用較弱，從另一方面活化NK細胞多條信號轉(zhuǎn)導通路參與腫瘤干細胞中NK細胞配體的調(diào)節(jié)［71?72］，其中 MICA、MICB 和 ULBP 在腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中上調(diào)，RAS/PI3K信號轉(zhuǎn)導通路激活可促進NKG2D對應的配體在膠質(zhì)瘤干細胞中的表達［73］。NK細胞可對病毒感染和腫瘤形成產(chǎn)生快速反應，在活化性受體陽性且抑制性受體陰性的情況下，NK細胞可直接裂解MHCⅠ缺失的腫瘤細胞或其他病原體［74］。有多項研究支持腫瘤干細胞是NK細胞免疫殺傷作用的易感靶點：Tseng等［75］的研究顯示，與分化腫瘤細胞相比，NK細胞與口腔鱗癌干細胞、人胚胎干細胞、間充質(zhì)干細胞、牙髓干細胞和人誘導型多能干細胞（iPSCs）進行共同孵育時，NK 細胞毒性增強，IFN?γ分泌增加；Castriconi等［70］發(fā)現(xiàn)，源于膠質(zhì)母細胞瘤的膠質(zhì)瘤干細胞對經(jīng)IL?2或IL?15激活的NK細胞介導的裂解物高度敏感；新鮮純化的同種異體NK細胞可識別并殺傷結(jié)直腸癌來源的腫瘤干細胞，而分化的腫瘤細胞對NK細胞的敏感性較低，這種NK細胞對腫瘤干細胞和普通腫瘤細胞易感性的差異與腫瘤干細胞表面活化性受體對應配體的表達水平相關(guān)，腫瘤干細胞中特異性結(jié)合激活性受體NKp30和NKp44的配體表達水平明顯高于非腫瘤干細胞［76］。上述研究表明，NK細胞過繼免疫治療有可能在根除殘留腫瘤干細胞方面發(fā)揮積極作用，NK細胞除直接殺傷腫瘤干細胞外，還可誘導其分化。在腫瘤干細胞和IL?2同時存在的情況下，CD16可抑制NK細胞毒性并促進其細胞因子分泌，NK細胞這種狀態(tài)稱為“分裂無力”。NK細胞可分泌大量IFN?γ，誘導腫瘤干細胞中的MHCⅠ、分化受體和細胞程序性死亡蛋白配體1（PDL1）表達水平升高，并降低腫瘤干細胞標志物CD44表達水平，這種誘導分化腫瘤干細胞的作用可使腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移受到抑制［77］。由此可見，NK細胞通過兩步機制抑制腫瘤進展，先殺傷一部分腫瘤干細胞，然后在NK細胞分裂停滯的狀態(tài)下，誘導剩余腫瘤干細胞群體細胞分化［78］。

三、針對膠質(zhì)瘤干細胞微環(huán)境免疫抑制的治療策略

通過增強腫瘤特異性抗原表達促進抗腫瘤免疫反應以達到治療效果的研究一直備受關(guān)注。晚近研究顯示，腫瘤干細胞免疫微環(huán)境中存在一種抑制免疫反應的機制，干擾免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用，免疫檢查點在免疫抑制的腫瘤干細胞微環(huán)境中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對這些免疫檢查點進行干預已成為腫瘤免疫治療的重要靶點［79?80］，其中細胞毒性 T 淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA?4）和細胞程序性死亡蛋白1（PD1）是重要治療靶點。CTLA?4亦稱為CD152，是T細胞負性調(diào)節(jié)因子，與T細胞具有高度親和性，從而導致其耗盡并抑制其活化［81?82］。PD1 表達于各種免疫細胞中，如活化的T細胞、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞［83］。多項研究顯示，各種惡性腫瘤組織中均可檢測到呈高表達的PD1及配體PDL1，與T細胞耗盡相關(guān)［84］，二者相互作用可明顯抑制活化的T細胞分泌IFN?γ并使T細胞無功能化［85］。CTLA?4抑制抗腫瘤免疫反應的作用已被闡明，表明抗CTLA?4治療可以解除T細胞的抑制作用，從而支持抗腫瘤免疫反應［86］。外周淋巴細胞CTLA?4表達水平下調(diào)可以改善膠質(zhì)瘤患者預后［87］。膠質(zhì)瘤進展期患者調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）中的PD1表達上調(diào)，膠質(zhì)瘤微環(huán)境中浸潤的淋巴細胞中PD1表達亦上調(diào)［88］，PD1軸在腫瘤進展和免疫逃逸過程中發(fā)揮關(guān)鍵促進作用［89］。因此，在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的惡性腫瘤中，阻斷PD1信號轉(zhuǎn)導通路可能是挽救免疫抑制并維持抗腫瘤免疫反應的有效方法。

針對膠質(zhì)母細胞瘤微環(huán)境中免疫抑制的研究一直是神經(jīng)腫瘤學的熱點。膠質(zhì)瘤中腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）和小膠質(zhì)細胞對腫瘤有明顯促進作用［90］，這兩種細胞功能嚴重依賴集落刺激因子1受體（CSF1R），阻斷CSF1R，無論是在膠質(zhì)瘤動物模型中還是膠質(zhì)瘤患者中均顯示出較好的療效［91?92］。M2型TAMs在腫瘤微環(huán)境中可促進膠質(zhì)瘤進展，當以CSF1R抑制劑為靶點時，TAMs可切換為抗腫瘤作用的M1型。PLX3397是一種可透過血?腦屏障的CSF1R抑制劑，可減少TAMs和小膠質(zhì)細胞在腫瘤微環(huán)境中的募集［93］。另一種CSF1R抑制劑BLZ945，可顯著抑制腫瘤進程并提高腫瘤模型中荷瘤動物的存活率，經(jīng)BLZ945治療后，M2型TAMs標志物表達水平減少，促腫瘤能力受到抑制［91］。雖然抑制CSF1R提供了一種具有前景的治療策略，但有研究顯示，PI3K、胰島素樣生長因子?1及其受體（IGF?1/IGF?1R）信號轉(zhuǎn)導通路激活可能對GSF1R抑制劑耐藥，因此，聯(lián)合應用GSF1R抑制劑與PI3K、IGF1R抑制劑可延長膠質(zhì)瘤患者總生存期［92］。

盡管在膠質(zhì)瘤免疫治療中各種免疫檢查點的研究一直受到高度關(guān)注，但PD1和CTLA?4始終是最多被研究的分子，并經(jīng)臨床試驗證實其對膠質(zhì)瘤的作用切實有效［94］。目前業(yè)已取得臨床進展的免疫治療藥物，以抗PD1抗體Nivolumab最受關(guān)注，但其在膠質(zhì)瘤治療中的療效十分有限，聯(lián)合應用免疫檢查點抑制劑與標準治療方案可以在一定程度上提高部分膠質(zhì)瘤患者的生存期［95］，改善預后，減少藥物不良反應［96］。此外，我們課題組的前期研究也顯示，TAMs可被膠質(zhì)瘤干細胞誘導并且發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［97］，成為膠質(zhì)瘤干細胞組織重構(gòu)進程中的重要組成部分，此類惡性轉(zhuǎn)化的免疫細胞亦構(gòu)成膠質(zhì)母細胞瘤高度異質(zhì)性的細胞學基礎［98］。

四、結(jié)論

膠質(zhì)瘤干細胞和膠質(zhì)瘤微環(huán)境決定了膠質(zhì)瘤的發(fā)生進展。膠質(zhì)瘤干細胞、各種免疫細胞與細胞因子之間的復雜多向相互作用，最終形成對腫瘤有支持作用的腫瘤免疫微環(huán)境，促進膠質(zhì)瘤干細胞始動的腫瘤發(fā)生、增殖和侵襲。針對膠質(zhì)瘤干細胞和膠質(zhì)瘤微環(huán)境中免疫抑制機制的研究，有助于研發(fā)免疫治療藥物，從而針對潛在的膠質(zhì)瘤治療靶點更有效地殺傷腫瘤細胞。

利益沖突無