茶樹CsAN1基因的表達(dá)、連鎖定位及其與新梢顏色的關(guān)系研究

王留彬，周 斌，彭 敏，葉 竹，譚禮強(qiáng)，王麗鴛，成 浩，唐 茜*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家茶樹改良中心，浙江杭州 310008）

茶多酚是茶樹（Camelliasinensis（L.）O.Kuntze）中的主要次生代謝產(chǎn)物，其含量占鮮葉干重的18%～36%，它包括兒茶素類（黃烷醇類），黃酮及黃酮醇類，花青素和花白素類，酚酸及縮酚酸等[1]。其中兒茶素類是多酚類化合物的主體，占新梢干重的12%～24%，而花青素一般僅占干重的0.01%。但是在極少數(shù)具有紫色新梢的特色茶樹品種中，如“紫鵑”“紫嫣”等，花青素含量可高達(dá)3%[2]。過去認(rèn)為，紫色芽葉制成的綠茶湯色發(fā)褐，滋味苦澀，葉底靛藍(lán)而品質(zhì)較差[3]。近年來隨著發(fā)現(xiàn)花青素所具有的特殊營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值，能夠幫助人們抵御某些癌癥，心血管病與機(jī)體老化相關(guān)的疾病[4]。因此，開發(fā)高含量花青素茶葉品種成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

植物中花青素的生物合成途徑已經(jīng)比較清晰，且這一代謝途徑在不同物種中是高度保守的[5]。其他模式植物上的研究表明，MYB、bHLH 和WD40 是參與花青素合成途徑調(diào)控的主要轉(zhuǎn)錄因子，其中MYB 經(jīng)常起主導(dǎo)調(diào)控作用[6]。MYB 家族是植物中最大一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物次生代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抵抗病原菌方面有著重要的作用[7]。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域不同可分為3種：R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和MYB 相關(guān)蛋白。其中R2R3-MYB 類轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)重要的功能就是調(diào)控花青素的生物合成[7]。

在茶樹上關(guān)于花青素積累調(diào)控的分子機(jī)制研究起步較晚，但最近利用高花青素茶樹品種“紫鵑”取得了一些突破。根據(jù)Sun B.等[8]在“紫鵑”上的研究結(jié)果表明，茶樹基因組中一個(gè)R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子CsAN1可以特異地上調(diào)bHLH、CsGL3和花青素合成途徑下游多個(gè)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)“紫鵑”新梢中的花青素積累。同時(shí)，他們還分析了CsAN1啟動(dòng)子中CpG 島的甲基化水平與葉片紫色表型的相關(guān)性，證明了在低溫和長(zhǎng)時(shí)間光照條件下CsAN1啟動(dòng)子甲基化水平會(huì)降低，導(dǎo)致該轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)葉中花青素積累[9]。

“紫鵑”選育自云南大葉種，屬C.sinensisvar.assamica變種。除“紫鵑”外，近年來四川農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹育種團(tuán)隊(duì)選育出的花青素含量相對(duì)更高的“紫嫣”[10]，以及用紫嫣種子繁殖的子代（目前還未審定登記，為品系）。它們都屬于C.sinensisvar.sinensis變種。那么CsAN1在這些紫色品種系中表達(dá)量是否也顯著高于普通茶樹品種？另外，在綠色芽葉品種中，夏秋季出現(xiàn)淡紫色芽葉是否也與CsAN1相關(guān)？CsAN1是否與調(diào)控茶樹新梢顏色的QTL 位點(diǎn)共定位？回答上述問題有助于進(jìn)一步明確CsAN1在不同類型茶樹品種花青素合成過程中的調(diào)控作用，了解它的作用范圍和影響大小。因此，本文針對(duì)上述問題展開研究。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗(yàn)使用了以下無性系茶樹品種/系：紫嫣（ZY）、紫鵑（ZJ）、福鼎大白茶（FD）、龍井43（LJ43）、川農(nóng)黃芽早（CNHYZ）、紫嫣F1-1（ZY_F1-1）和紫嫣F1-4（ZY_F1_4）。其中后面兩個(gè)為紫嫣雜交后代中選育出的新品系。根據(jù)新梢顏色（圖1a）可初步判斷ZY、ZJ、ZY_F1-1、ZY_F1-4 均為高花青素材料，而FD、CNHYZ 為正常品種對(duì)照。上述材料均種植在四川一枝春茶業(yè)有限公司品種園（沐川），于2017 年4月20 日采其春季新梢第二葉，立即液氮速凍保存，帶回實(shí)驗(yàn)室存放于-80 ℃冰箱備用。為進(jìn)行連鎖分析，本試驗(yàn)還使用了龍井43×白毫早（LJ43×BHZ）F1代作圖群體（n=55），于2017 年6 月采一芽二葉新梢，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核酸提取及質(zhì)量檢測(cè)

DNA 提取采用植物基因組提取試劑盒，RNA提取使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒，均購(gòu)買自天根生化科技有限公司（北京），按照試劑盒說明書進(jìn)行核酸提取。提取后用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）測(cè)定核酸濃度和純度。

1.2.2 引物序列

本研究中使用的引物名稱及序列信息見表1。其中RT-PCR 分析中CsAN1基因的引物組合為CsAN1-F/CsAN1-R，參照Sun B.等文獻(xiàn)[8]。熒光定量分析茶樹內(nèi)參基因選擇CsPTB1，RT-PCR 引物組合為CsPTB1-F/CsPTB1-R[11]。用于基因片段擴(kuò)增的引物為CsAN1-F2/ CsAN1-R2，其目標(biāo)片段長(zhǎng)度為441 bp。所有引物均由四川擎科生物科技有限責(zé)任公司合成。

表1 本研究使用的引物序列信息Table 1 The primers used in this study

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR

cDNA 合成使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連），具體方法參考前人的文獻(xiàn)[12-13]。用逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 稀釋6 倍作為模板，以CsPTB1為內(nèi)參基因，按照SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa，大連）的方法，在CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀上（Bio-Rad，美國(guó)）進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性30 s，第二步PCR，95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性30 s，總共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3 次重復(fù)。

1.2.4 花青素含量測(cè)定

采用pH 示差法測(cè)定7 個(gè)茶樹品種（系）春梢第二葉花青素含量[14]。以吸光度差值A(chǔ)=（A524-A700）pH1.0-（A524-A700）pH4.5表示不同樣品中花青素的相對(duì)含量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

1.2.5 SNP 標(biāo)記開發(fā)及群體基因型分析

以作圖群體的兩個(gè)親本LJ43 和BHZ 的DNA為模板，用CsAN1-F2/CsAN1-R2 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。取5 μL PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。將有目標(biāo)條帶的PCR 產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，基于測(cè)序峰圖找雜合SNP 位點(diǎn)，并將其作為SNP 標(biāo)記進(jìn)行群體基因型分析。F1代作圖群體的基因型分析也采用PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序法[15]。

1.2.6 CsAN1 基因連鎖定位及數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

利用上述SNP 標(biāo)記在作圖群體中的基因型數(shù)據(jù)，結(jié)合課題組前期已有的483 個(gè)SSR 標(biāo)記在同一作圖群體的基因型數(shù)據(jù)[16]，用JoinMap 4.0 軟件進(jìn)行連鎖定位，相關(guān)參數(shù)設(shè)置見參考文獻(xiàn)[17]。采用方差分析判斷不同品種（系）間CsAN1基因表達(dá)量和花青素含量差異顯著性。用t檢驗(yàn)分析CsAN1基因SNP 位點(diǎn)的基因型與茶樹新梢顏色評(píng)級(jí)之間的相關(guān)性[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsAN1 的相對(duì)表達(dá)量與花青素含量

圖1b 是不同茶樹品種中新梢中CsAN1相對(duì)表達(dá)量和花青素含量測(cè)定結(jié)果。除了LJ43 的CsAN1的表達(dá)水平低于FD 外，其他品種（系）的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照FD（P＜0.05）。其中以ZY_F1-1表達(dá)量最高，為對(duì)照的24.4 倍；其次分別是ZJ、ZY_F1-4 和ZY。圖1b 次坐標(biāo)軸顯示了對(duì)應(yīng)樣品的花青素含量。由于pH 示差法靈敏度有限，沒能檢出FD 和CNHYZ 中花青素的含量。在其余品種（系）中，ZY 的花青素相對(duì)含量最高（0.306），其次是ZY_F1-1、ZJ、ZY_F1-4 和LJ43，分別為0.264、0.253、0.101和0.027。比較圖1a 和b 可以看出，花青素相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果和葉片的紫色程度基本相符。用CsAN1的表達(dá)量和花青素含量數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者相關(guān)系數(shù)r=0.667，但由于樣本量較少，此相關(guān)性未達(dá)到P＜0.05 的顯著水平。

圖1 7 個(gè)茶樹品種春梢第二葉（a）和它們的CsAN1 表達(dá)及花青素含量（b）Figure 1 The second leaves of the seven cultivars （a），relative expression levels of CsAN1 and the anthocyanins contents in them （b）

2.2 CsAN1 基因SNP 標(biāo)記開發(fā)

以茶樹龍井43 和白毫早的基因組DNA 為模版，用CsAN1-F2/CsAN1-R2 擴(kuò)增長(zhǎng)度為441bp 的目標(biāo)片段（圖2a）。PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2b所示，測(cè)序發(fā)現(xiàn)的SNP 位點(diǎn)如圖2c 所示。在LJ43品種中共檢測(cè)到2 個(gè)呈雜合狀態(tài)的SNP 位點(diǎn)，分別在第642 位和第823 位（起始密碼子為1）。LJ43 品種在上述兩個(gè)SNP 位點(diǎn)均呈雜合狀態(tài)，而另一個(gè)親本BHZ 中未檢測(cè)到SNP，為純合狀態(tài)（圖2c）。根據(jù)這兩個(gè)SNP 位點(diǎn)在兩個(gè)親本中的特點(diǎn)，可將其作為“l(fā) m×ll”型遺傳標(biāo)記，采用擬側(cè)交作圖策略進(jìn)行連鎖分析[19]。

圖2 CsAN1 片段擴(kuò)增（a、b）及SNP 檢測(cè)和基因型分析（c）Figure 2 PCR amplification of CsAN1 （a，b） and the SNP loci detection and genotyping in the mapping population （c）

2.3 群體基因型分析和連鎖定位

用CsAN1-F2/CsAN1-R2 引物對(duì)擴(kuò)增55 份龍井43×白毫早F1代作圖群體的CsAN1基因片段，然后測(cè)序，其中兩個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果如圖2c 所示。統(tǒng)計(jì)55 份樣品在兩個(gè)SNP 位點(diǎn)的基因型，結(jié)果見表2。在SNP642處，基因型為純合GG 型有15 個(gè)，為雜合G/T 型的有40 個(gè)；由于兩個(gè)SNP 位點(diǎn)緊密連鎖，在SNP823處基因型分離完全一致，為TT 型15個(gè)，C/T 型40 個(gè)。兩個(gè)標(biāo)記均呈偏分離狀態(tài)（χ2檢驗(yàn)P＜0.01）。表2 中還列出了2014—2015 年夏季觀測(cè)的該群體新梢顏色分級(jí)數(shù)據(jù)[18]。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的基因?yàn)榧兒系淖哟╪=15）的新梢顏色等級(jí)明顯高于基因型為雜合的子代（n=40），且該結(jié)果在3次觀測(cè)中是一致的，均達(dá)極顯著水平（P＜0.01，表3）。

根據(jù)兩個(gè)SNP 的基因型分析結(jié)果，結(jié)合課題組前期已完成的483 個(gè)SSR 標(biāo)記在同一作圖群體的基因型數(shù)據(jù)，進(jìn)行連鎖關(guān)系分析，結(jié)果成功將CsAN1基因定位到茶樹的LG08 號(hào)連鎖群上，相鄰的兩個(gè)標(biāo)記分別是CsFM1445和CsFM1925（圖3）。有意思的是CsAN1的所在位置與前期研究中定位到的一個(gè)控制茶樹新梢顏色的主效QTL（qYSC8，圖3 連鎖群右邊的框線圖表示）基本重合。

表2 龍井4×白毫早F1 代群體的CsAN1 基因型分析結(jié)果及3 次新梢顏色分級(jí)觀測(cè)數(shù)據(jù)Table 2 Genotyping results of CsAN1 and young shoot color （YSC） grading results in the‘LJ43’בBHZ’ F1 population

表3 CsAN1 不同基因型間新梢顏色觀測(cè)結(jié)果比較Table 3 The comparison of young shoot color in individuals with different CsAN1 genotypes

圖3 CsAN1 在茶樹LG08 連鎖群上的位置（左）及qYSC8 的位置和LOD 值分布（右）Figure 3 Position of CsAN1 on the LG08 of the tea plant（left）and Position of qYSC8 and LOD plotting （right）

3 討論和結(jié)論

茶樹幼嫩葉片中的花青素含量對(duì)于茶葉生產(chǎn)具有重要影響。在Sun B.等[8]的研究中發(fā)現(xiàn)茶樹的一個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子CsAN1參與了紫色新梢的茶樹品種紫鵑花青素合成調(diào)控。他們通過比較ZJ 新梢不同葉位的基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)CsAN1的表達(dá)量高低與花青素的含量成正比，接著利用異源超表達(dá)等分子生物學(xué)手段證實(shí)了CsAN1的確能夠調(diào)控花青素的合成。

本研究結(jié)果證實(shí)CsAN1在紫嫣等其他高花青素品種（系）中的表達(dá)量也顯著高于對(duì)照品種（FD），因此在這些品種（系）中花青素的積累也可能是由于CsAN1基因的高表達(dá)。但由圖1b 可知，在紫色品種中并非CsAN1的表達(dá)量越高花青素的含量就越高，在ZY_F1-1 和ZJ 中該基因的表達(dá)量均超過了ZY，但花青素含量卻稍低于ZY。推測(cè)還有其他因素參與了花青素合成調(diào)控。Tan L.Q.等[18]通過數(shù)量性狀定位分析找到了至少5 個(gè)參與茶樹新梢顏色調(diào)控的QTL 位點(diǎn)，可支持上述推測(cè)。

基于LJ43 中檢測(cè)到CsAN1的兩個(gè)雜合的SNP位點(diǎn)，本研究通過對(duì)LJ43×BHZ 的雜交作圖群體進(jìn)行基因型分析，成功將CsAN1定位到茶樹的LG08連鎖群上，并且結(jié)合作圖群體的新梢顏色數(shù)據(jù)證實(shí)了遺傳群體中CsAN1的不同基因型間新梢顏色差異顯著。定位結(jié)果還進(jìn)一步揭示了該基因與之前定位的調(diào)控茶樹新梢顏色的QTL 基本共定位。雖然該結(jié)果并不能直接證明CsAN1參與了作圖群體中花青素合成調(diào)控，但仍然為闡明該基因在茶樹花青素合成方面的功能提供了有力的遺傳學(xué)證據(jù)。