基因組編輯技術(shù)及其在癌癥相關(guān)基因的功能性篩選中的應(yīng)用

李雪柔

(南京市第二十九中學(xué) 江蘇南京 210036)

基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)一直是研究者致力于開發(fā)的重要技術(shù)，對于遺傳育種、定向增強(qiáng)經(jīng)濟(jì)作物的經(jīng)濟(jì)價值、治療遺傳病等等具有重要的意義。但是早期的技術(shù)依賴于同源重組，效率很低、特異性差，使得其應(yīng)用受到很大的限制。人工核酸酶的出現(xiàn)極大地提高了基因組編輯的效率，人工核酸酶經(jīng)歷了兩代技術(shù)分別是鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物樣核酸酶，其靶向DNA的特異性是由蛋白質(zhì)與DNA堿基的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。但是在應(yīng)用人工核酸酶時，需要根據(jù)DNA靶位點(diǎn)的序列構(gòu)建可以編碼產(chǎn)生能與靶位點(diǎn)特異性結(jié)合的鋅指蛋白或者轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物的DNA結(jié)構(gòu)，由于這兩個蛋白氨基酸數(shù)量多且重復(fù)性高，給其編碼序列的構(gòu)建帶來了很大的難度。CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，徹底改變了研究者實(shí)現(xiàn)基因組編輯的方式，憑借其最為突出的易于構(gòu)建的優(yōu)勢迅速成為應(yīng)用最為廣泛的基因組編輯工具并建立了高通量功能性篩選的方法學(xué)。本文綜述了基因組編輯的原理，三種基因組編輯工具，高通量功能性基因組學(xué)方法和在癌癥相關(guān)基因的功能性篩選方面的應(yīng)用。

一、基因組編輯原理

基因組編輯技術(shù)即在基因組水平上對DNA分子的序列進(jìn)行定位與修改，從而達(dá)到定向調(diào)控基因表達(dá)包括基因上調(diào)和下調(diào)、改變遺傳密碼、完全破壞基因的表達(dá)等目標(biāo)。因此，基因組編輯的工具通常由兩個部分組成，即定向模塊和功能性模塊。定向模塊是指在基因組中定位于目標(biāo)編輯的DNA序列的模塊，而功能性模塊則是指在靶位點(diǎn)定位后發(fā)揮基因組編輯的元件?；蚪M編輯發(fā)生的原理是特異性地在基因組位點(diǎn)引入DNA雙鏈斷裂，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)機(jī)制包括同源重組和非同源末端接合，基于此完成包括基因打靶、基因修復(fù)、目的基因定點(diǎn)插入等基因組編輯的目的。綜上，基因組編輯工具包含與基因組特異位點(diǎn)的DNA序列相結(jié)合的元件和在目標(biāo)序列引入DNA雙鏈斷裂的功能性元件[1]。

目前，基因組編輯技術(shù)經(jīng)歷了三代系統(tǒng)，分別是鋅指核酸酶ZFN、轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物樣核酸酶TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)。ZFN和TALEN是依靠蛋白質(zhì)與DNA特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)定位的，目前兩個蛋白的功能結(jié)構(gòu)域已經(jīng)實(shí)現(xiàn)模塊化，兩個蛋白的相似之處在于與DNA堿基的特異性結(jié)合的區(qū)域具有高度的重復(fù)性。而在基因組特定位點(diǎn)引入雙鏈斷裂依靠的是非特異性的核酸酶FokI。之后發(fā)展起來的CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過一段短RNA將Cas9蛋白導(dǎo)向靶位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)DNA雙鏈斷裂，系統(tǒng)的構(gòu)建更加容易。

二、人工核酸酶(ZFN與TALEN)

(一)鋅指核酸酶ZFN

第一代基因組編輯技術(shù)ZFN也叫作鋅指蛋白核酸酶，由鋅指蛋白與具備切割DNA雙鏈的核酸酶融合而成。鋅指蛋白是可以與DNA堿基特異性結(jié)合的蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于蛙類動物的細(xì)胞中，鋅指蛋白的重復(fù)單元可以與DNA堿基特異性結(jié)合，每一個鋅指蛋白可以特異性地識別三聯(lián)體堿基。由于三聯(lián)體堿基有64種不同的組合，因此，根據(jù)不同的DNA靶序列，需要對于不同的DNA堿基三聯(lián)體都有比較高效和特異的鋅指蛋白重復(fù)單元。這正是鋅指核酸酶目前應(yīng)用的一個很大的局限性，即ZFN應(yīng)用的位點(diǎn)普適性。

鋅指蛋白一般由3～4個鋅指結(jié)構(gòu)重復(fù)單元串聯(lián)而成，因此，可以特異性地識別9～12個DNA堿基。目前最為常用的鋅指結(jié)構(gòu)是Cys2His2鋅指，是由大約30個氨基酸包裹著一個鋅原子組成，目前研究者通常根據(jù)DNA靶位點(diǎn)把相應(yīng)的鋅指結(jié)構(gòu)串聯(lián)起來從而識別9個或者12個堿基。與鋅指蛋白融合的可以切割DNA雙鏈的核酸酶是FokI，為了減少FokI的非特異性切割，研究者利用其二聚體才能發(fā)揮作用的特點(diǎn)，將FokI單體與鋅指蛋白串聯(lián)。因此，鋅指蛋白核酸酶需要成對工作，在靶位點(diǎn)附近針對DNA鏈設(shè)計(jì)兩條ZFN，兩條鋅指蛋白之間應(yīng)為FokI留有合適的間隔區(qū)域，通常5～7個堿基為宜，合理的間隔區(qū)域?qū)τ赯FN二聚體的工作至關(guān)重要。通過研究者長期的努力，識別大多數(shù)堿基三聯(lián)體的鋅指蛋白相關(guān)數(shù)據(jù)已經(jīng)形成了公共數(shù)據(jù)庫。針對每一條DNA靶序列，研究者通常可以根據(jù)與密碼子對應(yīng)的關(guān)系對編碼鋅指結(jié)構(gòu)的DNA進(jìn)行模塊化組裝，再導(dǎo)入到目標(biāo)生物。目前，在從低等到高等的很多生物包括斑馬魚、果蠅、小鼠、高等哺乳動物以及植物中，ZFN技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用，對于疾病的基因治療有重要的潛在意義[1]。

(二)轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物TALEN

第二代人工核酸酶技術(shù)為TALEN，即轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物核酸酶，由轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物和FokI融合而成。因此，與ZFN相同的是，TALEN也是成對工作的，只是兩對TALE之間的間隔要求更大，通常是10～15堿基。TALE首次被發(fā)現(xiàn)于一種植物致病細(xì)菌黃單胞桿菌中被發(fā)現(xiàn)，該蛋白正是這種細(xì)菌導(dǎo)致被感染植物發(fā)病的原因。黃單胞桿菌感染植物后，細(xì)菌中的TALE蛋白會被釋放進(jìn)入植物的細(xì)胞中，TALE蛋白會特異性地識別一些植物免疫相關(guān)基因的DNA序列，并憑借TALE蛋白C端的轉(zhuǎn)錄激活因子上調(diào)相應(yīng)基因的表達(dá)，導(dǎo)致被感染植物出現(xiàn)一系列的異常。研究者發(fā)現(xiàn)了TALE蛋白的功能和作用機(jī)制后，逐步揭示了TALE蛋白與DNA特異性結(jié)合的機(jī)理。因此，與鋅指蛋白相同的是TALE也是依靠蛋白質(zhì)和DNA堿基特異性結(jié)合的，不同的是TALE蛋白與DNA的特異性結(jié)合是一對一的模式，即一個重復(fù)單元與一個DNA堿基特異性結(jié)合的。對于A、T、C和G四個堿基都有高效特異性識別的重復(fù)單元，因此根據(jù)DNA靶位點(diǎn)的序列將相應(yīng)的重復(fù)單元串聯(lián)起來，就可以編碼獲得與靶位點(diǎn)識別的TALE蛋白[2]。

與ZFN相比，TALEN的DNA識別域更長，甚至可以達(dá)到40個核苷酸序列，因此它不易脫靶。同時，ZFN和TALEN面臨操作困難的限制性，即都需向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入蛋白質(zhì)，但是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法操作難度非常大，需要向細(xì)胞導(dǎo)入可以表達(dá)體積龐大且重復(fù)性高的DNA，經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后表達(dá)產(chǎn)生可以與靶位點(diǎn)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。因此，實(shí)驗(yàn)周期長，成本高，且實(shí)驗(yàn)室需要有一定的基礎(chǔ)才可以使用一些已經(jīng)發(fā)表的方法，極大地限制了兩種人工核酸酶在高通量方面的應(yīng)用。

三、CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來涌現(xiàn)出來的的基因組編輯工具，該系統(tǒng)通過一段小RNA分子可以把Cas9蛋白導(dǎo)向DNA靶位點(diǎn)，并依靠Cas9的核酸內(nèi)切酶活性在靶位點(diǎn)引入雙鏈斷口，從而啟動細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制完成靶基因的編輯。CRISPR/Cas系統(tǒng)在1987年被大阪大學(xué)的研究人員在細(xì)菌中的堿性磷酸酶基因附近區(qū)域被首次發(fā)現(xiàn)，功能是細(xì)菌中的免疫作用，來抵御病毒和外源DNA的入侵。在以后的研究中，根據(jù)其特點(diǎn)被命名為CRISPR系統(tǒng)，即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列。

CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR序列元件和Cas家族基因組成，CRISPR序列元件由高度保守的重復(fù)序列與間隔序列排列組成，而附近的Cas基因編碼具有核酸酶活性的蛋白質(zhì)，可以在定位后對DNA靶序列進(jìn)行特異性的切割。細(xì)菌中的CRISPR系統(tǒng)有三個類型，不同類型的RNA加工過程和發(fā)揮核心作用的蛋白質(zhì)不同，其中II型系統(tǒng)最為簡單，發(fā)揮核心作用的蛋白質(zhì)是Cas9一個蛋白[3]。

2013年初的兩篇《科學(xué)》文章利用II型系統(tǒng)即CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人源細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)了高效的多重基因組編輯，他們通過基因工程科學(xué)的方法優(yōu)化了細(xì)菌的II類CRISPR系統(tǒng)，并比較了其與TALEN方法在基因組編輯方面的效率，發(fā)現(xiàn)其效率更高更穩(wěn)定。與之前的人工核酸酶相比，其另外一個明顯的優(yōu)勢就是易于構(gòu)建，只需要根據(jù)DNA靶位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)一段長約20個堿基的DNA序列，并克隆進(jìn)入U6啟動子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的載體里面就可以實(shí)現(xiàn)對靶基因的編輯。隨后，研究者們繼續(xù)開發(fā)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，分別實(shí)現(xiàn)了靶基因的上調(diào)、下調(diào)、片段插入等等。該系統(tǒng)在應(yīng)用時，位點(diǎn)的設(shè)計(jì)有一個要求，就是PAM序列：NGG(N代表A、T、C、G)。同時，在人類基因組中，平均每8bp就存在NGG序列，所以可以近似的認(rèn)為靶位點(diǎn)序列的設(shè)計(jì)不受任何的限制[4，5]。

四、CRISPR/Cas9系統(tǒng)在高通量功能性篩選中的應(yīng)用

自從CRISPR/Cas9系統(tǒng)在高等真核生物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)基因組編輯，就憑借其高效和易于構(gòu)建的優(yōu)勢迅速發(fā)展成為應(yīng)用最為廣泛的基因組編輯工具，并被研究者通過慢病毒介導(dǎo)，與深度測序技術(shù)結(jié)合建立了高通量功能性篩選方法學(xué)。所謂高通量功能性篩選，就是通過基因組水平的篩選實(shí)驗(yàn)鑒定與研究興趣相關(guān)的基因，實(shí)現(xiàn)基因與功能之間的對應(yīng)關(guān)系，對于研究具有重要生物學(xué)功能的基因、重大疾病的特異性標(biāo)記物和潛在的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。

在進(jìn)行基因功能性篩選時，研究者通常會設(shè)計(jì)一個sgRNA文庫，針對全基因組水平的每一個基因都設(shè)計(jì)高效和特異性的sgRNA靶向基因的編碼區(qū)域，以此利用細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂后的非同源末端接合的修復(fù)方式，產(chǎn)生移碼突變而發(fā)生基因敲除。當(dāng)把sgRNA文庫通過慢病毒侵染的方式導(dǎo)入細(xì)胞后，就得到了一個細(xì)胞文庫，文庫中每個基因都有一定數(shù)量的被敲除細(xì)胞，在給文庫細(xì)胞以篩選壓力后，就會富集得到被敲除的基因是與篩選壓力功能相關(guān)的文庫細(xì)胞，最后通過深度測序分析被富集細(xì)胞的sgRNA種類和數(shù)量，即建立基因與功能之間的聯(lián)系。當(dāng)基于基因敲除的篩選方法被建立之后，研究者又開發(fā)了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因上調(diào)、基因下調(diào)和基因組大片段刪除的針對蛋白質(zhì)編碼基因和非編碼調(diào)控元件的高通量功能性篩選方法[6，7]。

五、高通量篩選技術(shù)篩選腫瘤細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的基因

癌癥是困擾人類健康和影響壽命的重大疾病，發(fā)生的機(jī)制是基因突變。癌癥之所以難以治療，是因?yàn)槠洳∫虻膹?fù)雜性和不同患者之間的異質(zhì)性。隨著癌癥生物學(xué)家對于腫瘤細(xì)胞的不斷研究和探索，逐漸總結(jié)出了腫瘤細(xì)胞的十大特征分別是：具有無限的增殖信號；拒絕細(xì)胞死亡，不斷更新；擁有抑制因子(抑制因子的作用：具有可以回避增殖信號的抑制作用)；擁有活化的增殖和遷移能力，即腫瘤細(xì)胞具備干細(xì)胞能力，可以隨體液到其他組織增殖分化；具有永生能力，不斷增殖；可以利用表皮生長因子，誘導(dǎo)新的血管生成，讓腫瘤細(xì)胞可以持續(xù)獲得增殖所需營養(yǎng)物質(zhì)；免疫逃逸，抑制T細(xì)胞的免疫作用并抑制T細(xì)胞分化；可以促進(jìn)抗炎癥體生成；腫瘤細(xì)胞的增殖伴隨著大量的突變，基因組極其不穩(wěn)定；可以反向調(diào)控細(xì)胞的能量和代謝，從而獲得細(xì)胞增殖的能量。對于腫瘤細(xì)胞不斷深入的理解，幫助研究者有針對性地開發(fā)全新的治療思路，有針對性地抑制腫瘤細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞的特征中，細(xì)胞增殖和遷移是癌癥發(fā)展的兩個重要因素[8]。

由CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的高通量功能性篩選技術(shù)通過靶向基因的sgRNA和Cas9蛋白結(jié)合，通過混合型文庫的篩選尋找到發(fā)揮特定功能的基因。因此，我們可以利用高通量功能性篩選技術(shù)篩選出影響腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的基因，這會給癌癥全新靶點(diǎn)的研究帶來新的思路。對于腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，通過慢病毒侵染在腫瘤細(xì)胞系建立sgRNA細(xì)胞文庫后，將細(xì)胞文庫培養(yǎng)20代以上，提取出sgRNA的整合區(qū)域進(jìn)行二代測序，就可以發(fā)現(xiàn)豐度出現(xiàn)變化的sgRNA。被正向富集的sgRNA則表示對應(yīng)基因被敲除后有利于腫瘤細(xì)胞的增殖，因此其靶向基因?yàn)橐职┗?；被?fù)向富集的sgRNA則表示對應(yīng)基因被敲除后不利于腫瘤細(xì)胞的增殖，因此其靶向基因?yàn)榇侔┗?。對于影響腫瘤細(xì)胞遷移的基因，則可以通過細(xì)胞遷移檢測報告系統(tǒng)分離出遷移能力變快和變慢的細(xì)胞，進(jìn)一步推理出其靶基因?qū)τ诩?xì)胞遷移的作用。這些基因的獲得，為腫瘤的治療研究提供了全新的靶點(diǎn)和策略。

基因組編輯技術(shù)是近年來最具影響力的方法學(xué)之一，基因組編輯工具包含可以模塊化的靶向區(qū)域和功能性區(qū)域，經(jīng)歷了人工核酸酶(包括ZFN和TALEN)以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)三代技術(shù)，極大地改變了研究者進(jìn)行生命科學(xué)基礎(chǔ)研究的方法思路，為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究提供了全新的技術(shù)手段。把基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的功能性基因組學(xué)方法應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞相關(guān)功能的研究之中，一定是未來重要的研究方向，能夠?yàn)槟[瘤的治療提供更多的靶點(diǎn)。