黑曲霉低聚葡萄糖氧化酶的分子克隆與生化特征

苑馨瑤,田康明,金鵬,程磊,王正祥*

1(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院,天津,300457) 2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)

低聚葡萄糖氧化酶(gluco-oligosaccharide oxidase，EC1.1.99.B3，Goox)是碳水化合物氧化酶的一種，作用于以α/β-1,4-糖苷鍵連接的低聚葡萄糖，催化氧化還原性末端殘基生成相應(yīng)的糖酸或內(nèi)酯[1-3]。寡糖酸具有修復(fù)、抗氧化、保濕、促進(jìn)機(jī)體更新等多重功效[4-5]，已應(yīng)用于食品、化妝品、建筑、醫(yī)療、保健等諸多領(lǐng)域[6-7]?，F(xiàn)有的乳糖酸、麥芽糖酸和纖維二糖酸多采用化學(xué)法制備，其工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高且副產(chǎn)物影響較大[8-9]。Goox的發(fā)現(xiàn)使酶法制備寡醛糖酸成為可能。此外，Goox作為食品添加劑應(yīng)用于纖維含量高的面團(tuán)中，提高面團(tuán)的筋度；還可以作為添加劑加入到飼料中，促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，增加腸道對(duì)礦物質(zhì)的吸收[10]；向酶中引入木聚糖底物結(jié)合區(qū)，可以用來(lái)檢測(cè)和量化不同低聚糖，也可應(yīng)用于低聚糖生物傳感儀的構(gòu)建[11-12]；因此，Goox還可應(yīng)用于食品、飼料、化工等多個(gè)行業(yè)，應(yīng)用潛力巨大。

1991年，LIN等首次在Sarocladiumstrictum中發(fā)現(xiàn)Goox，隨后，KIRYU在Paraconiothyriumsp.中也成功分離得到該酶[13-14]。近幾年對(duì)該酶的研究主要集中于異源表達(dá)、蛋白結(jié)構(gòu)和應(yīng)用領(lǐng)域方面。2005年，HUANG將來(lái)源于S.strictumT1中g(shù)oox-T1基因在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，通過(guò)對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，確認(rèn)該酶的活性位點(diǎn)和催化機(jī)制[15]；2008年，KIRYU對(duì)來(lái)源于Paraconiothyriumsp.的Goox在乳糖酸轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用潛力進(jìn)行研究，結(jié)果表明該酶可以有效地將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸，轉(zhuǎn)化率為100%[13]；2011年，MARYAM通過(guò)定點(diǎn)突變將來(lái)源于S.strictumCBS 346.7的goox-VN基因在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，通過(guò)定點(diǎn)突變提高了底物特異性[16]。但目前各項(xiàng)研究也僅圍繞著2個(gè)來(lái)源的Goox進(jìn)行，需要進(jìn)一步研究獲得不同來(lái)源的新酶。

本文通過(guò)生物信息學(xué)分析，從黑曲霉基因組中尋找到一疑似Goox的開(kāi)放讀框，進(jìn)一步通過(guò)分子克隆技術(shù)對(duì)其進(jìn)行克隆表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和生化特征進(jìn)行分析，為后續(xù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

黑曲霉(Aspergillusniger)F0215、大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115和質(zhì)粒pPIC9K，皆為本實(shí)驗(yàn)室保藏；黑曲霉和大腸桿菌分別采用PDA和LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。畢赤酵母及其重組菌按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶XbaI、NcoI、SalI以及PyrobestTMDNA聚合酶和T4DNA連接酶，寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、DNA純化回收盒，北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；cDNA合成試劑盒，Roche公司；辣根過(guò)氧化物酶、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖，北京索萊寶科技有限公司；苯酚、4-氨基安替比林，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖、蔗糖、纖維二糖、麥芽糖和過(guò)氧化氫，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 基因克隆與重組菌構(gòu)建

1.4 重組酶的制備與純化

參考畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)對(duì)上述重組菌進(jìn)行發(fā)酵，8 000 r/min離心15 min,收集上清液，于-20 ℃保存。發(fā)酵上清液經(jīng)飽和濃度為20%～80% (NH4)2SO4分級(jí)鹽析后，再以HiTrap Desalting PD-10脫鹽柱和Sephadex-100凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行純化。

1.5 重組低聚葡萄糖氧化酶活力測(cè)定

酶活測(cè)定參照LEE等的方法[18]進(jìn)行。1 mL反應(yīng)體系包括：稀釋酶液0.2 mL，0.1 mmol/L 4-氨基安替比林，1 mmol/L苯酚，1 mmol/L乳糖，0.05 U辣根過(guò)氧化物酶，0.1 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.0)。55 ℃水浴中反應(yīng)30 min，冰浴5 min終止反應(yīng)，測(cè)定500 nm下吸光度。以不加底物的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照組。酶活定義：每分鐘氧化底物生成1 μmol過(guò)氧化氫的酶量為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.6 重組酶酶學(xué)性質(zhì)與特征分析

1.6.1 最適溫度的測(cè)定

在不同溫度(40、45、50、55、60、65、70、75、80和85 ℃)下測(cè)定其酶活力，以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活，考察溫度對(duì)重組酶活力的影響。

1.6.2 溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

將酶液分別置于55、65、75、85和95 ℃下保溫4 h，間隔1 h取樣，按照1.5方法測(cè)定殘余酶活，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.6.3 最適pH的測(cè)定

分別以0.1 mol/L磷酸-檸檬酸(pH 5.0～8.0)和碳酸鈉-碳酸氫鈉(pH 9.0～10.0)替換1.5方法中的緩沖液，測(cè)定不同pH條件下的酶活力，以最高的酶活力計(jì)為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，考察pH值對(duì)酶活的影響。

1.6.4 pH穩(wěn)定性的測(cè)定

將酶分別置于不同pH(5.0～10.0)的緩沖液中(終濃度一致)，室溫放置4 h，間隔1 h取樣，測(cè)定殘余酶活。以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.6.5 金屬離子對(duì)酶的影響

在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1 mmol/L的Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe3+、Ba2+、Co2+、Cu2+、Na+、Mn2+和K+，測(cè)定其酶活力，以未加金屬離子的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.6.6 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

以不同濃度(1、5、10、15、20 mmol/L)的乳糖為底物，在重組酶的最適作用溫度和pH條件下進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定酶活。采用雙倒數(shù)法(Lineweaver-Burk)作圖，計(jì)算米氏常數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax。

1.6.7 底物特異性分析

分別以終濃度1 mmol/L的葡萄糖、木糖、半乳糖、乳糖、纖維二糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖為反應(yīng)底物，測(cè)定酶活。以最適底物的酶活力為100%，計(jì)算其他底物的相對(duì)酶活。

1.7 生物信息學(xué)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得不同來(lái)源的Goox氨基酸序列，利用軟件Clustal X2和Bioedit 7.0.9對(duì)這些序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并通過(guò)MEGA 4.0鄰近法構(gòu)建Goox進(jìn)化樹(shù)，分析它們親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉基因組中存在疑似goox基因讀框

根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道的Goox序列Goox-vn和Goox-T1，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)黑曲霉基因組序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，黑曲霉基因組中存在一個(gè)疑似goox的開(kāi)放讀框，進(jìn)一步對(duì)來(lái)源于黑曲霉的Goox(命名為AnGoox)和Goox-vn、Goox-T1進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果如圖1所示。

AnGoox與Goox-vn和Goox-T1的相似度分別為28.98%和28.71%。在它們的氨基酸序列中，都包含2個(gè)較為保守的結(jié)構(gòu)域，一段位置在37～174之間，長(zhǎng)度為137的FAD結(jié)合域，其起始基序?yàn)?PAAI)。另一段在結(jié)尾處長(zhǎng)度約為44的黃素結(jié)構(gòu)域。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，可知與FAD進(jìn)行雙共價(jià)連接的關(guān)鍵氨基酸殘基為His80和Cys141。參與反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸殘基為Asp377和Try428，2個(gè)氨基酸引發(fā)底物的氫離子的轉(zhuǎn)移，從而降低FAD輔因子能量。

2.2 黑曲霉Goox基因的克隆

以黑曲霉F0215的cDNA為模板對(duì)Goox基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化和限制性?xún)?nèi)切酶XbaI酶切后，與經(jīng)SnaBI和AvrII酶切的pPIC9K載體連接，通過(guò)NcoI酶切，驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的正確性，獲得重組質(zhì)粒pPIC-goox。經(jīng)序列測(cè)定與分析發(fā)現(xiàn)，goox編碼的氨基酸序列與黑曲霉CBS513.88基因組相應(yīng)序列有2個(gè)堿基的差異，在1310和1410位上，F(xiàn)0215來(lái)源的堿基為G和A，參照菌株CBS513.88為A和C，導(dǎo)致2個(gè)氨基酸不同(G437E和Q467P)，但其對(duì)酶催化活性中心(H80、C141、D377、Y428)無(wú)影響(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。

利用MEGA 4.0將不同來(lái)源的Goox的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖2)，此進(jìn)化樹(shù)反映了不同來(lái)源的Goox之間的遺傳距離，AnGoox與其他來(lái)源的Goox相似度為28.91%～97.46%，其中，AnGoox與已報(bào)道的Goox-T1分屬于不同分支，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AnGoox的氨基酸與A.piperis中的Goox的相似度為97.46%。

2.3 重組Goox的表達(dá)與純化

pPIC-goox重組質(zhì)粒經(jīng)SalI進(jìn)行線(xiàn)性化轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115中，通過(guò)G418抗性平板篩選高拷貝。獲得重組菌GS115(pPIC-goox)。在250 mL搖瓶發(fā)酵120 h后，檢測(cè)發(fā)酵液上清酶活，其Goox活力最高為5 mU/mL，因此確認(rèn)該酶為Goox。

經(jīng)硫酸銨沉淀和Sephadex-100凝膠色譜純化后，比酶活為0.33 U/mL，純化倍數(shù)和回收率分別為16.5和34.7%。進(jìn)一步經(jīng)SDS-PAGE分析，蛋白大小約為61 kDa(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))，略高于理論值，分析可能存在N-糖基化[16]。

2.4 AnGoox酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

溫度對(duì)AnGoox的活力和穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖3。AnGoox的最適作用溫度為75 ℃，在70～80 ℃范圍內(nèi)，其相對(duì)酶活在75%以上(圖3-a)；在85 ℃保溫4 h，剩余酶活力在70%以上，在95 ℃保溫4 h，剩余酶活降至約30%(圖3-b)。目前已報(bào)道的Goox的最適反應(yīng)溫度在37～55 ℃之間，S.strictum和Paraconiothyriumsp.來(lái)源的Goox在20～50 ℃條件下分別孵育1 h和24 h后，酶活維持在100%，但高于50 ℃酶活力迅速降低，S.strictum的Goox在60 ℃孵育1 h后，殘余酶活僅剩15%，Paraconiothyriumsp.的Goox在60 ℃孵育24 h后，殘余酶活僅為45%[13-14,16]?？梢?jiàn)，AnGoox的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性均顯著高于已報(bào)道的同類(lèi)酶。

2.4.2 最適pH和pH穩(wěn)定性

pH對(duì)AnGoox的活力和穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖4。AnGoox在pH 9.0下表現(xiàn)出最高的酶活力，pH改變則酶活迅速下降，在pH 7.0和pH 10.0下，酶活均降至約40%(圖4-a)。在pH 5.0～9.0保溫4 h后，剩余酶活在70%以上，顯示出較好的pH耐受能力(圖4-b)。AnGoox的最適pH與pH穩(wěn)定性均與來(lái)源于S.strictum的Goox(最適pH=10.0，在pH為5～11條件下，孵育1 h酶活維持在100%)相似[13-14]。

2.4.3 不同金屬離子對(duì)酶活的影響

如表1所示，多種金屬離子均對(duì)AnGoox表現(xiàn)出激活或者抑制作用，1 mmol/L 的Mn2+對(duì)酶活有較為明顯的促進(jìn)作用，而相同濃度的Fe3+、Ca2+和Ba2+對(duì)酶活的抑制作用最為強(qiáng)烈。與來(lái)源于S.strictum的低聚葡萄糖氧化酶相比，Zn2+對(duì)S.strictum的Goox具有促進(jìn)作用，而對(duì)AnGoox具有抑制作用[14]。

2.4.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以不同濃度(1、5、10、15、20 mmol/L)的乳糖為底物，在最適溫度和pH條件下測(cè)定酶活，采用雙倒數(shù)法，繪制AnGoox的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，如圖5所示，求得AnGoox的Km值為0.48 mmol/L，Vmax為2.22 μmol/(L·min)。該酶的Km高于Paraconiothyriumsp.的Goox(0.11 mmol/L)[13]和S.strictum的Goox(0.066 mmol/L)[18]，說(shuō)明AnGoox對(duì)乳糖底物的親和力低于前期報(bào)道的2種酶。

2.4.5 底物特異性研究

分別以10種不同的糖作為底物，研究AnGoox特異性，結(jié)果如圖6。在10種底物中，AnGoox的氧化能力從高到低依次為麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽五糖、乳糖、纖維二糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、半乳糖。該酶與S.strictum的Goox底物特異性相似，都具有對(duì)單糖、雙糖和麥芽低聚糖的氧化能力[16,18]。AnGoox對(duì)麥芽低聚糖氧化能力優(yōu)于來(lái)自S.strictum的Goox，顯示該酶為酶法制備低聚糖酸提供新的可能。

3 結(jié)論

本研究首次鑒定了黑曲霉來(lái)源的低聚葡萄糖氧化酶，并成功在畢赤酵母中異源表達(dá)，系統(tǒng)的酶學(xué)性質(zhì)解析為其后續(xù)應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)材料。