顛茄生物堿代謝過程中關(guān)鍵酶的研究概況

劉佳，肖倩

（西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710000）

顛茄的俗名叫野山茄或者顛茄草，是一種茄科顛茄屬多年生草本植物。全株高1～2 m，根為直徑1 cm左右的圓柱形，表面有淺灰縱向皺紋。顛茄全植株均可作為藥用成分入藥，主要部分葉和根含有托品烷類生物堿莨菪堿及東莨菪堿，可制成配劑和浸膏入藥，但是其在整個植株中的分布并不均勻，野生顛茄植株中托品烷類生物堿含量較低。大量研究表明[1-2]，顛茄的根和莖中，除了含有托品烷類生物堿，也含有少量的紅古豆堿、阿托胺、顛茄寧等有效成分。

在顛茄的次生代謝產(chǎn)物托品烷類生物堿中，最主要的是東莨菪堿與莨菪堿。在臨床治療中，相比與莨菪堿，東莨菪堿對機(jī)體的副作用要更小，且藥理作用更強(qiáng)。其抑制中樞神經(jīng)的同時可以阻滯副交感神經(jīng)，所以在臨床上主要用于麻醉、戒毒脫癮、鎮(zhèn)痛、帕金森癥及抗暈動癥等，市場對其的需求量非常大。但在顛茄中，東莨菪堿的含量要比莨菪堿的含量低很多，而在市場上，東莨菪堿的藥用價值要比莨菪堿的價值高很多，這就導(dǎo)致了在臨床上東莨菪堿的價值高很多。因此，提高顛茄中東莨菪堿的含量，使其充分發(fā)揮經(jīng)濟(jì)價值，是亟需解決的問題。

1 顛茄次生代謝產(chǎn)物的研究概況

植物通過次生代謝途徑產(chǎn)生的物質(zhì)稱為次生代謝產(chǎn)物。在長期進(jìn)化的過程中，初生代謝產(chǎn)物（蛋白質(zhì)、糖類等）與外界的生物或非生物通過不同代謝途徑相互作用而產(chǎn)生的物質(zhì)。在外界特定的條件下，一些重要的初級代謝產(chǎn)物（丙二酸單酰輔酶A、乙酰輔酶A、莽草酸或者一些氨基酸）作為次生代謝合成的原料，又或者再次經(jīng)歷不同的代謝過程，產(chǎn)生一些像黃酮、萜類、生物堿等化合物，我們把這種化合物成為天然產(chǎn)物，又因?yàn)檫@些天然產(chǎn)物是通過次生代謝途徑產(chǎn)生的，所以又稱為次生代謝產(chǎn)物。一般次生代謝產(chǎn)物在植物生長及發(fā)育的過程中并沒有關(guān)鍵的作用，但是近年來有研究不斷發(fā)現(xiàn)，在生長旺盛的細(xì)胞中，大多數(shù)都有次生代謝途徑產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的合成，而對這些次生代謝產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)對人體有著很強(qiáng)的活性，使其具有特殊的醫(yī)用價值。

2 顛茄次生代謝產(chǎn)物合成的主要途徑

顛茄的次級代謝產(chǎn)物托品烷類生物堿的合成主要以初級代謝產(chǎn)物鳥氨酸及精氨酸作為合成底物。（1）鳥氨酸與精氨酸分別在其脫羧酶的作用下生成腐胺與N-氨基甲酰腐胺，N-氨基甲酰腐胺在其水解酶的作用下生成腐胺。腐胺在N-甲基-腐胺轉(zhuǎn)移酶（PMT）的作用下甲基化，生成N-甲基-腐胺，PMT將腐胺轉(zhuǎn)向多胺，進(jìn)入到托品烷類生物堿合成的途徑。因此PMT是托品烷類生物堿合成過程中的第一個關(guān)鍵酶。（2）由腐胺催化生成的N-甲基-腐胺在二胺氧化酶的催化作用下脫氨生成4-氨基-正丁醛，該物質(zhì)能自發(fā)環(huán)化生成1-甲基-Δ-吡咯啉陽離子的陽離子，其可與初級代謝產(chǎn)物丙酮酸縮合形成古豆堿，也可以與煙酸縮合生成尼古丁。在合成托品烷類生物堿的過程中，1-甲基-Δ-吡咯啉陽離子經(jīng)過一系列反應(yīng)生成托品酮。（3）兩種不同的托品酮還原酶（TRs）將托品酮催化，使托品烷類生物堿的代謝分流：托品酮還原酶Ⅱ（TRⅡ）將托品酮催化生成假托品堿，進(jìn)一步生成打碗花精A3；另一條途徑是托品酮還原酶Ⅰ（TRⅠ），催化托品酮生成托品醇，其與苯乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)生成海螺堿（莨菪堿的前體）。（4）細(xì)胞色素P-450氧化酶使海螺堿分子重排，從而形成莨菪堿。綜合以上反應(yīng)，TRⅠ是莨菪堿合成的另一個關(guān)鍵酶。（5）莨菪堿在莨菪堿6β-羥化酶（H6H）的作用下羥基化生成山莨菪堿，山莨菪堿緊接著環(huán)化，最終生成另一種托品烷類生物堿東莨菪堿。因此，H6H催化的反應(yīng)也是東莨菪堿合成的最后一個限速步驟，而H6H也成為托品烷類生物堿合成的最后一個關(guān)鍵酶。

3 顛茄次生代謝工程中重要基因的研究概況

托品烷類生物堿合成的分子生物學(xué)研究，已在過去幾十年中取得了巨大成果，顛茄、莨菪、曼陀羅及三分三等茄科植物中均存在著托品烷類生物堿的生物合成途徑。要開展代謝工程的研究，主要將這條代謝途徑中重要功能基因進(jìn)行克隆并鑒定其功能。已有不少研究利用PMT、TRs和H6H等基因遺傳改造不同產(chǎn)托品烷類生物堿藥用植物，并取得了顯著的研究成果[3]。H6H基因被Kanegae等[4]研究者從莨菪的cDNA文庫中克隆到，同時發(fā)現(xiàn)其在柱鞘中特異性富集。有研究人員將H6H在曼陀羅中過量表達(dá)，與對照相比，東莨菪堿的含量提高了3倍多。Jouhikaninen等[5]研究者將HnH6H基因?qū)胼馆兄?，誘發(fā)出莨菪的轉(zhuǎn)基因毛狀根，并測定其中東莨菪堿的含量，發(fā)現(xiàn)與對照相比，其東莨菪堿的含量提高了100倍。將H6H基因過量表達(dá)在印度顛茄毛狀根中，發(fā)現(xiàn)毛狀根中東莨菪堿的含量最高達(dá)到了5.6 mg/g FW，是對照的9倍，測定轉(zhuǎn)基因毛狀根中H6H基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)量越高，東莨菪堿的含量也越高。Hibi等[6]研究人員在研究曼陀羅的根時，克隆了PMT基因，同時證明了托品烷類生物堿合成途徑中PMT酶是第一個關(guān)鍵酶。Sato等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PMT基因的高效表達(dá)不但能保證植物的正常生長，還會阻止轉(zhuǎn)基因植物的異常生長，這些對于轉(zhuǎn)基因植物中托品烷類生物堿的積累有很好的促進(jìn)作用。

對顛茄進(jìn)行多基因轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，將托品烷類生物堿代謝途徑中的3個關(guān)鍵酶基因（PMT、TRI、H6H）雙雙轉(zhuǎn)入顛茄中，PMT、TRI兩個基因的組合使顛茄轉(zhuǎn)基因毛狀根中托品烷類生物堿的總含量較空白毛狀根提高2.5倍，其中東莨菪堿含量達(dá)到了空白毛狀根中的5倍多，而莨菪堿的含量比空白毛狀根中提高了2倍。在PMT、H6H兩種基因的組合中，與空白毛狀根相比，轉(zhuǎn)PMT-H6H雙基因毛狀根中托品烷類生物堿的含量提高到2.7倍，其中東莨菪堿與莨菪堿的含量較空白毛狀根相比，分別提高了8.2倍與1.8倍。TRI、H6H兩種基因的組合中，與空白毛狀根相比，托品烷類生物堿的含量提高至2.6倍，其中東莨菪堿與莨菪堿的含量較空白毛狀根相比分別提高了5.6倍與2.1倍。綜上研究發(fā)現(xiàn)，東莨菪堿和莨菪堿的含量均因PMT、TRI、H6H三種基因的超量表達(dá)而有所提高。

4 pmt的研究概況

在托品烷類生物堿代謝的途徑中，PMT是一種甲硫氨酸依賴性的甲基轉(zhuǎn)移酶，其可以將腐胺甲基化生成S-腺苷高半胱氨酸和氮-甲基-1,4-丁二胺。研究者[8]相繼已經(jīng)從曼陀羅、三分三、顛茄、莨菪及煙草中克隆出PMT基因。PMT在茄科植物中是由基因家族中的兩種基因（PMT1和PMT2）編輯的，PMT1、PMT2兩個基因的表達(dá)在時空特異性及編碼區(qū)序列上均具有一定差異。在顛茄的基因組中，AbPMT1的編碼區(qū)是一段長度為1 011 bp的序列，可編碼336個氨基酸，而AbPMT2編碼區(qū)是一段長度為1 023 bp的序列，能夠編碼340個氨基酸，將這兩種基因轉(zhuǎn)入顛茄毛狀根中發(fā)現(xiàn)，AbPMT2基因在顛茄毛狀根中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高于AbPMT1基因的表達(dá)量。三分三與顛茄一樣，均具有兩個PMT基因（AaPMT1和AaPMT2）。研究發(fā)現(xiàn)，在三分三的根、葉和莖中，均有AaPMT1和AaPMT2這兩種基因的表達(dá)，且AaPMT2基因在各組織中表達(dá)量低于AaPMT1基因。AaPMT1與 AaPMT2分別為長度 1 017 bp、1 041 bp的基因序列，分別能夠編碼出338個、347個氨基酸。同時，將誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯（MeJA）添加到毛狀根中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子的添加能顯著地提高AaPMT1的表達(dá)。

將PMT基因轉(zhuǎn)到不同具有相同托品烷類生物堿次生代謝途徑的植物中（顛茄、三分三、煙草、黑莨菪和澳洲毒茄）發(fā)現(xiàn)[9]，將煙草的PMT基因轉(zhuǎn)入顛茄和澳洲毒茄中使其過量表達(dá)，與對照相比，東莨菪堿與莨菪堿的含量均不存在顯著性差異。有研究發(fā)現(xiàn)，將煙草的PMT基因轉(zhuǎn)入到顛茄中，使其在顛茄中過量表達(dá)，結(jié)果表明，PMT酶的活性與對照相比提高了5倍，但是由其可以催化生成的東崀菪堿和莨菪堿的含量并沒有提高，說明了在顛茄中，外源物種的PMT基因過量表達(dá)并不能促進(jìn)此生代謝產(chǎn)物托品烷類生物堿的合成。但將PMT基因轉(zhuǎn)入到轉(zhuǎn)基因黑莨菪毛狀根中，使其在毛狀根中過量表達(dá)，莨菪堿的含量與對照相比提高了5倍。同樣，將煙草PMT基因在白花曼陀羅毛狀根中過量表達(dá)，托品烷類生物堿的含量與對照相比都有較大的提高。綜上研究可以猜測，PMT是白花曼陀羅和黑莨菪在合成托品烷類生物堿途徑中的限速酶，但不是顛茄次生代謝產(chǎn)TAs合成途徑中的限速酶。

5 結(jié)語

綜上所述，提高次生代謝產(chǎn)物合成途徑中的限速酶的表達(dá)量，可以在一定程度上提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。關(guān)鍵酶是托品烷類生物堿代謝工程的一個遺傳改造的靶點(diǎn)，對托品烷類生物堿含量的提高具有明顯的效果，同時可為后人利用基因工程技術(shù)獲取高產(chǎn)托品烷類生物堿提供參考，解決托品烷類生物堿含量低的上問題。