基于頂空氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)的生咖啡豆快速鑒別方法

杜 萍，陳振佳*，楊 芳*，李曉蕾，楊 俊，劉春俠，梁靜思，任 芳

（1.昆明理工大學(xué)分析測(cè)試研究中心，云南省分析測(cè)試中心，云南 昆明 652094；2.中國(guó)咖啡工程研究中心，云南 德宏 678400；3.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；4.山東海能科學(xué)儀器有限公司，山東 德州 251500）

咖啡是茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea），熱帶常綠植物，為世界三大飲料之一[1-2]，也是中國(guó)主要熱帶經(jīng)濟(jì)作物之一[3]。咖啡商品豆主要有阿拉比卡（Coffea arabica）、羅布斯塔（Coffea robusta）以及利比里亞（Coffea liberica）三大原種，在中國(guó)被定義為小粒、中粒和大粒種咖啡。目前，以這3 個(gè)原種進(jìn)行研究開發(fā)，共衍生出100多種咖啡品種[4]。云南是中國(guó)最大的咖啡產(chǎn)區(qū)[5]，獨(dú)特的地理環(huán)境和立體式氣候造就了云南咖啡產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，其咖啡種植面積和咖啡豆產(chǎn)量均占國(guó)內(nèi)99%以上。盡管中國(guó)已成為世界咖啡生產(chǎn)大國(guó)、貿(mào)易大國(guó)和消費(fèi)大國(guó)之一，并保持快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)[6]，但還存在引種渠道不同、栽培變種繁多混雜以及形態(tài)認(rèn)識(shí)不足等諸多問題[7]，這些差異對(duì)咖啡豆產(chǎn)品品質(zhì)有顯著影響。例如，生咖啡豆中揮發(fā)性成分是咖啡豆產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)表達(dá)的重要特征之一，但不同地理環(huán)境、不同品種的生咖啡豆內(nèi)風(fēng)味物質(zhì)差異會(huì)影響咖啡豆產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。目前，關(guān)于不同咖啡豆風(fēng)味方面的研究主要集中在烘焙咖啡豆，如對(duì)咖啡豆烘焙過程中香氣物質(zhì)及其變化規(guī)律的研究[8-10]。Wei Feifei[11]、Schramm[12]等采用核磁共振譜、單一光子離子化離子阱質(zhì)譜等分析儀器對(duì)咖啡豆的烘焙過程中化學(xué)成分進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤分析。近年來，國(guó)內(nèi)關(guān)于烘焙咖啡豆香氣成分的研究也在逐漸增加。周斌等[13]研究了不同產(chǎn)地咖啡豆香氣成分組成，王瑩等[14]研究了興隆咖啡烘焙過程中香氣物質(zhì)的變化規(guī)律。然而，關(guān)于生咖啡豆揮發(fā)性成分研究較少。

目前，咖啡豆揮發(fā)性成分分析主要采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以及電子鼻法。Aline等[15]采用頂空-固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)巴莫生咖啡豆中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析；也有報(bào)道采用頂空-固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)中國(guó)產(chǎn)區(qū)生咖啡豆揮發(fā)性成分進(jìn)行研究[16-18]。電子鼻技術(shù)可用于感知咖啡樣品因烘焙加工不同而引起的差異[14,19]，但存在傳感器重復(fù)性不好及不具備化合物準(zhǔn)確定性分析的譜庫等問題。這些傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)及數(shù)據(jù)分析專業(yè)性強(qiáng)等問題。

氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技術(shù)是近年出現(xiàn)的一種新的氣相色譜分離和檢測(cè)技術(shù)，完美結(jié)合了GC的分離能力和IMS快速響應(yīng)、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)[20]，無需樣品前處理、實(shí)現(xiàn)無損快速檢測(cè)，適合于揮發(fā)性成分的痕量探測(cè)，主要用于軍事[21]、環(huán)境空氣監(jiān)測(cè)[22]以及人體呼吸氣體痕量組分檢測(cè)[23]。近年來，GC-IMS在食品風(fēng)味[24-28]、食品發(fā)全[29-32]等領(lǐng)域也有應(yīng)用，主要集中在食用油、肉類、谷物、海鮮、蜂蜜、食用菌及乳制品方面，鮮見其應(yīng)用于生咖啡豆的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以云南不同品種的生咖啡豆為樣品，采用頂空-GC-IMS（headspace-GC-IMS，HS-GC-IMS）對(duì)19 種生咖啡豆的揮發(fā)性成分進(jìn)行采集和分析。建立不同品種生咖啡豆揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜，根據(jù)揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)據(jù)差異性分析，對(duì)不同品種生咖啡豆進(jìn)行區(qū)分，為咖啡豆無損分類識(shí)別、產(chǎn)地追溯、品質(zhì)控制與評(píng)價(jià)方法提供了一定參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

生咖啡豆由中國(guó)咖啡工程研究中心提供，德宏咖啡（云南德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所），水洗加工處理得到生咖啡豆。19 個(gè)生咖啡豆樣品中，編號(hào)816為大粒種，編號(hào)LYL11為阿拉比卡小粒種，編號(hào)799～815為阿拉比卡小粒種的各栽培變種，均來自于云南德宏，具體信息見表1。

表1 19 個(gè)生咖啡豆樣品Table 1 Information about 19 samples of green coffee beans

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec?食品風(fēng)味分析與質(zhì)量控制系統(tǒng)（配有CTC自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及Library Search定性軟件的GC-IMS系統(tǒng)） 德國(guó)G.A.S公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-GC-IMS分析

采用快速、靈敏、無損的GC-IMS技術(shù)對(duì)生咖啡豆樣品品種進(jìn)行揮發(fā)性成分的區(qū)分及鑒別。由于GC-IMS分析生咖啡豆揮發(fā)性的特征成分鮮有報(bào)道，為表達(dá)真實(shí)的狀態(tài)，檢測(cè)到低溫下易揮發(fā)的揮發(fā)性物質(zhì)，采用顆粒無粉碎直接裝入樣品瓶。根據(jù)生咖啡豆特性、樣品瓶大小及均勻振蕩加熱的方式，選擇樣品量4.5 g、孵化溫度60 ℃、孵化時(shí)間10 min，因此與傳統(tǒng)氣相色譜-質(zhì)譜的方法相比較，GC-IMS方法樣品處理及分析的溫度較低，能真實(shí)反映樣品原始的狀態(tài)。在正式測(cè)試樣品之前，19 批樣品中抽取3 批生豆篩選優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，觀察其代表性的峰高，最終確定分析方法。

1.3.2 HS進(jìn)樣條件

孵化溫度60 ℃；孵化時(shí)間10.0 min；加熱方式：振蕩加熱；頂空進(jìn)樣針溫度65 ℃；進(jìn)樣量500.0 μL，不分流模式；載氣：高純氮?dú)猓兌取?9.999%，推斷和清洗進(jìn)樣針）；清洗時(shí)間0.50 min。

1.3.3 GC條件

FS-SE-54-CB-1石英毛細(xì)管柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm）；色譜柱溫度40 ℃；載氣：高純N2（純度≥99.999%）；載氣流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min，8 min內(nèi)線性增至100 mL/min，10 min內(nèi)線性增至150 mL/min，運(yùn)行時(shí)間20 min。

1.3.4 IMS條件

漂移管長(zhǎng)度98 mm；管內(nèi)線性電壓400 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為N2（純度≥99.999%）；漂移氣流速150 mL/min；放射源：β射線（氚（3H））；離子化模式：正離子。

1.3.5 樣品測(cè)定

取4.5 g樣品，放入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，60 ℃孵化10 min，通過頂空進(jìn)樣用Flavour Spec?食品風(fēng)味分析儀進(jìn)行測(cè)試。經(jīng)G.A.S.的功能軟件分析可給出樣品中揮發(fā)性有機(jī)物的差異譜圖、軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫及IMS數(shù)據(jù)庫可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生咖啡豆HS-GC-IMS譜圖分析

生咖啡豆化學(xué)組分復(fù)雜，大部分是形成烘焙咖啡產(chǎn)品特有風(fēng)味的前體物質(zhì)，其中揮發(fā)性成分是重要物質(zhì)之一。生咖啡豆具有的揮發(fā)性成分直接影響烘焙咖啡產(chǎn)品的香氣形成。通過HS-GC-IMS對(duì)生咖啡豆揮發(fā)性成分進(jìn)行無損分析，最大程度地表達(dá)樣品的指紋特征，確保樣品數(shù)據(jù)的全面性、真實(shí)性及溯源性。

圖1 生咖啡豆編號(hào)815（A）、816（B）、LYL-11（C）的GC-IMSFig. 1 GC-IMS topographic plots of green coffees 815 (A), 816 (B), and LYL-11 (C)

圖2 生咖啡豆樣品峰高差異（A）和編號(hào)815（B）、816（C）、LYL-11（D）的偽彩色對(duì)比圖Fig. 2 Comparison of peak heights (A) and pseudo color images of green coffees 815 (B), 816 (C), and LYL-11 (D)

采用HS-GC-IMS對(duì)19 個(gè)云南生咖啡豆進(jìn)行揮發(fā)性成分差異分析，如圖1所示，整個(gè)譜圖代表了樣品頂空中所有揮發(fā)性成分。由于樣品數(shù)量多，選取代表性樣品，圖1中只顯示了編號(hào)815（C. arabica cv. Typica）、816（C. dewevrei cv. Excelsa）及LYL11（C. arabica）。可以看出，HS-GC-IMS首先對(duì)咖啡豆復(fù)雜的揮發(fā)性成分進(jìn)行GC初步分離，不同保留時(shí)間流出的組分以氣態(tài)分子的形式進(jìn)入IMS電離室，與逆方的漂移氣分子發(fā)生碰撞，由于組分離子在質(zhì)量、碰撞截面和電荷數(shù)等因素上的差異進(jìn)行了二次分離。通過獲取離子漂移時(shí)間和離子峰強(qiáng)度可分別對(duì)各組分進(jìn)行定性和定量分析。每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性成分。

為直觀清晰比較不同品種生咖啡豆樣品之間的差異，編號(hào)815的生咖啡豆以差譜偽彩色圖形顯示[33-34]，對(duì)比其與編號(hào)816和編號(hào)LYL11之間的差異。圖2中濃度相同的物質(zhì)顏色抵消為白色。樣品中的藍(lán)色區(qū)域表示該物質(zhì)濃度低于參比樣品，藍(lán)色越深，表示濃度越低；被參比樣品中的紅色區(qū)域表示該物質(zhì)濃度高于參比樣品，紅色越深，表示濃度越高。從圖2可以看出，3 種生咖啡豆揮發(fā)性成分的濃度和種類差異很大，以所選峰為例如圖2紅圈所示，在3 個(gè)樣品中峰高的變化非常明顯，即使是屬于同一原種小粒種咖啡的815和LYL11，風(fēng)味物質(zhì)差異也較大。

2.2 生咖啡豆的HS-GC-IMS譜圖定性分析

根據(jù)揮發(fā)性成分GC保留時(shí)間和離子遷移時(shí)間對(duì)生咖啡豆揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析，從19 個(gè)生咖啡豆樣品選取編號(hào)LY11的生咖啡豆樣品，共計(jì)檢測(cè)出137 種化學(xué)組分，通過內(nèi)置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫進(jìn)行二維定性，由于該數(shù)據(jù)庫在食品風(fēng)味分析領(lǐng)域正處于擴(kuò)展和完善中，因此確定了42 種揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分（表2）。這42 種物質(zhì)主要是醛類、酯類、醇類、酮類、吡嗪類、酸類及含硫化合物，與咖啡揮發(fā)性成分組成的相關(guān)報(bào)道一致[16-17,35]。

表2 生咖啡豆揮發(fā)性成分的定性Table 2 Green coffee volatiles identi fied by HS-GC-IMS

續(xù)表2

2.3 生咖啡豆的HS-GC-IMS譜圖比較分析

圖3 19 個(gè)生咖啡豆樣品的指紋圖譜Fig. 3 Fingerprints of 19 samples of coffee green beans

為方便快速地對(duì)比不同樣品間揮發(fā)性有機(jī)物的差異，F(xiàn)lavourSpec?系統(tǒng)自帶LAV軟件內(nèi)置的Gallery Plot插件，選取有明顯差異及變化規(guī)律的離子峰生成指紋圖譜。從圖3可以看出，紅色圈中是特征指紋峰的表達(dá)，其中編號(hào)LYL-11阿拉比卡小粒種、編號(hào)816大粒種和編號(hào)799～815阿拉比卡小粒種的各栽培變種3大類差異明顯，而編號(hào)799～815阿拉比卡小粒種的各栽培變種之間揮發(fā)性成分的差異相對(duì)較小，或許與其栽培變種系列有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

圖4 不同品種生咖啡豆的指紋圖譜Fig. 4 Fingerprints of different varieties of coffee green beans

由于樣品數(shù)量多，信息量大，只選取編號(hào)816大粒種、編號(hào)LYL11阿拉比卡小粒種以及編號(hào)801、805、809、810、815的阿拉比卡小粒種的栽培變種進(jìn)行揮發(fā)性化學(xué)成分的差異分析。如圖4所示，整個(gè)指紋圖譜中從上到下依次為801、805、809、810、815、816和LYL-11的測(cè)試樣品：紅色框中的揮發(fā)性物質(zhì)分別是樣品801、809、810、815中含量較高的物質(zhì)，分別為801樣品中的丁酸乙酯、3-羥基丁酮等；809樣品中的戊酸乙酯等；815樣品中的乙酸丙酯等；805樣品中沒有含量較高的特征物質(zhì)；810樣品中有未鑒定出的含量較高的特征物質(zhì)，但由于目前軟件內(nèi)置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S.的IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫二維定性數(shù)據(jù)庫還不夠完善。綠色框中的揮發(fā)性物質(zhì)則分別是816和LYL-11中含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)，816樣品中含量較高的物質(zhì)2-甲基丁酸甲酯、1-戊醇、反-2-庚烯醛、5-甲基-2-呋喃甲醇、丙酸、丁酸、3-甲基丁醇、異戊醇、丙醇和異丙醇等；LYL-11樣品中的含量較高的物質(zhì)2,6-二甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛和2-甲基吡嗪等揮發(fā)性成分。橙色框中的物質(zhì)則為幾個(gè)樣品都含有且含量相近的揮發(fā)性物質(zhì)，如苯甲醛、異丁醛、2-苯乙醇、2,3-戊二酮和2,3-丁二酮等。黃色框中的物質(zhì)，如三甲基吡嗪、異丙醇、戊酸乙酯、戊醛等揮發(fā)性成分，是在LYL-11樣品中含量較低，在其他6 個(gè)樣品中含量均較高的組分。

2.4 主成分分析（principal component analysis，PCA）

圖5 不同品種生咖啡豆的PCAFig. 5 PCA of different varieties of coffee green beans

根據(jù)HS-GC-IMS得到不同品種生咖啡豆的指紋圖譜（圖4），能大致區(qū)分生咖啡豆的幾大品種，并確定揮發(fā)性成分差異，但GC-IMS的二維圖形化表達(dá)（圖1）會(huì)存在一定主觀認(rèn)知的影響，因此采用PCA方法進(jìn)一步分析，使不同品種間的特征差異可視化。通過FlavourSpec?食品風(fēng)味分析儀內(nèi)置的PCA分類模型，對(duì)19 個(gè)生咖啡豆樣品的定性及未定性的全部揮發(fā)性化合物分別進(jìn)行分析（圖5），主成分1和主成分2的方差貢獻(xiàn)率分別為23%和19%。19 個(gè)生咖啡豆的樣品GC-IMS譜呈明顯的區(qū)域分布特點(diǎn)，編號(hào)799～815阿拉比卡小粒種的不同栽培變種在PCA中相對(duì)集中在一定區(qū)域，與編號(hào)LYL-11阿拉比卡小粒種和編號(hào)816大粒種有明顯間距。這一結(jié)果說明采用HS-GC-IMS方法，結(jié)合PCA，可有效區(qū)分阿拉比卡小粒種的不同栽培變種、阿拉比卡小粒種及816大粒種。因此，HS-GC-IMS技術(shù)可對(duì)不同品種生咖啡豆進(jìn)行區(qū)分，進(jìn)而篩選分級(jí)，該方法具有快速、無損等優(yōu)點(diǎn)。然而，由于樣品數(shù)量有限，下一步可擴(kuò)大樣品品種、種植區(qū)域及樣本數(shù)量，為建立生咖啡豆快速、無損分類提供科學(xué)方法。

3 結(jié) 論

揮發(fā)性成分已廣泛用于咖啡豆的地理來源鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)建立等方面[16]，而生咖啡豆具有的揮發(fā)性成分是烘焙咖啡產(chǎn)品香氣形成的重要前體物質(zhì)之一。本實(shí)驗(yàn)采用FlavourSpec?食品風(fēng)味分析儀，在無需樣品前處理的條件下，直接加熱咖啡豆原粒樣品頂空進(jìn)樣，20 min之內(nèi)快速檢測(cè)生咖啡豆中揮發(fā)性化學(xué)成分信息。儀器配備的軟件可獲得生咖啡豆樣品的氣相離子遷移二維譜圖、指紋譜圖以及PCA等，快速分析生咖啡豆樣品間的共性與差異，對(duì)不同品種的生咖啡豆進(jìn)行了分類劃分；內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫可定性化合物的組分，共鑒別出42 種揮發(fā)性化學(xué)成分。此方法快速、靈敏、準(zhǔn)確、無損的特點(diǎn)，為生咖啡豆將來分類識(shí)別、產(chǎn)地追溯、品質(zhì)控制與評(píng)價(jià)方法提供了一定參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。在咖啡原料品種選育、生豆篩選分級(jí)、加工工藝優(yōu)化、感官品控、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立等方面將具有很好的應(yīng)用前景及指導(dǎo)意義。

該實(shí)驗(yàn)方案屬于新的分析技術(shù)在咖啡豆揮發(fā)性成分檢測(cè)中應(yīng)用的創(chuàng)新性試探[36]，實(shí)驗(yàn)中生咖啡豆樣品數(shù)量較少、來源單一、區(qū)域覆蓋面窄。如果加大樣品數(shù)量，回集不同來源的生咖啡豆，建立各自指紋圖譜的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫模型，將為咖啡產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化、品牌化發(fā)展將起到積極的推動(dòng)作用。