即食食品中單增李斯特氏菌快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

尤禎丹,陳傳君,蔣玉涵,蒲春如,蔣 艷,杜娟蘭,張白玉,嚴(yán)立恒,顏其貴,韓國(guó)全,*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014; 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品加工與安全研究所,四川雅安 625014; 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川成都 611130)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一種人畜共患病原菌,感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多,也可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)、胎死宮內(nèi)、新生兒死亡等[1-3]。該菌廣泛存在于自然界中,對(duì)環(huán)境條件要求不高,是即食食品(Ready-to-eat,RTE)中威脅人類健康的主要病原菌之一[4]。因此,在食品微生物檢驗(yàn)中必須加以重視。

即食食品由于其產(chǎn)品特性,該類食品很容易因?yàn)榻徊嫖廴镜纫蛩貙?dǎo)致食源性病原菌的侵入。Iannetti等[5]收集了意大利不同類型的RTE產(chǎn)品,對(duì)2696個(gè)樣本進(jìn)行綜合調(diào)查,包括軟、半軟干酪和熟肉制品,結(jié)果熟肉制品在實(shí)驗(yàn)室樣品到達(dá)時(shí)污染率為1.66%,貨架期結(jié)束時(shí)污染率為1.92%;干酪到達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)污染率為2.13%,貨架期結(jié)束時(shí)為1.01%。Mehmeti等[6]檢測(cè)了科索沃的產(chǎn)散裝奶的牧場(chǎng),從10個(gè)不同地區(qū)分布的221個(gè)農(nóng)場(chǎng)共采集了603個(gè)儲(chǔ)奶罐樣本進(jìn)行牛奶質(zhì)量評(píng)估,單增李斯特菌污染率為2.7%,且所有檢測(cè)出的菌株中毒力基因prfA、actA和hlyA均為陽(yáng)性。近年來(lái)研究人員調(diào)查結(jié)果表明該菌在我國(guó)RTE食品中污染率在1%～10%,其中熟肉制品和涼拌菜污染率較高[7-11]。

與其他國(guó)家進(jìn)行的調(diào)查相比,我國(guó)RTE食品中單增李斯特氏菌的流行率普遍相當(dāng)。由于單增李斯特氏菌的危害性較大,對(duì)其有效且快速的檢測(cè)至關(guān)重要,本文對(duì)近期研究出來(lái)的檢測(cè)方法(分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、生物傳感檢測(cè)技術(shù)、光譜學(xué)檢測(cè)技術(shù)等)進(jìn)行闡述,為相關(guān)工作者后期開(kāi)發(fā)更高效、快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)方法提供新方向。

1 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

1.1 結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增是在等溫條件下擴(kuò)增靶核酸的方法,是一種快速、特異和敏感的方法,不需要昂貴的儀器,因此適用于資源不足的情況下的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Yan等[12]直接使用細(xì)菌培養(yǎng)物或菌落作為模板,在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)之前沒(méi)有任何DNA提取和純化,針對(duì)毒力基因hlyA設(shè)計(jì)引物,包括正向和反向內(nèi)部引物、外部引物和環(huán)狀引物,反應(yīng)過(guò)程和結(jié)果觀察在內(nèi)的總檢測(cè)時(shí)間約為60 min,結(jié)果可視便于觀察。

如今產(chǎn)物檢測(cè)方式從電泳判定、濁度儀判定、目視濁度等方法向與傳感器結(jié)合判定改變,結(jié)果可更加準(zhǔn)確、直觀。李秀梅等[13]針對(duì)hlyA基因設(shè)計(jì)了4條特異性引物和1條異硫氰酸熒光素標(biāo)記的探針,與橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)(Lateral flow dipstick,LFD)聯(lián)合應(yīng)用,對(duì)反應(yīng)引物進(jìn)行熒光標(biāo)記,反應(yīng)產(chǎn)物在橫向流動(dòng)試紙條上完成顯色和結(jié)果判讀,該方法完成檢測(cè)全過(guò)程僅需80 min,對(duì)純細(xì)菌培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度為3.6 CFU/mL。黃夢(mèng)琪等[14]構(gòu)建了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的紙基顯色傳感器用于可視化致病菌的檢測(cè)平臺(tái),將酶切后的單鏈產(chǎn)物不經(jīng)過(guò)預(yù)變性雜交,直接進(jìn)行試紙條檢測(cè),在優(yōu)化條件下檢出限為100 pg/μL,整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程可在幾小時(shí)內(nèi)完成。Wachiralurpan等[15]建立了新的LAMP-LFD方法,在90 min內(nèi)得到結(jié)果,使用純化的基因組DNA或來(lái)自純培養(yǎng)物的細(xì)胞的測(cè)定的檢測(cè)限分別為800 fg和2.82 CFU/mL,特異性試驗(yàn)表明該方法與四種李斯特氏菌及12種非李斯特菌屬無(wú)交叉反應(yīng)。Gao等[16]研究了一種重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification,RPA)結(jié)合LFD,優(yōu)化了引物和探針,檢測(cè)時(shí)特異性高,整個(gè)分析從樣品預(yù)處理到最終結(jié)果大約30 min。Wang等[17]使用多重交叉位移擴(kuò)增(Multiple cross-displacement amplification,MCDA)標(biāo)記金納米粒子結(jié)合LFD,整個(gè)過(guò)程在1 h內(nèi)完成,由于無(wú)需電泳、特殊試劑和檢測(cè)儀器,溫度控制在60～67 ℃即可,檢測(cè)結(jié)果可以通過(guò)肉眼直接觀察到,十分便捷。

1.2 結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

有學(xué)者從提高細(xì)菌富集效率著手,采用不同納米顆粒進(jìn)行富集,可不同程度縮短檢測(cè)時(shí)間。該方法反應(yīng)時(shí)間較短,結(jié)果較為準(zhǔn)確,靈敏度高,可同時(shí)檢測(cè)多種病原菌,但是反應(yīng)結(jié)束后還需與其他技術(shù)相結(jié)合來(lái)觀測(cè)結(jié)果。Meng等[18]將萬(wàn)古霉素(Vancomycin,Van)固定在聚乙二醇納米顆粒的表面可提高低濃度靶細(xì)菌的富集效率,而后與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)結(jié)合檢測(cè),該方法的檢出限為30 CFU/mL或g,總體測(cè)定時(shí)間不到4 h。Yang等[19]使用多價(jià)刷狀磁性納米探針對(duì)病原菌進(jìn)行富集,該探針以聚L-賴氨酸、修飾胺基、萬(wàn)古霉素為骨架,可在2 min內(nèi)產(chǎn)生高濃縮效率(>94%),結(jié)合PCR-電化學(xué)發(fā)光分析,該方法下可以在低至10 CFU/mL的水平下快速準(zhǔn)確檢測(cè)。

還有可以從特異性引物入手,結(jié)合不同種PCR技術(shù)同時(shí)對(duì)多種病原菌進(jìn)行檢測(cè)。Phraephaisarn等[20]提出基于編碼兩種假設(shè)蛋白的基因設(shè)計(jì)的特異性引物BE-Lis,與PCR擴(kuò)增結(jié)合用于所有李斯特氏菌屬物種的早期檢測(cè)。Wang等[21]研究出基于金納米粒子的常規(guī)寡核苷酸微陣列分析結(jié)合了金納米粒子的多重寡核苷酸連接-PCR和銀增強(qiáng)檢測(cè)技術(shù),該檢測(cè)方法可以明確區(qū)分單一或多重感染八種病原菌,純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度為3.3～85 CFU/mL。Tao等[22]基于新型靶基因的多重PCR檢測(cè)能夠快速檢測(cè)李斯特氏菌屬,該方法的總檢測(cè)時(shí)間短至16 h。Ding等[23]研究開(kāi)發(fā)了新型多重實(shí)時(shí)PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)技術(shù),在DNA提取和培養(yǎng)之前添加了富集步驟,相比于傳統(tǒng)qPCR可降低檢測(cè)限和檢測(cè)時(shí)間,檢測(cè)限為14 CFU/25 mL。Feng等[24]研發(fā)了新型雙過(guò)濾基單疊氮丙啶(PMA)-多重PCR檢測(cè)方法,該檢測(cè)方法和濾膜法結(jié)合提高了LM的檢測(cè)成功率,檢測(cè)時(shí)間大約在6h左右。Witte等[25]評(píng)估了微滴式數(shù)字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)的實(shí)際應(yīng)用,使用ddPCR從純的細(xì)菌培養(yǎng)物,人工污染的奶酪和天然污染的食物定量LM在相對(duì)寬的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的結(jié)果是可靠的。Cremonesi等[26]用ddPCR系統(tǒng)的性能與qPCR平行測(cè)試進(jìn)行比較,它靈敏度更高,在食品基質(zhì)中對(duì)于李斯特氏菌屬物種測(cè)定為102CFU/g,檢測(cè)時(shí)不需要預(yù)擴(kuò)增步驟,并且比qPCR顯示更高的精確度、靈敏度和可重復(fù)性,但是更加昂貴。Zeng等[27]用生物染料如單疊氮乙錠和PMA在DNA提取前對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,與qPCR相結(jié)合,結(jié)果表明PMA-qPCR可用于定量測(cè)定LM的活細(xì)胞,其中死細(xì)胞與活細(xì)胞的比例不超過(guò)104,活細(xì)胞的濃度不低于103CFU/mL。qPCR、ddPCR等新型技術(shù)結(jié)果更加精準(zhǔn),靈敏度更高,檢測(cè)結(jié)果可直接顯示,更加方便快捷,但是儀器昂貴,成本較高。

2 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

除了從病原菌的核酸角度分析之外還從病原菌所特有的蛋白入手,結(jié)合免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)在更傾向于與層析試紙條技術(shù)相結(jié)合,結(jié)果觀測(cè)便捷。Wang等[28]提出了測(cè)定LM的側(cè)流免疫層析試紙條法,制備P60蛋白肽的單克隆抗體(mAb)1C1,并用金納米顆粒(Au Nanoparticles,AuNPs)標(biāo)記,基于AuNP的條帶檢測(cè)可以檢測(cè)8種常見(jiàn)血清型的LM,檢測(cè)限為3.7×106CFU/mL,不與包括李斯特氏菌屬在內(nèi)的其他細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)。Tominaga[29]比較了基于膠體鈀納米顆粒(PdNPs)和AuNPs的橫流式試紙條測(cè)定法(Lateral flow test strip,LFTS)的靈敏度,PdNPs-辣根過(guò)氧化物結(jié)合LFTS法檢測(cè)LM的靈敏度是基于AuNPs-LFTS測(cè)定法的5～10倍。

還可以試開(kāi)發(fā)新型抗體,再結(jié)合不同種檢測(cè)技術(shù)來(lái)進(jìn)行試驗(yàn),一般檢測(cè)結(jié)果可直接觀察,成本較低,十分便捷。Morlay等[30]開(kāi)發(fā)了一種新型抗體來(lái)聚集金和磁性納米顆粒,再通過(guò)表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface enhanced raman scattering,SERS)檢測(cè)病原體,這種方法盡管需要在每次運(yùn)行中添加納米顆粒,但在富集步驟成功地檢測(cè)了污染樣品,縮短了操作時(shí)間,檢測(cè)時(shí)間在25 h以內(nèi),同時(shí)對(duì)于任何革蘭氏陽(yáng)性菌株或食物背景天然菌群沒(méi)有觀察到交叉反應(yīng)。Liu等[31]開(kāi)發(fā)了用于檢測(cè)LM夾心型的酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法,檢測(cè)的靈敏度為6.5 lg CFU/mL,可用作巴氏殺菌乳中該菌的快速檢測(cè)。林婷婷等[32]將該菌的單克隆抗體與磁性納米材料進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)構(gòu)建磁性納米探針,建立雙抗夾心模式的檢測(cè)試紙條,通過(guò)在層析體系中分別添加表面活性劑、鹽離子、雜蛋白和糖類,探討了其對(duì)層析的影響,減弱食品背景影響,提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。張賽等[33]以抗單增李斯特菌單克隆抗體偶聯(lián)磁珠制備免疫磁珠,示蹤物為熒光膠乳微球,再利用免疫熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào),熒光免疫層析試紙條對(duì)純培養(yǎng)物的檢測(cè)限為4×105CFU/mL,人工污染樣品檢測(cè)限為1×104CFU/mL,試驗(yàn)中未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。崔煥忠等[34]制備該菌的特異性單克隆抗體,研制膠體金試紙,對(duì)純培養(yǎng)物檢測(cè)的靈敏度為3.9×105CFU/mL。

3 生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

生物傳感器是一種將生物活性信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的裝置,主要有準(zhǔn)確度高、分析速度快等特點(diǎn),但是有時(shí)需自行設(shè)計(jì)大型儀器,難度較大。Wang等[35]結(jié)合了免疫磁珠分離、尿素酶催化和電化學(xué)阻抗分析,設(shè)計(jì)了一種新的等效電路模擬生物傳感器,該抗生物傳感器在3 h內(nèi)可檢測(cè)到低至1.6×103CFU/mL的LM,適用于食源性病原菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Sharma等[36]使用基于磁性隧道結(jié)的高度靈敏的生物傳感平臺(tái)檢測(cè)來(lái)自致病細(xì)菌的DNA,檢測(cè)LM的DNA靈敏度低于nmol/L范圍,具有很高的選擇性和特異性。Zhang等[37]建立了基于納米探針的生物傳感器,用Fe3O4納米粒子簇修飾的適配體作為信號(hào)放大納米探針,特異性識(shí)別該菌的細(xì)胞壁,與單獨(dú)的Fe3O4納米顆粒相比,粒子簇對(duì)顯色底物的顯色反應(yīng)表現(xiàn)出集體效應(yīng)增強(qiáng)的催化活性,吸光度或顏色的變化可以代表目標(biāo)的濃度,方法可在5.4×103～108CFU/mL的線性范圍內(nèi)直接測(cè)定。劉紅平等[38]基于SnO2納米粒子制備了LM特異檢測(cè)半導(dǎo)體氣體傳感器,響應(yīng)和恢復(fù)時(shí)間分別在11、16s以內(nèi),初始接種量約為10 CFU/mL的LM在牛奶中培養(yǎng)12 h后也能被檢測(cè)出。Alhogail等[39]利用磁性納米粒子開(kāi)發(fā)了新型LM的比色紙基生物傳感器,利用該菌產(chǎn)生的蛋白酶作為檢測(cè)致病菌的生物標(biāo)志物,檢測(cè)限在30 s內(nèi)為2.1×102CFU/mL,已經(jīng)測(cè)試了傳感器的特異性,效果較為理想。

4 光譜學(xué)檢測(cè)技術(shù)

光學(xué)檢測(cè)方法一般無(wú)需特別復(fù)雜的前處理,即可檢測(cè)到其分布狀態(tài),該類檢測(cè)方法一般有重復(fù)性較高、信號(hào)精度高等特點(diǎn)?；谡駝?dòng)光譜的檢測(cè)技術(shù),表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)光譜技術(shù)被認(rèn)為是一種快速、可靠、高度敏感的細(xì)菌檢測(cè)工具。Liu等[40]開(kāi)發(fā)了一種SERS-LFD技術(shù),再結(jié)合RPA檢測(cè)LM,檢測(cè)限為19 CFU/mL。Witkowska等[41]將SERS與主成分分析結(jié)合來(lái)檢測(cè)和鑒定LM,檢測(cè)和鑒定的整個(gè)過(guò)程(根據(jù)路徑I)需要7 d;另外兩條路徑,檢測(cè)過(guò)程分別簡(jiǎn)化為2和3 d,雖然只有48 h,但只有98%的準(zhǔn)確性。Donoso等[42]開(kāi)發(fā)了一種新型的納米雜化化合物用于光學(xué)檢測(cè)LM,可以觀察到活性LM的熒光顯微鏡檢測(cè)濃度為5.19×103CFU/mL,納米雜合體對(duì)于該菌也是特異性的。Lu等[43]提出了一種新型便攜式高度自動(dòng)化的熒光檢測(cè)儀器,該系統(tǒng)是由商用現(xiàn)成的光學(xué)元件構(gòu)成的,用于收集光信號(hào)而自行設(shè)計(jì)的機(jī)械單元?jiǎng)t作為驅(qū)動(dòng)硬件的電源,該系統(tǒng)利用發(fā)光二極管激發(fā)熒光標(biāo)記,光譜儀記錄來(lái)自樣品的熒光信號(hào),能夠在每次檢測(cè)中最多自動(dòng)測(cè)量十個(gè)樣品,檢測(cè)限在102～103CFU/mL。此類方法精度高,重復(fù)性好,但是所需檢測(cè)儀器價(jià)格較貴,每次檢測(cè)數(shù)量普遍有限。

5 其他檢測(cè)技術(shù)

除了基于核酸檢測(cè)、特有蛋白檢測(cè)之外,還可以與色譜、核磁等多項(xiàng)技術(shù)技術(shù)相結(jié)合對(duì)LM進(jìn)行檢測(cè)。Sun等[44]開(kāi)發(fā)了一種基于多重PCR與高效液相色譜法結(jié)合檢測(cè)方法,用于高通量篩查食源性病原菌,對(duì)于純培養(yǎng)物檢測(cè)限為約10 CFU/mL,在污染的食品基質(zhì)中少于102CFU/g,雖然需要昂貴的設(shè)備,但能在1 h內(nèi)完成約400個(gè)PCR樣品的信號(hào)檢測(cè)且成本不超過(guò)10元。陶珊珊[45]偶聯(lián)上LM的氧化錳納米粒子能夠特異性識(shí)別LM,并結(jié)合核磁共振技術(shù),該方法檢測(cè)的線性范圍為10～103CFU/mL。范龍興等[46]將磁分離技術(shù)、免疫分析技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合,整個(gè)試驗(yàn)在37 ℃條件下進(jìn)行,3～4 h即可完成檢測(cè),試驗(yàn)操作較為簡(jiǎn)便,檢測(cè)限可達(dá)10 CFU/mL,交叉反應(yīng)率極低。Zhao等[47]基于LM與抗體修飾納米顆粒之間特異性結(jié)合所誘導(dǎo)的生物功能化磁性納米顆粒的聚集,結(jié)合核磁共振技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種可靠的檢測(cè)方法,官能化的Fe/Fe3O4納米顆粒對(duì)其他干擾性細(xì)菌的存在具有高特異性,該方法的檢測(cè)下限為3 MPN,檢測(cè)上限為103CFU/mL,但是這種方法不適合檢測(cè)可能含有LM的基質(zhì)高于103CFU/mL,整個(gè)檢測(cè)時(shí)間在40 min內(nèi)完成,總成本低于250元/樣。一些正在開(kāi)發(fā)的生物傳感器或納米傳感器技術(shù)可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成病原菌的快速檢測(cè),這是一個(gè)新興的研發(fā)領(lǐng)域,快速、準(zhǔn)確、便攜也是未來(lái)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向[48-50]。

6 結(jié)論

如今RTE種類越來(lái)越豐富,人們需求量也逐漸增大,因此為保證食品安全,研究人員對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)顯得尤為重要。已有學(xué)者研發(fā)出不同的檢測(cè)技術(shù),有的將幾種技術(shù)相結(jié)合來(lái)提高效率,有利于控制病原菌的傳播與污染。新興的生物識(shí)別轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)提供了開(kāi)發(fā)小型、快速、無(wú)線傳感器的新思路,可用于增加病原菌監(jiān)測(cè)的分辨率來(lái)確保食品的安全性,期待這些技術(shù)的應(yīng)用日趨成熟,以滿足監(jiān)管機(jī)構(gòu)和消費(fèi)者對(duì)食品質(zhì)量與安全的要求。