• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黑曲霉低聚葡萄糖氧化酶的分子克隆與生化特征

    2020-01-07 03:27:10苑馨瑤田康明金鵬程磊王正祥
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:黑曲霉麥芽乳糖

    苑馨瑤,田康明,金鵬,程磊,王正祥*

    1(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院,天津,300457) 2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)

    低聚葡萄糖氧化酶(gluco-oligosaccharide oxidase,EC1.1.99.B3,Goox)是碳水化合物氧化酶的一種,作用于以α/β-1,4-糖苷鍵連接的低聚葡萄糖,催化氧化還原性末端殘基生成相應(yīng)的糖酸或內(nèi)酯[1-3]。寡糖酸具有修復(fù)、抗氧化、保濕、促進(jìn)機(jī)體更新等多重功效[4-5],已應(yīng)用于食品、化妝品、建筑、醫(yī)療、保健等諸多領(lǐng)域[6-7]?,F(xiàn)有的乳糖酸、麥芽糖酸和纖維二糖酸多采用化學(xué)法制備,其工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高且副產(chǎn)物影響較大[8-9]。Goox的發(fā)現(xiàn)使酶法制備寡醛糖酸成為可能。此外,Goox作為食品添加劑應(yīng)用于纖維含量高的面團(tuán)中,提高面團(tuán)的筋度;還可以作為添加劑加入到飼料中,促進(jìn)雙歧桿菌的增殖,增加腸道對(duì)礦物質(zhì)的吸收[10];向酶中引入木聚糖底物結(jié)合區(qū),可以用來(lái)檢測(cè)和量化不同低聚糖,也可應(yīng)用于低聚糖生物傳感儀的構(gòu)建[11-12];因此,Goox還可應(yīng)用于食品、飼料、化工等多個(gè)行業(yè),應(yīng)用潛力巨大。

    1991年,LIN等首次在Sarocladiumstrictum中發(fā)現(xiàn)Goox,隨后,KIRYU在Paraconiothyriumsp.中也成功分離得到該酶[13-14]。近幾年對(duì)該酶的研究主要集中于異源表達(dá)、蛋白結(jié)構(gòu)和應(yīng)用領(lǐng)域方面。2005年,HUANG將來(lái)源于S.strictumT1中g(shù)oox-T1基因在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá),通過(guò)對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,確認(rèn)該酶的活性位點(diǎn)和催化機(jī)制[15];2008年,KIRYU對(duì)來(lái)源于Paraconiothyriumsp.的Goox在乳糖酸轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用潛力進(jìn)行研究,結(jié)果表明該酶可以有效地將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸,轉(zhuǎn)化率為100%[13];2011年,MARYAM通過(guò)定點(diǎn)突變將來(lái)源于S.strictumCBS 346.7的goox-VN基因在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá),通過(guò)定點(diǎn)突變提高了底物特異性[16]。但目前各項(xiàng)研究也僅圍繞著2個(gè)來(lái)源的Goox進(jìn)行,需要進(jìn)一步研究獲得不同來(lái)源的新酶。

    本文通過(guò)生物信息學(xué)分析,從黑曲霉基因組中尋找到一疑似Goox的開(kāi)放讀框,進(jìn)一步通過(guò)分子克隆技術(shù)對(duì)其進(jìn)行克隆表達(dá),并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和生化特征進(jìn)行分析,為后續(xù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種與質(zhì)粒

    黑曲霉(Aspergillusniger)F0215、大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115和質(zhì)粒pPIC9K,皆為本實(shí)驗(yàn)室保藏;黑曲霉和大腸桿菌分別采用PDA和LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。畢赤酵母及其重組菌按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

    1.2 主要試劑

    限制性?xún)?nèi)切酶XbaI、NcoI、SalI以及PyrobestTMDNA聚合酶和T4DNA連接酶,寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)??焖偬崛≡噭┖?、DNA純化回收盒,北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司;cDNA合成試劑盒,Roche公司;辣根過(guò)氧化物酶、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖,北京索萊寶科技有限公司;苯酚、4-氨基安替比林,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖、蔗糖、纖維二糖、麥芽糖和過(guò)氧化氫,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.3 基因克隆與重組菌構(gòu)建

    1.4 重組酶的制備與純化

    參考畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)對(duì)上述重組菌進(jìn)行發(fā)酵,8 000 r/min離心15 min,收集上清液,于-20 ℃保存。發(fā)酵上清液經(jīng)飽和濃度為20%~80% (NH4)2SO4分級(jí)鹽析后,再以HiTrap Desalting PD-10脫鹽柱和Sephadex-100凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行純化。

    1.5 重組低聚葡萄糖氧化酶活力測(cè)定

    酶活測(cè)定參照LEE等的方法[18]進(jìn)行。1 mL反應(yīng)體系包括:稀釋酶液0.2 mL,0.1 mmol/L 4-氨基安替比林,1 mmol/L苯酚,1 mmol/L乳糖,0.05 U辣根過(guò)氧化物酶,0.1 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.0)。55 ℃水浴中反應(yīng)30 min,冰浴5 min終止反應(yīng),測(cè)定500 nm下吸光度。以不加底物的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照組。酶活定義:每分鐘氧化底物生成1 μmol過(guò)氧化氫的酶量為1個(gè)酶活力單位,以U/mL表示。

    1.6 重組酶酶學(xué)性質(zhì)與特征分析

    1.6.1 最適溫度的測(cè)定

    在不同溫度(40、45、50、55、60、65、70、75、80和85 ℃)下測(cè)定其酶活力,以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活,考察溫度對(duì)重組酶活力的影響。

    1.6.2 溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

    將酶液分別置于55、65、75、85和95 ℃下保溫4 h,間隔1 h取樣,按照1.5方法測(cè)定殘余酶活,以最高酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活。

    1.6.3 最適pH的測(cè)定

    分別以0.1 mol/L磷酸-檸檬酸(pH 5.0~8.0)和碳酸鈉-碳酸氫鈉(pH 9.0~10.0)替換1.5方法中的緩沖液,測(cè)定不同pH條件下的酶活力,以最高的酶活力計(jì)為100%,計(jì)算相對(duì)酶活,考察pH值對(duì)酶活的影響。

    1.6.4 pH穩(wěn)定性的測(cè)定

    將酶分別置于不同pH(5.0~10.0)的緩沖液中(終濃度一致),室溫放置4 h,間隔1 h取樣,測(cè)定殘余酶活。以最高酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活。

    1.6.5 金屬離子對(duì)酶的影響

    在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1 mmol/L的Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe3+、Ba2+、Co2+、Cu2+、Na+、Mn2+和K+,測(cè)定其酶活力,以未加金屬離子的酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活。

    1.6.6 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

    以不同濃度(1、5、10、15、20 mmol/L)的乳糖為底物,在重組酶的最適作用溫度和pH條件下進(jìn)行反應(yīng),測(cè)定酶活。采用雙倒數(shù)法(Lineweaver-Burk)作圖,計(jì)算米氏常數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax。

    1.6.7 底物特異性分析

    分別以終濃度1 mmol/L的葡萄糖、木糖、半乳糖、乳糖、纖維二糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖為反應(yīng)底物,測(cè)定酶活。以最適底物的酶活力為100%,計(jì)算其他底物的相對(duì)酶活。

    1.7 生物信息學(xué)分析

    從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得不同來(lái)源的Goox氨基酸序列,利用軟件Clustal X2和Bioedit 7.0.9對(duì)這些序列進(jìn)行多序列比對(duì),并通過(guò)MEGA 4.0鄰近法構(gòu)建Goox進(jìn)化樹(shù),分析它們親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 黑曲霉基因組中存在疑似goox基因讀框

    根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道的Goox序列Goox-vn和Goox-T1,利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)黑曲霉基因組序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),黑曲霉基因組中存在一個(gè)疑似goox的開(kāi)放讀框,進(jìn)一步對(duì)來(lái)源于黑曲霉的Goox(命名為AnGoox)和Goox-vn、Goox-T1進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果如圖1所示。

    AnGoox與Goox-vn和Goox-T1的相似度分別為28.98%和28.71%。在它們的氨基酸序列中,都包含2個(gè)較為保守的結(jié)構(gòu)域,一段位置在37~174之間,長(zhǎng)度為137的FAD結(jié)合域,其起始基序?yàn)?PAAI)。另一段在結(jié)尾處長(zhǎng)度約為44的黃素結(jié)構(gòu)域。通過(guò)氨基酸序列比對(duì),可知與FAD進(jìn)行雙共價(jià)連接的關(guān)鍵氨基酸殘基為His80和Cys141。參與反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸殘基為Asp377和Try428,2個(gè)氨基酸引發(fā)底物的氫離子的轉(zhuǎn)移,從而降低FAD輔因子能量。

    2.2 黑曲霉Goox基因的克隆

    以黑曲霉F0215的cDNA為模板對(duì)Goox基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)純化和限制性?xún)?nèi)切酶XbaI酶切后,與經(jīng)SnaBI和AvrII酶切的pPIC9K載體連接,通過(guò)NcoI酶切,驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的正確性,獲得重組質(zhì)粒pPIC-goox。經(jīng)序列測(cè)定與分析發(fā)現(xiàn),goox編碼的氨基酸序列與黑曲霉CBS513.88基因組相應(yīng)序列有2個(gè)堿基的差異,在1310和1410位上,F(xiàn)0215來(lái)源的堿基為G和A,參照菌株CBS513.88為A和C,導(dǎo)致2個(gè)氨基酸不同(G437E和Q467P),但其對(duì)酶催化活性中心(H80、C141、D377、Y428)無(wú)影響(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。

    利用MEGA 4.0將不同來(lái)源的Goox的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖2),此進(jìn)化樹(shù)反映了不同來(lái)源的Goox之間的遺傳距離,AnGoox與其他來(lái)源的Goox相似度為28.91%~97.46%,其中,AnGoox與已報(bào)道的Goox-T1分屬于不同分支,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),AnGoox的氨基酸與A.piperis中的Goox的相似度為97.46%。

    2.3 重組Goox的表達(dá)與純化

    pPIC-goox重組質(zhì)粒經(jīng)SalI進(jìn)行線(xiàn)性化轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115中,通過(guò)G418抗性平板篩選高拷貝。獲得重組菌GS115(pPIC-goox)。在250 mL搖瓶發(fā)酵120 h后,檢測(cè)發(fā)酵液上清酶活,其Goox活力最高為5 mU/mL,因此確認(rèn)該酶為Goox。

    經(jīng)硫酸銨沉淀和Sephadex-100凝膠色譜純化后,比酶活為0.33 U/mL,純化倍數(shù)和回收率分別為16.5和34.7%。進(jìn)一步經(jīng)SDS-PAGE分析,蛋白大小約為61 kDa(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)),略高于理論值,分析可能存在N-糖基化[16]。

    2.4 AnGoox酶學(xué)性質(zhì)分析

    2.4.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

    溫度對(duì)AnGoox的活力和穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖3。AnGoox的最適作用溫度為75 ℃,在70~80 ℃范圍內(nèi),其相對(duì)酶活在75%以上(圖3-a);在85 ℃保溫4 h,剩余酶活力在70%以上,在95 ℃保溫4 h,剩余酶活降至約30%(圖3-b)。目前已報(bào)道的Goox的最適反應(yīng)溫度在37~55 ℃之間,S.strictum和Paraconiothyriumsp.來(lái)源的Goox在20~50 ℃條件下分別孵育1 h和24 h后,酶活維持在100%,但高于50 ℃酶活力迅速降低,S.strictum的Goox在60 ℃孵育1 h后,殘余酶活僅剩15%,Paraconiothyriumsp.的Goox在60 ℃孵育24 h后,殘余酶活僅為45%[13-14,16]??梢?jiàn),AnGoox的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性均顯著高于已報(bào)道的同類(lèi)酶。

    2.4.2 最適pH和pH穩(wěn)定性

    pH對(duì)AnGoox的活力和穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖4。AnGoox在pH 9.0下表現(xiàn)出最高的酶活力,pH改變則酶活迅速下降,在pH 7.0和pH 10.0下,酶活均降至約40%(圖4-a)。在pH 5.0~9.0保溫4 h后,剩余酶活在70%以上,顯示出較好的pH耐受能力(圖4-b)。AnGoox的最適pH與pH穩(wěn)定性均與來(lái)源于S.strictum的Goox(最適pH=10.0,在pH為5~11條件下,孵育1 h酶活維持在100%)相似[13-14]。

    2.4.3 不同金屬離子對(duì)酶活的影響

    如表1所示,多種金屬離子均對(duì)AnGoox表現(xiàn)出激活或者抑制作用,1 mmol/L 的Mn2+對(duì)酶活有較為明顯的促進(jìn)作用,而相同濃度的Fe3+、Ca2+和Ba2+對(duì)酶活的抑制作用最為強(qiáng)烈。與來(lái)源于S.strictum的低聚葡萄糖氧化酶相比,Zn2+對(duì)S.strictum的Goox具有促進(jìn)作用,而對(duì)AnGoox具有抑制作用[14]。

    2.4.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

    以不同濃度(1、5、10、15、20 mmol/L)的乳糖為底物,在最適溫度和pH條件下測(cè)定酶活,采用雙倒數(shù)法,繪制AnGoox的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn),如圖5所示,求得AnGoox的Km值為0.48 mmol/L,Vmax為2.22 μmol/(L·min)。該酶的Km高于Paraconiothyriumsp.的Goox(0.11 mmol/L)[13]和S.strictum的Goox(0.066 mmol/L)[18],說(shuō)明AnGoox對(duì)乳糖底物的親和力低于前期報(bào)道的2種酶。

    2.4.5 底物特異性研究

    分別以10種不同的糖作為底物,研究AnGoox特異性,結(jié)果如圖6。在10種底物中,AnGoox的氧化能力從高到低依次為麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽五糖、乳糖、纖維二糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、半乳糖。該酶與S.strictum的Goox底物特異性相似,都具有對(duì)單糖、雙糖和麥芽低聚糖的氧化能力[16,18]。AnGoox對(duì)麥芽低聚糖氧化能力優(yōu)于來(lái)自S.strictum的Goox,顯示該酶為酶法制備低聚糖酸提供新的可能。

    3 結(jié)論

    本研究首次鑒定了黑曲霉來(lái)源的低聚葡萄糖氧化酶,并成功在畢赤酵母中異源表達(dá),系統(tǒng)的酶學(xué)性質(zhì)解析為其后續(xù)應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)材料。

    猜你喜歡
    黑曲霉麥芽乳糖
    乳糖不耐受的人真的不能喝牛奶嗎
    異麥芽酮糖醇在卷煙增香保潤(rùn)中的應(yīng)用
    云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:31:04
    吃心情的麥芽精
    號(hào)稱(chēng)能告別“乳糖不耐受”的牛奶靠譜嗎?
    幸福(2018年33期)2018-12-05 05:22:48
    生麥芽雞內(nèi)金茶
    特別健康(2018年3期)2018-07-20 00:24:54
    張?jiān)气?對(duì)待麥芽,就像對(duì)待自己的作品
    商周刊(2017年10期)2017-08-23 13:30:41
    舒化奶能緩解乳糖不耐?
    復(fù)合誘變選育耐高溫高產(chǎn)葡萄糖酸鹽的黑曲霉菌株
    黑曲霉產(chǎn)纖維素酶混合發(fā)酵條件的研究
    酶法制備黑曲霉原生質(zhì)體的條件
    桃红色精品国产亚洲av| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久精品欧美日韩精品| 国产av一区在线观看免费| 亚洲 国产 在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 看免费成人av毛片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲av美国av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产一区二区三区av在线 | 国内精品久久久久久久电影| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产伦在线观看视频一区| or卡值多少钱| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 精品人妻偷拍中文字幕| 国模一区二区三区四区视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 69人妻影院| netflix在线观看网站| 亚洲精品国产成人久久av| 免费人成在线观看视频色| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 日本 av在线| 欧美高清性xxxxhd video| 精品久久久久久,| 美女高潮的动态| 亚洲自拍偷在线| 性欧美人与动物交配| 日本色播在线视频| 色av中文字幕| 男人舔女人下体高潮全视频| 国内精品久久久久久久电影| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产日本99.免费观看| 午夜福利在线在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 色哟哟·www| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产av不卡久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国内精品久久久久精免费| 五月玫瑰六月丁香| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲av成人av| 中文在线观看免费www的网站| 美女黄网站色视频| 欧美潮喷喷水| 波多野结衣高清无吗| aaaaa片日本免费| 欧美日韩精品成人综合77777| 高清在线国产一区| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产中年淑女户外野战色| 午夜亚洲福利在线播放| 色吧在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲第一电影网av| 国产av不卡久久| 在线播放无遮挡| 中亚洲国语对白在线视频| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 最新中文字幕久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 露出奶头的视频| 亚洲专区中文字幕在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 韩国av一区二区三区四区| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美在线一区亚洲| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美人与善性xxx| 好男人在线观看高清免费视频| 色在线成人网| 黄色丝袜av网址大全| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 99热只有精品国产| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产高潮美女av| 亚洲精品456在线播放app | 99精品久久久久人妻精品| 亚洲美女黄片视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产黄a三级三级三级人| 内射极品少妇av片p| 久久久久国内视频| 此物有八面人人有两片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 搞女人的毛片| 国产淫片久久久久久久久| 在线观看一区二区三区| 亚洲人成网站高清观看| 岛国在线免费视频观看| 我的老师免费观看完整版| 一本一本综合久久| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲av成人av| 亚洲无线观看免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日韩国内少妇激情av| 亚洲国产精品成人综合色| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品伦人一区二区| 美女黄网站色视频| 天天一区二区日本电影三级| 久久久久国内视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 成人一区二区视频在线观看| 夜夜爽天天搞| 亚洲精品一区av在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 精品一区二区三区人妻视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 丰满乱子伦码专区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费看av在线观看网站| 国产成年人精品一区二区| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产人妻一区二区三区在| 久久久久久久久大av| 日韩精品中文字幕看吧| 色视频www国产| 亚洲精品456在线播放app | 一个人看的www免费观看视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产色婷婷99| 亚洲第一电影网av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产成人a区在线观看| 欧美成人a在线观看| 一a级毛片在线观看| 免费看光身美女| 国产69精品久久久久777片| 淫秽高清视频在线观看| 国产高潮美女av| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品av视频在线免费观看| 日日夜夜操网爽| 老女人水多毛片| 欧美潮喷喷水| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品99久久久久久久久| 国产在视频线在精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 性色avwww在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 全区人妻精品视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 久久精品人妻少妇| 天堂网av新在线| 国产成人影院久久av| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 麻豆国产av国片精品| 免费电影在线观看免费观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 美女高潮的动态| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产视频一区二区在线看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久久久久大精品| 日本三级黄在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产成人a区在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 高清日韩中文字幕在线| 免费av不卡在线播放| 亚洲美女搞黄在线观看 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 中文字幕高清在线视频| 一进一出抽搐动态| 免费电影在线观看免费观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国内精品久久久久精免费| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 极品教师在线免费播放| 久久精品人妻少妇| 成人永久免费在线观看视频| 婷婷丁香在线五月| 日本a在线网址| 久久久成人免费电影| 欧美日韩黄片免| 免费av观看视频| 日本黄色片子视频| 欧美成人a在线观看| 免费高清视频大片| 久久久午夜欧美精品| 黄色一级大片看看| 国产久久久一区二区三区| 国产亚洲av嫩草精品影院| a级毛片a级免费在线| 少妇丰满av| 成年女人看的毛片在线观看| 看片在线看免费视频| 国产成人aa在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 99久久精品热视频| 成年版毛片免费区| 99热精品在线国产| 国产精品久久久久久久久免| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜福利在线在线| 免费无遮挡裸体视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日本色播在线视频| 久久香蕉精品热| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品伦人一区二区| 日本五十路高清| 看黄色毛片网站| 很黄的视频免费| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲真实伦在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 久久精品国产亚洲网站| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av在线观看视频网站免费| 少妇熟女aⅴ在线视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 最近中文字幕高清免费大全6 | 两个人的视频大全免费| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 波多野结衣高清作品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲在线观看片| 日本在线视频免费播放| 亚洲在线观看片| av黄色大香蕉| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲人成网站高清观看| 国产 一区 欧美 日韩| 久久久国产成人免费| 偷拍熟女少妇极品色| 最新中文字幕久久久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 午夜激情欧美在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日本在线视频免费播放| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 婷婷色综合大香蕉| 国产黄片美女视频| 两个人的视频大全免费| 久久久久久九九精品二区国产| 男人舔奶头视频| 无遮挡黄片免费观看| av天堂在线播放| 日本色播在线视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品一区二区免费欧美| 99在线视频只有这里精品首页| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品av视频在线免费观看| 两个人的视频大全免费| 精品国内亚洲2022精品成人| bbb黄色大片| 亚洲av一区综合| 久久久久久伊人网av| 嫩草影视91久久| 国产三级在线视频| 变态另类丝袜制服| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩欧美精品v在线| 麻豆一二三区av精品| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲最大成人av| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 免费无遮挡裸体视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 精品日产1卡2卡| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲av一区综合| 国产成年人精品一区二区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 色综合婷婷激情| 女人被狂操c到高潮| 一本一本综合久久| 69人妻影院| 精品久久国产蜜桃| 一a级毛片在线观看| 国产三级中文精品| 国产精品98久久久久久宅男小说| 99精品在免费线老司机午夜| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 男插女下体视频免费在线播放| 制服丝袜大香蕉在线| 国产av不卡久久| 国产不卡一卡二| 99视频精品全部免费 在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 熟女人妻精品中文字幕| 久久午夜福利片| 综合色av麻豆| 香蕉av资源在线| 97碰自拍视频| 欧美区成人在线视频| 国产探花极品一区二区| 国产精品一区二区免费欧美| 校园春色视频在线观看| 亚洲四区av| 欧美在线一区亚洲| 色哟哟·www| 在线免费观看的www视频| 欧美bdsm另类| 村上凉子中文字幕在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 中文字幕av在线有码专区| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲av不卡在线观看| xxxwww97欧美| 在线免费十八禁| 给我免费播放毛片高清在线观看| 岛国在线免费视频观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 九色成人免费人妻av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲自拍偷在线| 免费在线观看影片大全网站| 黄色日韩在线| 一级a爱片免费观看的视频| 两个人视频免费观看高清| 一本一本综合久久| 国产日本99.免费观看| 九九爱精品视频在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 成人国产综合亚洲| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 日韩精品青青久久久久久| 欧美一区二区精品小视频在线| av.在线天堂| 国产午夜精品论理片| 国产精品人妻久久久久久| 99热精品在线国产| 国内精品久久久久精免费| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产激情偷乱视频一区二区| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一区二区三区视频了| 久久久久久久午夜电影| 最新在线观看一区二区三区| 少妇高潮的动态图| 欧美黑人欧美精品刺激| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| av女优亚洲男人天堂| 欧美高清成人免费视频www| eeuss影院久久| a在线观看视频网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲欧美清纯卡通| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜福利在线在线| 国产黄色小视频在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美在线一区亚洲| 久久人妻av系列| 人妻夜夜爽99麻豆av| 成年女人永久免费观看视频| 无人区码免费观看不卡| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 能在线免费观看的黄片| 国产午夜精品论理片| 成人三级黄色视频| 欧美zozozo另类| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲美女黄片视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 窝窝影院91人妻| 欧美日韩精品成人综合77777| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产真实伦视频高清在线观看 | 夜夜夜夜夜久久久久| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 99热只有精品国产| a在线观看视频网站| 亚洲在线自拍视频| 色综合色国产| 在线国产一区二区在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 精品久久久久久久久久久久久| 国产探花在线观看一区二区| 久久热精品热| 日本a在线网址| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲中文字幕日韩| 久久久精品欧美日韩精品| 黄色丝袜av网址大全| 久久久午夜欧美精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 可以在线观看毛片的网站| 此物有八面人人有两片| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美黑人巨大hd| 日韩一区二区视频免费看| 欧美日韩精品成人综合77777| 99riav亚洲国产免费| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久成人免费电影| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产一区二区激情短视频| 中出人妻视频一区二区| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产一区二区激情短视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 人妻夜夜爽99麻豆av| 精品免费久久久久久久清纯| 国产成人a区在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 国产精品日韩av在线免费观看| 99热只有精品国产| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜精品久久久久久毛片777| bbb黄色大片| 特大巨黑吊av在线直播| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 九色成人免费人妻av| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲成人精品中文字幕电影| 99久久中文字幕三级久久日本| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 给我免费播放毛片高清在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 一区二区三区激情视频| 麻豆国产97在线/欧美| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲,欧美,日韩| 国产成年人精品一区二区| 色播亚洲综合网| 啦啦啦韩国在线观看视频| av国产免费在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 黄色日韩在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久9热在线精品视频| 色5月婷婷丁香| 亚洲精品亚洲一区二区| 色综合站精品国产| 人妻久久中文字幕网| 日韩欧美国产在线观看| 国产综合懂色| 亚洲av中文av极速乱 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 免费观看精品视频网站| 国产真实伦视频高清在线观看 | 91精品国产九色| 免费观看在线日韩| 精品免费久久久久久久清纯| 免费观看精品视频网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 三级毛片av免费| 中国美白少妇内射xxxbb| 91av网一区二区| 中出人妻视频一区二区| 日韩中字成人| 51国产日韩欧美| 久久热精品热| 久久精品国产亚洲网站| 久久这里只有精品中国| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美在线一区亚洲| 一进一出抽搐gif免费好疼| 热99re8久久精品国产| av在线观看视频网站免费| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 免费看av在线观看网站| 91av网一区二区| 校园春色视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 精品国产三级普通话版| 欧美成人一区二区免费高清观看| 一区二区三区激情视频| 午夜精品在线福利| 中文字幕av成人在线电影| 很黄的视频免费| 日韩欧美国产一区二区入口| 禁无遮挡网站| 成人毛片a级毛片在线播放| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 2021天堂中文幕一二区在线观| 一级黄片播放器| 国产真实伦视频高清在线观看 | 日本免费a在线| 国产美女午夜福利| 午夜免费成人在线视频| 国产亚洲欧美98| 五月伊人婷婷丁香| 一级av片app| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产成人a区在线观看| 亚洲av成人av| 午夜日韩欧美国产| 日韩欧美免费精品| 成人国产综合亚洲| 能在线免费观看的黄片| 亚洲真实伦在线观看| 免费看日本二区| 国产主播在线观看一区二区| 午夜久久久久精精品| a级毛片a级免费在线| 久久久久久久久久成人| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产黄片美女视频| 禁无遮挡网站| 成人三级黄色视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 久久精品人妻少妇| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 无人区码免费观看不卡| 国产精品无大码| 国产v大片淫在线免费观看| 日本色播在线视频| 在线播放国产精品三级| 少妇的逼好多水| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产精品女同一区二区软件 | 91av网一区二区| 又爽又黄a免费视频| 欧美一区二区亚洲| 日本黄大片高清| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 国产高清不卡午夜福利| 最新在线观看一区二区三区| 国产成年人精品一区二区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 91狼人影院| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品国产三级普通话版| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日本一二三区视频观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品久久视频播放| 无遮挡黄片免费观看| 久久久精品大字幕| 免费人成视频x8x8入口观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 狠狠狠狠99中文字幕| 一进一出抽搐gif免费好疼| 直男gayav资源| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 有码 亚洲区| 国产视频一区二区在线看| 国产淫片久久久久久久久| 99久久精品热视频| 午夜福利在线在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 此物有八面人人有两片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成年女人永久免费观看视频| 韩国av一区二区三区四区| 欧美黑人巨大hd| 午夜福利18| 一本精品99久久精品77| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲三级黄色毛片| 免费高清视频大片| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费电影在线观看免费观看| 国国产精品蜜臀av免费| 老司机福利观看|