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    云南腐乳發(fā)酵菌種的分離鑒定及其低鹽腐乳的品質(zhì)分析

    2020-01-07 03:27:10楊智慧張軍偉魏冠棉周鵬
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:腐乳揮發(fā)性水解

    楊智慧,張軍偉,魏冠棉,周鵬*

    1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué) 食品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)

    腐乳(sufu)是以大豆為主要原料,經(jīng)加工磨漿、制坯、培菌、發(fā)酵而制成的調(diào)味、佐餐制品[1]。云南牟定腐乳深受云貴川等地區(qū)消費(fèi)者喜愛(ài),然而其生產(chǎn)仍沿用傳統(tǒng)工藝,開(kāi)放的自然條件下微生物種類(lèi)十分復(fù)雜,使腐乳終產(chǎn)品質(zhì)量極不穩(wěn)定。

    食鹽在腐乳的生產(chǎn)中主要具有以下作用:提供咸味;與谷氨酸結(jié)合,使腐乳產(chǎn)生鮮味;降低水分含量,增加鹽坯硬度;抑制和防止雜菌污染;抑制發(fā)酵過(guò)程中酶的活性,使其不至過(guò)度分解[2]。腐乳中鹽含量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致腐乳質(zhì)地松散或腐敗變質(zhì),引發(fā)食品安全問(wèn)題[3];而鹽含量過(guò)高則會(huì)使產(chǎn)品生產(chǎn)周期變長(zhǎng)[4],增加消費(fèi)者患病風(fēng)險(xiǎn),使產(chǎn)品的消費(fèi)受限制[5]。本文分離純化了云南自然發(fā)酵腐乳中的霉菌,并用于制備低鹽腐乳,同時(shí)分析其理化性質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及感官特性,以期為低鹽腐乳的實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    大豆,購(gòu)自安徽??;菜籽油、辣椒、花椒、食用鹽,購(gòu)自云南當(dāng)?shù)?;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA),北京陸橋技術(shù)股份有限公司;2-苯基乙酸乙酯(色譜純),阿拉丁生化科技股份有限公司。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    YJ-VS-1單人垂直超凈工作臺(tái),無(wú)錫一凈凈化設(shè)備有限公司;G154DWS立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋,致微(廈門(mén))儀器有限公司;SHP-15生化培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DM2000生物顯微鏡,徠卡顯微系統(tǒng)有限公司;C1000 TouchTM基因擴(kuò)增儀,美國(guó)Bio-Rad公司;Heraeus Multifuge XIR冷凍離心機(jī),賽默飛世爾科技公司;Agilent 1100氨基酸分析儀,美國(guó)安捷倫科技有限公司;S220 Seven Compact pH計(jì),梅特勒-托利多公司;X08A自動(dòng)硝化裝置,上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司;K1302自動(dòng)定氮分析儀,上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司;Trace 1300 GC-MS色譜儀,賽默飛世爾科技公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 腐乳發(fā)酵菌種的分離純化

    從腐乳廠隨機(jī)采集自然發(fā)酵3 d后的毛坯,將毛坯分別以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七個(gè)梯度稀釋?zhuān)總€(gè)梯度取100 μL涂布到PDA平板中,28 ℃培養(yǎng)觀察。

    取平板上單個(gè)菌落,以點(diǎn)接法接種在PDA平板上,28 ℃培養(yǎng)觀察,直至菌落形態(tài)穩(wěn)定且單一。用生物顯微鏡對(duì)分離菌株的形態(tài)進(jìn)行觀察。

    1.2.2 低鹽腐乳的制備

    腐乳的制備工藝參考地標(biāo)DB53/T 713—2015[6],大豆經(jīng)浸泡后磨漿、煮漿、點(diǎn)漿、壓榨成坯,然后切成小塊,制得豆腐;在豆腐上均勻地噴灑霉菌孢子懸浮液,培養(yǎng)3 d,制得毛坯;將毛坯進(jìn)行晾曬、鹽漬(10 kg毛坯中含500 g鹽),得到鹽坯;鹽坯與辣椒、花椒、姜片、不同比例的鹽(10 kg鹽坯中分別含1 000、700、400 g鹽,分別相對(duì)于傳統(tǒng)牟定腐乳100%、70%和40%的鹽添加量)混勻后裝瓶,加入湯汁(含體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇)后發(fā)酵90 d制得低鹽腐乳。

    1.2.3 低鹽腐乳理化指標(biāo)的測(cè)定

    水分含量[7]:按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.3—2016中規(guī)定的“直接干燥法”進(jìn)行檢測(cè)。

    NaCl含量[8]:按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.44—2016中規(guī)定的“佛爾哈德法(間接沉淀滴定法)”進(jìn)行檢測(cè);

    總酸含量[9]:按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 12456—2008中規(guī)定的“酸堿滴定法”進(jìn)行檢測(cè);

    氨基酸態(tài)氮含量[10]:按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.235—2016中規(guī)定的“酸度計(jì)法”進(jìn)行檢測(cè);

    水溶性蛋白含量[11]:按照農(nóng)業(yè)部推薦標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1205—2006進(jìn)行檢測(cè);

    粗蛋白含量[12]:按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2016中規(guī)定的“凱式定氮法”進(jìn)行檢測(cè);

    蛋白質(zhì)水解程度:以氨基酸態(tài)氮(amini acid nitrogen,AAN)/總氮(total nitrogen,TN)結(jié)合水溶性蛋白(water-soluble protein,WP)/粗蛋白(crude protein,CP)的百分比表示蛋白的水解程度。

    1.2.4 菌種的鑒定

    所分離菌株的全基因利用CTAB法提取。PCR擴(kuò)增引物采用真菌通用引物NS1:5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和NS8:5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1,PCR反應(yīng)采用TaqPCR Master Mix試劑盒。PCR的循環(huán)步驟:94 ℃預(yù)變性4 min,34次循環(huán),94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司測(cè)序。

    根據(jù)其所測(cè)的序列在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行比對(duì),找出與所測(cè)序列最相似的菌株,并采用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

    1.2.5 低鹽腐乳游離氨基酸含量的測(cè)定

    采用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定,具體方法參考文獻(xiàn)[13]。

    1.2.6 低鹽腐乳微觀結(jié)構(gòu)的觀察

    采用掃描電子顯微鏡對(duì)低鹽腐乳微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,具體方法參考文獻(xiàn)[14]。

    1.2.7 低鹽腐乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

    樣品前處理:將5 g腐乳、1 g NaCl和5 g H2O充分混勻后,取5 g混合物于頂空瓶中,上機(jī)分析前加入20 μL 2-苯基乙酸乙酯甲醇溶液作為內(nèi)標(biāo)物(內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為320.5 μg/mL)。

    采用色譜儀進(jìn)行測(cè)定,具體方法參考文獻(xiàn)[15]。

    1.2.8 低鹽腐乳的感官評(píng)價(jià)

    低鹽腐乳的感官評(píng)價(jià)參考地方標(biāo)準(zhǔn)DB53/T 713—2015[6]、沈子林[16]、張曉鳴等[17]的方法,并結(jié)合實(shí)際樣品進(jìn)行了一定修改:10名感評(píng)人員(5男5女)分別按照表2對(duì)腐乳的色澤、香氣、質(zhì)地、滋味進(jìn)行評(píng)分,按照表3對(duì)腐乳進(jìn)行接受度檢驗(yàn)。

    1.2.9 數(shù)據(jù)分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn);用SPSS 23.0軟件對(duì)鹽含量和理化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性(Pearson correlation,PC)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌種的形態(tài)學(xué)觀察

    經(jīng)分離純化后獲得了純種菌株M2,其形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖1所示。M2菌落中心為淺黃色,邊緣為白色,呈薄棉絮狀,菌絲茂密,有分生孢子和孢子囊,孢子囊頂生,內(nèi)含大量孢囊孢子,孢囊梗不分支,根據(jù)《真菌學(xué)》[18]初步判斷為毛霉屬真菌。

    2.2 分子生物學(xué)鑒定

    通過(guò)NCBI對(duì)菌株M2的基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析,結(jié)果顯示M2與總狀毛霉(Mucorracemosus)同源性最高。利用Mega 7.0軟件構(gòu)建菌株M2與毛霉屬部分模式種的基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示,菌株M2與Mucorracemosus(JF723681.2)處同一進(jìn)化分支,親緣關(guān)系最近。

    綜合對(duì)菌種的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果以及基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,將菌株M2初步鑒定為總狀毛霉,并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏號(hào)為CGMCC No.15264。

    2.3 低鹽腐乳理化性質(zhì)分析

    低鹽腐乳中的鹽含量、總酸、氨基酸態(tài)氮、水溶性蛋白及粗蛋白含量結(jié)果見(jiàn)表4。相對(duì)于傳統(tǒng)云南牟定腐乳100%、70%和40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽添加量制備的腐乳(M2-100%、M2-70%和M2-40%),鹽含量分別為8.15、6.83和5.03 g/100 g;水分含量均為69%左右;腐乳的總酸隨著鹽含量的降低而升高,主要是由于降低鹽含量使得其對(duì)酶的抑制作用減小,腐乳蛋白水解程度增大造成的;從AAN/TN和WP/CP的結(jié)果可看出,腐乳的蛋白水解程度隨著鹽含量的降低而增大,這與氨基酸態(tài)氮和水溶性蛋白的變化趨勢(shì)相一致。M2-100%、M2-70%和M2-40%理化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果均符合云南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB53/T 713—2015《地理標(biāo)志產(chǎn)品 牟定腐乳》[6]中腐乳成熟的理化要求。

    注:同一列中標(biāo)記有不同字母(a,b,c)的數(shù)據(jù)間有顯著性差異(P<0.05);TN=CP/5.71表示總氮含量

    采用SPSS 23.0對(duì)各理化指標(biāo)與鹽含量進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析,結(jié)果如表5所示。腐乳中的鹽含量與總酸、水溶性蛋白含量呈較顯著的負(fù)相關(guān),與氨基酸態(tài)氮含量、蛋白質(zhì)水解程度呈顯著的負(fù)相關(guān),這與文獻(xiàn)報(bào)道[4]的相似。

    注:**表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān);*表示在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)

    2.4 低鹽腐乳游離氨基酸含量分析

    低鹽腐乳中的游離氨基酸含量結(jié)果見(jiàn)表6。M2-100%、M2-70%和M2-40%的總氨基酸含量分別為22.62、26.98、30.59 g/100 g。腐乳中含量最高的游離氨基酸為呈鮮味的谷氨酸,其次為天冬氨酸,隨著鹽含量的降低,游離氨基酸含量逐漸升高,這與HAN等[19]的研究結(jié)果相一致,且與腐乳理化性質(zhì)的變化趨勢(shì)相一致。

    注:“-”表示未檢測(cè)出

    2.5 低鹽腐乳微觀結(jié)構(gòu)分析

    采用掃描電鏡對(duì)低鹽腐乳微觀結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果如圖3所示。

    隨著鹽含量的降低,凝膠結(jié)構(gòu)的孔徑逐漸縮小,且更加致密均一。M2-100%內(nèi)部呈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),存在較多的大孔徑,可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的水解程度較低,蛋白質(zhì)膠粒較大,蛋白凝膠結(jié)構(gòu)受到的破壞程度有限;M2-70%的微觀結(jié)構(gòu)與M2-100%相似,但M2-70%的凝膠孔徑略小;M2-40%的孔徑最小,致密均一,說(shuō)明其蛋白質(zhì)水解程度最高,這與汪建明等[20]、張媛媛等[21]的結(jié)果相一致。

    2.6 低鹽腐乳的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

    低鹽腐乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果見(jiàn)表7。M2-100%、M2-70%、M2-40%中均檢測(cè)出了45種揮發(fā)性物質(zhì),包括15種酯類(lèi)、12種醇類(lèi)、5種酸類(lèi)、4種醛類(lèi)、4種烯類(lèi)、2種酮類(lèi)和3種雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)。3種鹽含量的腐乳揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)相近,但含量具有顯著的差異。M2-100%、M2-70%、M2-40%中揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量分別為17 964.42、29 090.05、19 644.56 μg/kg,其中酯類(lèi)、醇類(lèi)、烯類(lèi)含量所占比例較大。腐乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可由蛋白質(zhì)及脂肪酸等大分子物質(zhì)的分解代謝及其他酶催化反應(yīng)(尤其是酯化反應(yīng))途徑產(chǎn)生;由于不同含量的鹽對(duì)酶類(lèi)的抑制作用不同,故含不同鹽含量的腐乳中揮發(fā)性物質(zhì)含量不同。

    注:同一行不同小寫(xiě)字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

    酯類(lèi)大多具有特殊香氣,可賦予腐乳香甜氣味。其中辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸-2-苯乙酯、苯乙酸乙酯賦予了腐乳果香、奶香和花香[22],苯甲酸乙酯、水楊酸甲酯賦予了腐乳冬青油香,十四酸乙酯、丙位壬內(nèi)酯賦予了腐乳椰子香。腐乳的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中,乙酯類(lèi)物質(zhì)含量較高,可能是腐乳中脂質(zhì)水解產(chǎn)生的脂肪酸與所加入的乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成的;另外,LI等[23]認(rèn)為酯類(lèi)的增加主要發(fā)生在加入酒精的腌制期,且產(chǎn)生的酯類(lèi)含量與加入的酒精含量呈正相關(guān)。

    醇類(lèi)具有較強(qiáng)烈的香味,腐乳中醇的種類(lèi)和含量與外界添加有關(guān),腌制時(shí)由于添加乙醇,腐乳中醇的種類(lèi)和含量增加,且醇能與脂肪酸等酸類(lèi)物質(zhì)通過(guò)酯化反應(yīng)生成酯類(lèi)物質(zhì)。此外,香辛料的加入也大大豐富了腐乳醇類(lèi)成分,花椒中含有大量的香氣成分,其中主要含有芳樟醇、4-萜烯醇、松油醇等[24-25],因此腐乳中含量最為豐富的芳樟醇、4-萜烯醇和松油醇等,可能來(lái)自于配料中的花椒。

    腐乳中另一大類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)是醛類(lèi),醛類(lèi)物質(zhì)中苯甲醛含量最高,可由游離的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化而來(lái)[26],能夠賦予腐乳苦杏仁香味。

    2.7 低鹽腐乳的感官評(píng)價(jià)

    低鹽腐乳的感官評(píng)定結(jié)果如圖4所示。M2-100%、M2-70%、M2-40%的色澤和香氣無(wú)顯著性差異,且得分均在7~9分之間,符合腐乳的要求[15]。M2-100%滋味得分為7.20分,M2-70%(8.28分)和M2-40%(7.90分)的滋味得分均高于M2-100%;且M2-70%(8.10分)和M2-40%(7.74分)的質(zhì)地得分也高于M2-100%(7.00分)。結(jié)合低鹽腐乳的理化性質(zhì)來(lái)看,可能是由于M2-70%和M2-40%的水解程度比M2-100%高,所以呈味的小分子含量更高,滋味更好,且質(zhì)地更細(xì)膩軟糯;而M2-40%的滋味和質(zhì)地得分相對(duì)于M2-70%較低,則可能是M2-40%過(guò)度水解導(dǎo)致質(zhì)地過(guò)軟,且鹽含量過(guò)低,滋味相對(duì)寡淡。低鹽腐乳的喜好度得分順序?yàn)镸2-70%>M2-40%>M2-100%,這與滋味和質(zhì)地的感評(píng)結(jié)果相一致。

    3 結(jié)論

    通過(guò)對(duì)分離純化菌種的形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定,所分離出來(lái)的菌種為總狀毛霉。將該菌種應(yīng)用于低鹽腐乳的制備,確定降低鹽含量可提高蛋白質(zhì)的水解程度和游離氨基酸含量,使得微觀結(jié)構(gòu)更加致密均一;低鹽腐乳中共檢測(cè)出了45種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),酯類(lèi)、醇類(lèi)和烯類(lèi)含量所占比例較大,且鹽含量對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量有較大影響;M2-100%、M2-70%、M2-40%腐乳接受度皆較好,但M2-70%的接受度最高。這為M2的實(shí)際應(yīng)用、傳統(tǒng)腐乳發(fā)酵工藝的改進(jìn)及低鹽腐乳的開(kāi)放提供了理論指導(dǎo)。

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