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    環(huán)境中產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

    2020-01-06 07:29:52劉靜劉張虎張雨霏
    生物化工 2019年6期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)酶酪蛋白氮源

    劉靜,劉張虎,張雨霏

    (湖北大學知行學院,湖北武漢430011)

    蛋白酶是能夠催化蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)分解的一類酶,其在工業(yè)用酶制劑中所占比例高達70%,在食品、釀造、醫(yī)藥、制革、絲綢脫膠等方面有著廣泛的應用[1]。蛋白酶在食品行業(yè)的應用主要是在烘焙、奶制品與豆制品加工過程或是紅酒、醬油的釀造中使用,在醫(yī)藥方面蛋白酶可以用于生產(chǎn)消炎劑、消化劑、高營養(yǎng)的注射用水等,在輕工業(yè)中可以用于絲綢脫膠、廢膠片的回收利用以及皮革皮毛脫毛軟化等工藝中[2]。同時蛋白酶也可以用于制造洗滌劑,其作為一種生物大分子對環(huán)境的危害遠小于普通的洗滌劑,從而減少了水體富營養(yǎng)化等問題,因此也被廣泛應用于環(huán)保行業(yè)中[3]。

    土壤中的微生物種類繁多,易于從中篩選出產(chǎn)蛋白酶的菌株。本實驗從學校周邊垃圾場淤泥、食堂排污水溝等含蛋白量較高的土壤中取樣,篩選分離出多個產(chǎn)蛋白酶菌株,通過復篩和蛋白酶酶活力測定,挑選出產(chǎn)酶活力較高的菌株,并改善該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基部分成分,對篩選出的產(chǎn)蛋白酶菌株的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化。

    1 實驗材料

    1.1 土壤樣本及菌種

    本實驗所使用土壤樣本采集自湖北大學知行學院周邊,取樣地主要為食堂排水渠污泥、餐館垃圾處理處和學生公寓垃圾堆放處附近土壤。

    土壤樣品中篩選得到并優(yōu)化培養(yǎng)的菌株為一株短桿細菌。

    1.2 試劑

    干酪素、氯化鈉(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司;牛肉膏、蛋白胨(均為生物試劑):北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;瓊脂粉(生物試劑):上海山浦化工有限公司;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉(均為分析純):天津市廣成化學試劑有限公司;胰蛋白胨(生物試劑):北京奧博星生物技術(shù)有限公司;酵母提取物(分析純):OXOID;葡萄糖、乳糖、蔗糖(均為分析純):上海展云化工有限公司;果糖(生物試劑):上海展云化工有限公司。

    1.3 儀器及設(shè)備

    7200型可見分光光度計:上海尤尼科儀器有限公司;SW-CJ-ZD型無菌操作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司;TCYQ型恒溫搖床:太倉市實驗設(shè)備工廠;DH-9162型恒溫培養(yǎng)箱:上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

    1.4 培養(yǎng)基

    (1)酪素培養(yǎng)基:0.3%牛肉膏,1.0%干酪素(加入少許1mol/LNaOH溶液加熱助溶),0.5%NaCl,2.0%瓊脂,pH7.4~7.8。

    (2)LB固體培養(yǎng)基:1.0%胰蛋白胨,1.0%NaCl,0.5%酵母提取物,1.5%瓊脂,pH7.0。

    (3)發(fā)酵培養(yǎng)基:0.5%酵母提取物,1.0%胰蛋白胨,2.0%葡萄糖,0.5%NaCl,0.3%K2HPO4,0.7%KH2PO4。

    (4)葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基:0.75g蛋白胨,0.75g葡萄糖,0.3gK2HPO4,150 mL H2O,pH7.0~7.2,過濾。

    (5)淀粉水解培養(yǎng)基:1.0%蛋白胨,0.2%可溶性淀粉,1.5%NaCl,0.5%牛肉膏,2.0%瓊脂。

    (6)糖發(fā)酵培養(yǎng)基:2.0%蛋白胨,10.0%糖類(葡萄糖、乳糖或蔗糖),0.5%NaCl,0.2%KH2PO4,0.03%溴麝香草酚藍(加入少量95%乙醇溶解)[4]。

    2 實驗方法

    2.1 菌株富集與初篩

    每份土壤樣品加入無菌水稀釋,取稀釋液各0.1 mL均勻涂布于LB平板中,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~36h后觀察菌落生長狀況,并挑選出清晰的單菌落在斜面培養(yǎng)基進行劃線培養(yǎng)。將分離出的菌株點樣接種于酪素培養(yǎng)基上,挑選出菌落周圍有透明圈的菌株,將其接種于LB平板上進一步劃線分離出單菌落[5]。

    2.2 菌株復篩

    將初篩所得菌株點樣接種于酪素平板上,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后挑選出5個透明圈與菌落直徑比比值較大的菌株,接種于50 mLLB液體培養(yǎng)基中,在37℃、200r/min的搖床中培養(yǎng)24h后以1%的轉(zhuǎn)接量分別接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,在搖床中培養(yǎng)24h后取發(fā)酵液在4000r/min下離心10min,取上清液作為待測酶液進行蛋白酶酶活的測定[6]。

    2.3 蛋白酶酶活的測定

    本實驗采取的酶活測定方法改良自考馬斯亮藍G-250蛋白質(zhì)定量測定法,取不同濃度的酪蛋白溶液分別加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液,以不含酪蛋白的試管作為空白對照,測定595 nm處吸光度,以酪氨酸濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。首先繪制酪蛋白標準曲線。將發(fā)酵液以4 000 r/min離心10 min,取上清液作為待測酶液。在試管中加待測酶液1 mL,37℃下預熱5 min,再依次加入1mol/LNaOH溶液0.5 mL、0.2%酪蛋白溶液1 mL,37℃水浴10 min,取1 mL反應液加5 mL考馬斯亮藍G250,5 min后于波長595 nm測吸光值[7]。以粗酶液加底物直接煮沸再加考馬斯亮藍G-250反應作為空白對照[8]。

    酶活(U)定義:在37℃每毫升發(fā)酵液每分鐘能夠分解的酪蛋白含量(μg)為1個酶活力單位。

    酶活(U/mL)=A×K×N×0.25

    其中,A表示吸光值,N表示酶液稀釋倍數(shù),K表示吸光常數(shù)。

    2.4 菌株的生長曲線和產(chǎn)酶曲線

    從斜面中挑取篩選出的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中活化,在37℃、200 r/min的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)12 h后作為種子液使用。分別吸取0.5%、0.25%、0.1%種子液接種到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中,在37℃、200 r/min的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng),每隔2h取樣,測定培養(yǎng)液OD600值,并繪制菌株生長曲線[9]。

    吸取1%種子液轉(zhuǎn)接至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,在37℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h,每隔6 h取樣測定蛋白酶酶活力,并繪制菌株產(chǎn)酶曲線[10]。

    2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

    2.5.1 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

    將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中2%的葡萄糖分別替換成2%的可溶性淀粉、蔗糖、乳糖和果糖,吸取1%的種子液加入含有不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)1d后分別取樣測定酶活力,以酶活力最高的培養(yǎng)基中的碳源作為最適碳源[11]。

    2.5.2 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

    將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中1%的蛋白胨分別替換成1%的尿素、牛肉膏、硫酸銨和硝酸鉀,吸取1%種子液加入含有不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)1d后分別取樣測定酶活力,以酶活力最高的培養(yǎng)基中的氮源作為最適氮源。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩

    經(jīng)LB培養(yǎng)基富集培養(yǎng)后,從平板上挑選50份單菌落進行初篩,初篩發(fā)現(xiàn)有19個菌株在菌落周圍形成明顯可見的透明圈,通過對這19個菌株的透明圈與菌落直徑比值的對比,挑選出5個比值較大的菌株進行復篩。這5個菌株分別為菌株A9、A20、A23、A28、A40。

    3.2 酪蛋白標準曲線

    酪蛋白標準曲線,該曲線線性回歸方程為:Y=0.069 3X+0.066 8,R2=0.991,其中縱坐標Y表示吸光值OD595,橫坐標X表示其對應的酪蛋白含量。在酪蛋白含量為0~10 μg/mL的范圍內(nèi),兩者具有良好的線性關(guān)系,當OD595值為1時,酪蛋白含量為13.5 μg/mL,即吸光常數(shù)K=13.5。

    3.3 產(chǎn)蛋白酶菌株的復篩

    分別對菌株A9、A20、A23、A28、A40進行搖瓶發(fā)酵復篩,取發(fā)酵液進行酶活測定。菌株A9、A20、A23、A28、A40的酶活分別為1.24 U/mL、1.83 U/mL、1.81 U/mL、2.03 U/mL、1.62 U/mL,其中菌株A28的透明圈直徑與菌落直徑的比值為10,酶活最高。

    3.4 菌株的形態(tài)觀察

    菌株A28在LB培養(yǎng)基上,菌落呈乳白色不透明狀,表面光滑,中間微凸,邊緣圓潤,具有少許黏性,易于挑取。在油鏡下觀察到菌株A28為短桿狀細菌。菌株A28可以分解利用葡萄糖、乳糖、蔗糖,不產(chǎn)酸;甲基紅反應呈陰性;淀粉水解實驗呈陽性,表明該菌株可產(chǎn)生分解淀粉的酶;接觸酶測定呈陽性,表明該菌株可產(chǎn)生過氧化氫酶;無芽孢;為革蘭氏陽性菌。

    3.5 菌株生長曲線和產(chǎn)酶曲線

    如圖1所示,菌株A28在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)典型的微生物生長曲線。由于0.1%的種子液接種量較少,菌株的生長周期較短。菌株A28在前6 h快速增長,然后進入穩(wěn)定期,在12 h時達到峰值,然后菌體開始衰亡。

    圖1 菌株A28的生長曲線

    如圖2所示,菌株A28的產(chǎn)酶曲線前期呈現(xiàn)上升趨勢,產(chǎn)酶量逐漸升高,在30 h時產(chǎn)酶量達到峰值,然后開始下降。

    3.6.1 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

    如圖3所示,乳糖作為碳源時,A28酶活力最高,葡萄糖、果糖、蔗糖次之,而可溶性淀粉作為碳源時酶活最低。由此可知,菌株A28的最適碳源為乳糖。

    圖2 菌株A28的產(chǎn)酶曲線3.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

    3.6.2 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

    如圖4所示,尿素作為氮源時酶活力顯著高于其余4種氮源,牛肉膏、硫酸銨和蛋白胨次之,而硝酸鉀作為氮源時明顯酶活力較低。由此可知,尿素可為菌株A28的最適氮源。

    圖3 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

    圖4 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

    4 結(jié)論

    本實驗從6份不同來源的土壤樣品中初篩分離出19株能夠產(chǎn)生蛋白酶的菌株。經(jīng)過透明圈與菌落比值大小的比對,以及發(fā)酵產(chǎn)酶復篩進行酶活力測定后,篩選出一株產(chǎn)酶活力較高的菌株A28。通過對發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和氮源的初步優(yōu)化,得到菌株A28的最適碳源為乳糖,最適氮源為尿素。初步優(yōu)化后的發(fā)酵條件為:0.5%酵母提取物、1.0%尿素、2.0%乳糖、0.5%NaCl、0.3%K2HPO4、0.7%KH2PO4,最佳培養(yǎng)時間為30h,溫度為37℃。

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