妊娠晚期母血與臍血中sFas和Fasl配體的濃度分析

sFas和Fasl配體是參與細(xì)胞凋亡過程的分子。細(xì)胞凋亡是復(fù)雜的多因素過程，其通過細(xì)胞毒性途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡以達(dá)到消除壞的、老的或突變的細(xì)胞。在生理條件下構(gòu)成抗癌防御，而在患有癌癥的個體中有所降低[1～4]。細(xì)胞凋亡是重建母體蛻膜，維持適當(dāng)?shù)哪柑ッ庖吆头乐辜?xì)胞侵入螺旋動脈所必需的過程。在妊娠過程中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，以防止妊娠對同種異體移植物的排斥。免疫調(diào)節(jié)可能與細(xì)胞凋亡變化有關(guān)，細(xì)胞凋亡增強可導(dǎo)致這一過程的降低[1～3，5]。在妊娠過程中，血管床容量增加和輸氧分子需求增加可能導(dǎo)致骨髓細(xì)胞凋亡過程減緩，這可以延長紅細(xì)胞的壽命，保護(hù)孕婦免于貧血[4，5]。sFas 是來自腫瘤壞死因子（TNF）家族的膜受體，存在死亡域，為了啟動細(xì)胞凋亡過程，必須摻入Fas配體Fasl 分子。sFas 與Fasl 對于細(xì)胞，特別是對腫瘤細(xì)胞的存活及免疫消除病毒感染和癌癥至關(guān)重要。

在患有免疫系統(tǒng)疾病和癌癥的個體中觀察到更高水平的sFas 與Fasl[6，7]，sFas 和Fasl的應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)依賴于各種信號分子，如p53，核因子的活化，kappa B，特異性蛋白-1 和早期生長反應(yīng)因子。作為DNA 鏈碎片整理的細(xì)胞毒性效應(yīng)取決于細(xì)胞周期階段，并且在無差異細(xì)胞中表現(xiàn)最強，同時在干細(xì)胞中存在，也可在臍帶血中觀察到[6，7]。

sFas 與Fasl 系統(tǒng)的激活不僅會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還會保護(hù)滋養(yǎng)層母體免疫系統(tǒng)免受侵害。sFas 與Fasl 系統(tǒng)保護(hù)母體和胎兒之間活化白細(xì)胞的遷移，相反，可溶性Fas，即sFas 可通過其他機制起作用，通過減緩細(xì)胞凋亡，保護(hù)不同細(xì)胞和活化T 淋巴細(xì)胞免于凋亡[6]。Fasl 在免疫組織和細(xì)胞中高白細(xì)胞和胎盤中存在。膜Fas 受體是影響促凋亡過程增加的最重要因素之一[7]。

sFas 在Fas mRNA的替代折疊過程中形成，形成的新蛋白質(zhì)分子含有缺失或無能力的跨膜結(jié)構(gòu)域。此外，F(xiàn)asl 是崩解的蛋白水解產(chǎn)物，其濃度可能與細(xì)胞凋亡過程的強度成正比[8]?？梢约僭O(shè)高濃度的sFas 與凋亡減少相關(guān)，對該配體的親和力較低。若需要增加該過程，需要更高濃度的Fasl。sFas 對Fas 與Fasl 具有抑制作用，影響細(xì)胞凋亡[9，10]。

sFas 在達(dá)到受體前抑制Fasl 配體，減緩Fas 依賴性細(xì)胞凋亡。妊娠晚期時sFas 可能在胎兒細(xì)胞中合成并通過胎兒臍帶血轉(zhuǎn)移到胎盤床中。妊娠早期sFas 濃度低，免疫耐受現(xiàn)象可能在妊娠晚期發(fā)生變化[9，11]。胎盤細(xì)胞凋亡由于妊娠進(jìn)展而增加，因此妊娠晚期是評估預(yù)期的sFas和Fasl濃度的最佳時間[12]?，F(xiàn)在很少有數(shù)據(jù)描述妊娠晚期母體血液和臍帶血中sFas 和Fasl的客觀價值[8，9，11，12]。 但有報道這些分子的生理濃度可以評估胎盤功能障礙或免疫耐受失敗的風(fēng)險[11，12]。目前尚不清楚在妊娠晚期，是否可以預(yù)測同種異體移植排斥或胎盤功能障礙的風(fēng)險增加由高濃度的Fasl 或降低sFas的濃度引起。從臍帶動脈到靜脈的胎兒循環(huán)中不同濃度的sFas 可以解釋其在胎盤中的作用和分布。

本研究通過分析妊娠晚期孕婦的靜脈血清與臍帶血清中抗凋亡sFas 和促凋亡Fasl 這兩類分子的濃度以及相關(guān)性，評估sFas和Fasl分布對胎盤細(xì)胞凋亡過程強度和胎兒血液循環(huán)系統(tǒng)的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇我院2017年5月～2018年2月無并發(fā)癥和胎兒正常發(fā)育的36 名妊娠晚期孕婦，年齡25～39歲，平均（33.07±4.02）歲。孕周為38～ 41周，平均（39.2±0.73）周。初產(chǎn)婦占66.7%。在12～14周時，使用產(chǎn)前超聲掃描估計妊娠孕周，由于各種手術(shù)適應(yīng)證，所有產(chǎn)婦均選擇剖宮產(chǎn)分娩。

1.2 方法所有入選孕婦剖宮產(chǎn)前2～3h，肘靜脈取母體靜脈血，從臍帶的胎盤部分分離新生兒后，從靜脈和動脈分開取臍帶血，分別測定母體靜脈血清和臍動脈、臍靜脈血清中的sFas 濃度。血樣的體積各不少于5ml，將樣品置于沒有抗凝血因子的試管中，并在室溫下儲存約60min，完成自然凝結(jié)。在形成凝塊后，通過RCF389 型離心機，將樣品離心15min，離心后，將血液樣品的上清液置換到管中，在-70℃恒溫下，冷凍并儲存，直至測量。通過Fas ELISA 試劑盒測量sFas，最小可檢測劑量（MDD）范圍為30.1～2 000pg/ml，靈敏度為20pg/ml。通過Fasl ELISA 試劑盒測量Fasl，最小可檢測劑量（MDD）范圍為15.4～1 000pg/ml，靈敏度為8.05pg/ml。sFas 與Fasl的血清濃度單位均為pg/ml。所有試劑盒均來自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 14.0 統(tǒng)計軟件和Excel 2010 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過算術(shù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、最大值和最小值來估計測量參數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種血清中的sFas濃度在成人血清中，sFas濃度范圍為4 792～17 150pg/ml。母體血清樣品中的sFas 濃度應(yīng)包含在這些值中。在臍動脈血中，所有樣品測量值較低，相反在臍靜脈血中，16.2%的結(jié)果在正常范圍內(nèi)，其余83.8%的結(jié)果低于正常范圍。這意味著該分子在胎兒體內(nèi)濃度低于成人體內(nèi)中的正常濃度。

2.2 臍動、靜脈血清與母體血清中sFas濃度對比sFas濃度在臍靜脈和臍動脈血中平均濃度分別為（3 250.77±9.01）pg/ml，（3 352.24±7.07）pg/ml，與 母體血中平均濃度（5 767.89±8.47）pg/ml 相比，標(biāo)準(zhǔn)差依次為671.49±2.17，1 168.24±5.11，455.48± 1.02（P＜0.05），相應(yīng)的sFas 濃度低于母體血液，差異顯著，而臍動脈血清和臍靜脈血清之間的sFas 濃度無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 三種血清中的Fasl濃度在成人血清中，F(xiàn)asl濃度為39.8～145pg/ml。母體血液樣本中的Fasl 濃度在許多情況下與預(yù)期值不同，7.7%的血管血清中Fasl 濃度低于正常范圍，但有61.6%的結(jié)果更高，其余30.7%是在正常濃度范圍內(nèi)。測量表明23.1%的臍動脈和臍靜脈血清呈正常濃度范圍，69.2%的結(jié)果高于此標(biāo)準(zhǔn)，7.7%的Fasl 濃度較低。

2.4 臍動脈和臍靜脈血清中Fasl濃度與母體血清中Fasl 濃度的結(jié)果對比 使用方差分析ANOVA 估計母體和臍帶血中Fasl 濃度的顯著性，P=0.005，差異顯著。通過非參數(shù)U Mann-Whitney 測試測量母體血清中的Fasl 并與臍靜脈血清相比，在平均濃度之間發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），臍靜脈血清呈現(xiàn)出比母體血清中更高的Fasl 濃度。Mann-Whitney U檢驗顯示母體血清中Fasl 配體的平均濃度（70.08± 2.21）pg/ml 與臍動脈血清（165.45±4.32）pg/ml 之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），臍動脈血清顯示比母體血清中更高濃度的Fasl。臍動脈血清的Fasl 濃度與臍靜脈血清Fasl 濃度（170.04±5.36）pg/ml，比較差異無顯著性意義（P＞0.05），臍靜脈血清，臍動脈血清和母體血清的標(biāo)準(zhǔn)差依次為55.78±1.30，53.46± 2.01，14.98±4.30。

3 討論

從母體血清中獲得的sFas 濃度的分析顯示，所有結(jié)果均與正常人的標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)，沒有發(fā)現(xiàn)比 6 851pg/ml 更高的結(jié)果，并且孕婦中sFas 濃度的預(yù)期值遠(yuǎn)低于最高正常濃度。將此結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行比較，則它的濃度值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康的非妊娠婦女和懷孕3個月的孕婦[12，13]。該觀察結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果一致，表明sFas 有抑制細(xì)胞凋亡的作 用[9，13]，也可以預(yù)期在胎盤中細(xì)胞凋亡的強度會降低。sFas 和Fasl的濃度水平在妊娠中期的羊水中進(jìn)行觀測，發(fā)現(xiàn)小于胎齡（SGA），大于胎齡（LGA）和適合胎齡（AGA）妊娠之間sFas和Fasl液體濃度沒有差異[14]，這可能表明sFas和Fasl對胎兒體重沒有依賴性。Ashton[10]提出sFas 與Fasl 在滋養(yǎng)細(xì)胞，螺旋動脈重塑和胎盤發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)臍帶血中的細(xì)胞凋亡參數(shù)高于母體血液，胎兒機體細(xì)胞增殖的過程比胎兒的細(xì)胞凋亡過程具有更高的水平，但在妊娠38～41周，細(xì)胞增殖的過程中很低?？梢哉J(rèn)為這是由于細(xì)胞肥大的過程而發(fā)生的，并且可能所有新發(fā)細(xì)胞都是不必要的并且被破壞的。細(xì)胞凋亡的增加可能由胎盤異常引起，并且可以觀察到對胎兒生長受限的影響。在這個研究中，只有AGA 胎兒，因此可以預(yù)期母體血液中的細(xì)胞凋亡過程不會增加[15]。

有研究發(fā)現(xiàn)母體血液與臍帶動脈和靜脈血液之間的sFas 濃度存在統(tǒng)計學(xué)差異，在母體血液中它有更高的濃度，可能是在胎盤保護(hù)中起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的保護(hù)機制。而其他研究顯示出不同的結(jié)果，較高的血液血糖在分娩時測量的濃度比正常孕婦高[16]?？梢哉J(rèn)為這種差異可能是由自然分娩或剖宮產(chǎn)分娩方式所引起的。來自臍帶的動脈和靜脈血中sFas 濃度之間沒有差異。沒有關(guān)于sFas的動脈與靜脈比較的其他可用數(shù)據(jù)，但胎兒的血液循環(huán)不能證明絨毛與母體血液接觸的變化[10，14，15]。

如果比較血清中的Fasl 配體濃度，則可以看到不同的結(jié)果。本研究中，比較了母體和臍帶血血清中Fasl 配體的濃度，發(fā)現(xiàn)母體血清與臍帶血清之間存在差異。在母體血液中觀察到更高水平的Fasl，但臍帶靜脈和動脈血液之間沒有差異。有研究發(fā)現(xiàn)過嚴(yán)重與非常嚴(yán)重的SGA 胎兒羊水中Fasl 濃度增加，胎兒和胎盤細(xì)胞凋亡增加[14]。這一結(jié)果可以解釋在無并發(fā)癥的妊娠中臍帶血中Fasl 濃度的降低可以抑制胎兒的細(xì)胞凋亡。Randhawa 等[16]觀察的臍血清Fasl 水平顯著高于母體血清，但卻沒有關(guān)于這個結(jié)果的原因分析。sFas 與Fasl 介入的細(xì)胞凋亡失調(diào)的后果與自身反應(yīng)性以及免疫功能障礙和惡性轉(zhuǎn)化以及胎盤功能障礙有關(guān)[17]。在先兆子癇妊娠中測量母體平均血清sFas和Fasl水平，并與健康孕婦進(jìn)行比較，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異[16，18，19]。從臨床角度來看，母體血液Fasl的測量不能表明胎兒生物體細(xì)胞凋亡過程的加劇，但是對母體測量結(jié)果與胎兒血液中Fasl 濃度的比例可能有助于建立仍然不確定的因果關(guān)系。所有由不同作者提供的數(shù)據(jù)均以小組形式獲得，需要進(jìn)一步研究以評估健康妊娠和SGA 或先兆子癇患者Fasl的正常測量參數(shù)濃度[19]。

本研究中臍動脈和臍靜脈血液中sFas 和Fasl濃度的無顯著差異，表明胎兒生物體對sFas 和Fasl產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡沒有影響。胎兒血液中sFas 濃度降低可能意味著胎兒體內(nèi)細(xì)胞凋亡的增加。臍帶血中Fasl 濃度高于母體，表明胎兒循環(huán)中細(xì)胞凋亡增強，胎盤血流對其濃度沒有影響。進(jìn)一步確定在生理與病理情況下妊娠早期、中期和孕晚期的sFas和Fasl 水平均處于正常范圍。