血管內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定及其促血管新生機(jī)制的研究進(jìn)展

潘天岳，劉 浩，符偉國，董智慧

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血管外科，上海 200032

母體懷孕3周內(nèi)，卵黃囊和母體循環(huán)系統(tǒng)通過彌散的方式為胚胎提供營養(yǎng)和氧氣。3周后，中胚層的血島結(jié)構(gòu)開始形成原始脈管系統(tǒng)[1]。血島中央為造血干細(xì)胞群，周圍少量細(xì)胞為血管母細(xì)胞或更早期的干細(xì)胞群，兩者可能有共同的前體，即血液母細(xì)胞。通常認(rèn)為，血島周圍的內(nèi)皮母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮祖細(xì)胞后最終分化為內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)，組建毛細(xì)血管網(wǎng)，在所處的內(nèi)環(huán)境作用下塑形為動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管系統(tǒng)。

出生后，血管新生的主要參與者為機(jī)體局部原有的ECs。ECs在一定誘因(如組織損傷、缺氧、缺血、炎癥)作用下發(fā)生增殖和遷移，形成新的微血管結(jié)構(gòu)[2]。1997年，Asahara等[3]從人外周血中分離出表達(dá)CD34的單個(gè)核細(xì)胞，其在體外培養(yǎng)后可增殖并傳代，同時(shí)CD31、TIE-2等內(nèi)皮特異性標(biāo)志物增加，形態(tài)與ECs相似；在小鼠缺血模型上進(jìn)行尾靜脈注射后，該細(xì)胞群定植于肌纖維間的新生微血管周圍，其中部分參與微血管的形成。該研究團(tuán)隊(duì)將該細(xì)胞群稱為 “EC progenitors”，為從成人體內(nèi)分離和鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的最早研究成果。

1 EPCs的鑒定方法

1.1 纖維連接蛋白(FN)培養(yǎng)分離 使用包被FN的培養(yǎng)板接種外周血單個(gè)核細(xì)胞，48 h后去除不貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞中能吞噬低密度脂蛋白并與植物凝集素結(jié)合者可鑒定為EPCs。這種方法簡單易行、成本低，但是存在細(xì)胞群混雜，其中大多數(shù)細(xì)胞為外周血單核-巨噬細(xì)胞[4]的缺點(diǎn)。而外周血單核-巨噬細(xì)胞既表達(dá)低密度脂蛋白受體和清道夫受體，也能吞噬低密度脂蛋白。因此，這種方法分離的EPCs純度較低，不利于在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中精確地分析EPCs的功能。

1.2 熒光激活或免疫磁珠分選 使用熒光激活分選系統(tǒng)(FACS)或免疫磁珠分選法分離EPCs。其原理為使用偶聯(lián)熒光素或磁珠的單克隆抗體，將其與表達(dá)相關(guān)抗原的細(xì)胞結(jié)合，再通過分選系統(tǒng)識別被標(biāo)記的細(xì)胞并從外周血中分離出來[5]。因此，這種方法的準(zhǔn)確性依賴于對抗體的選擇。其中，最經(jīng)典的抗體組合是由Peichev等[5]及Timmermans等[6]提出的CD34+CD133+VEGRF2+，該組合引起了廣泛關(guān)注。然而，Case等[7]指出，通過這個(gè)組合分離出的細(xì)胞群最終形成表達(dá)特異性抗原CD45的造血干細(xì)胞群落，而非EPCs群落。Duda等[8]提出了CD34+CD31+CD45-CD133+組合，并通過流式細(xì)胞術(shù)在外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離出了該細(xì)胞群落，其占單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)的0.01%～0.20%?？傊?，通過抗體介導(dǎo)的分選方法簡單、快速，分選結(jié)果在不同個(gè)體的標(biāo)本中具有較高的一致性。但是，目前研究者們?nèi)晕凑业紼PCs特異性的表面抗體，使該分選方法精確性降低。

1.3 內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(endothelial colony forming cells，ECFCs)鑒定法 該方法由Yodar等提出，相較于前2種方法，該方法更側(cè)重于ECs功能學(xué)檢測[9-10]。具體方法為從外周血、骨髓或臍帶血中分離單個(gè)核細(xì)胞后，將其接種于包被了FN的培養(yǎng)皿上，用含5%～10%胎牛血清的促血管內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(如EGM-2)培養(yǎng)24～48 h后，去除未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)生長，14～21 d內(nèi)出現(xiàn)的典型“鋪路石”樣細(xì)胞集落即ECFCs。

ECFCs除具有已知的全部EPCs特性外，還表達(dá)ECs的標(biāo)志性表面抗原，且不表達(dá)任何白細(xì)胞和髓系標(biāo)志物[11]。ECFCs具有較強(qiáng)的增殖能力，在體外成小管實(shí)驗(yàn)中能形成內(nèi)皮樣管樣結(jié)構(gòu)，且在動(dòng)物模型中參與微血管的形成[12-13]。因此，ECFCs常被認(rèn)為是EPCs家族中的主要成員，甚至能代表EPCs。另有研究[14]將ECFCs稱為晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(LEPCs)或OECs(outgrowth endothelial cells)。最近一項(xiàng)研究[15]顯示，在ECFCs群落中，可分離出CD34+和CD34-細(xì)胞。大部分CD34+ECFCs有較強(qiáng)的自我更新能力，以及高水平的Notch信號通路蛋白，使細(xì)胞周期處于G0/G1期；而CD34-ECFCs大多處于S/G2M期，更接近于分化成熟的ECs，自我更新能力和集落形成能力弱，但增殖能力強(qiáng)[11]。這提示可以從基因及細(xì)胞周期水平鑒定EPCs。

2 EPCs的來源

自從1997年Asahara等提出出生后EPCs的概念后，有關(guān)成人體內(nèi)EPCs的來源一直存在爭議。目前，一般認(rèn)為外周血EPCs可能同時(shí)來源于骨髓造血系干細(xì)胞和外周或骨髓組織的的非造血系干細(xì)胞[16]。

來源于骨髓造血系的EPCs與造血干細(xì)胞可能有相同的前體細(xì)胞，如血液母細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)與造血干細(xì)胞相同的抗原CD34、CD133等。在使用ECFCs法培養(yǎng)48 h后分離出的不貼壁細(xì)胞繼續(xù)生長5～7 d可形成集落形成單位(colony-forming units, CFU)，這些細(xì)胞被稱為CFU-ECs，或早期EPCs。這些細(xì)胞表達(dá)CD14、CD45等髓系細(xì)胞表面抗原，形態(tài)呈紡錘樣或多邊形，能夠分泌大量的促血管新生細(xì)胞因子，但很少融合入ECs形成的血管網(wǎng)[12]。此外，有研究[17-18]發(fā)現(xiàn)有些造血系來源的EPCs并不形成CFU，但有潛力在體外或體內(nèi)形成血管樣結(jié)構(gòu)。一些研究[19-20]甚至發(fā)現(xiàn)，來自髓系的單核-巨噬系統(tǒng)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞可在特定微環(huán)境下形成血管內(nèi)皮。目前已報(bào)道的來自骨髓造血系的EPCs種類豐富，這些EPCs可能均由髓系干細(xì)胞分化而成。

非造血系來源的EPCs不表達(dá)或極少表達(dá)CD14和CD45，且經(jīng)體外培養(yǎng)后，其形態(tài)和功能學(xué)與造血系來源的EPCs也不同。Yodar等[21]分離出的ECFCs是非造血系來源的EPCs，而可能直接來源于外周器官的血管壁。Fang等[22]發(fā)現(xiàn)，這些存在于血管壁的EPCs表達(dá)CD117。Schniedermann等[23]從小鼠肺組織微血管分離ECFCs，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的形成血管和淋巴管的潛能。Rapp等[24]從胎盤上分離出ECFCs，其不表達(dá)CD34和CD45表面抗原，并且顯示出比臍血ECFCs更強(qiáng)的血管生成能力。

上述研究表明，CFU-ECs和其他大量表達(dá)CD14或CD45的EPCs來源于骨髓造血系干細(xì)胞，而ECFCs來源于外周器官的血管壁和骨髓非造血系干細(xì)胞。

3 EPCs參與出生后血管新生的機(jī)制

Asahara等[3]發(fā)現(xiàn)，靜脈注射的外周血CD34+單個(gè)核細(xì)胞可以在小鼠缺血肢體中直接融合入新生微血管管壁，有些直接形成微血管；而CD34-單個(gè)核細(xì)胞聚集在肌纖維周圍，不參與微血管形成。Schatteman等[25]在糖尿病免疫缺陷小鼠的肢體缺血模型中，經(jīng)肌肉注射植入人CD34+細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血肢體血流灌注加速恢復(fù)。上述研究提示部分EPCs通過融合入新生微血管壁來促進(jìn)其生成，增加血流灌注。這些直接參與新生血管形成的EPCs的來源一直是研究重點(diǎn)[25]。HU等[26]將BALB/c小鼠的動(dòng)脈移植入C57BL/6/TIE2-LacZ小鼠后，觀察到宿主骨髓來源的表達(dá)β-Gal+的細(xì)胞參與供體血管壁的內(nèi)皮增生。有研究[27-28]在下肢缺血和心肌缺血造成的損傷組織中也觀察到骨髓來源的EPCs直接參與血管新生。Perry等[29]用來自C57BL/6J小鼠的骨髓細(xì)胞移植入eNOS-/-小鼠，4周后僅在血液中和血管周圍發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞，而未在血管內(nèi)皮中發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞嵌合，提示骨髓EPCs不直接參與正常衰老的ECs自我更新。而Aicher等[30]在異種共生態(tài)模型和Lacz+供體/Lacz-受體模型中發(fā)現(xiàn)，供體動(dòng)物非骨髓來源的EPCs直接參與受體動(dòng)物肢體缺血后的血管內(nèi)皮再生，比例高于骨髓來源的EPCs。由此可見，骨髓和非骨髓來源的EPCs都能直接參與組織損傷后新生血管內(nèi)皮的形成，而非骨髓來源的EPCs可能直接參與衰老血管內(nèi)皮的更新。

除直接參與血管內(nèi)皮形成外，EPCs旁分泌細(xì)胞因子也可促進(jìn)血管新生。Urbich等[31]用基因微陣列技術(shù)對比了人外周血EPCs、臍靜脈ECs和微血管ECs的促血管新生相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)、VEGF-B、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)和類胰島素生長因子(insulin-like growth factor-1, IGF-1)的mRNA在EPCs中的表達(dá)量明顯高于ECs；在EPCs培養(yǎng)液中，這些細(xì)胞因子含量也較高。Miyamoto等[32]從骨髓中分離出高表達(dá)VEGF-A、成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)和肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的細(xì)胞亞群，說明這些起旁分泌作用的EPCs部分來源于骨髓。研究[33-34]在動(dòng)物缺血模型中發(fā)現(xiàn)，植入的EPCs停留于微血管壁外，周圍有大量VEGF，提示EPCs在損傷組織內(nèi)通過旁分泌細(xì)胞因子促進(jìn)血管新生。Sahoo等[35]發(fā)現(xiàn)，人外周血CD34+細(xì)胞能分泌促血管新生的外泌體；體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，新生血管形成與外泌體含量呈劑量依賴關(guān)系。外泌體中除包含生長因子和促血管新生因子外，還包含微小RNAs(miRNAs)。研究[36]證實(shí)，miRNAs可以通過表觀遺傳學(xué)方式調(diào)控EPCs的旁分泌作用，促進(jìn)血管新生?？傊糠諩PCs可能通過旁分泌生長因子、細(xì)胞因子和外泌體誘導(dǎo)周圍ECs遷移和增殖，促進(jìn)新生血管形成；EPCs可能來源于骨髓造血系統(tǒng)。EPCs參與新生血管形成的機(jī)制見圖1。

近期，Yodar等[37-38]將上述2種機(jī)制進(jìn)行了統(tǒng)一：造血系來源的EPCs首先歸巢至缺血或損傷的組織，然后通過旁分泌促血管新生因子招募血液中及周圍組織中的ECFCs至損傷處，直接介入血管內(nèi)皮形成，并進(jìn)一步通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)已有ECs增殖和自我更新。基于這種理論，組織損傷的修復(fù)能力可能取決于局部ECFCs的含量。腎臟微血管ECs增殖能力較弱，表現(xiàn)為急性腎損傷后組織內(nèi)血管新生極少，而有的器官ECs體外培養(yǎng)時(shí)則表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖能力[39]，可能提示不同器官內(nèi)ECFCs數(shù)量差別較大。

如前所述，造血系來源的EPCs需要?dú)w巢至損傷組織才能進(jìn)一步發(fā)揮作用。而在歸巢前，這些細(xì)胞須經(jīng)歷動(dòng)員、遷移、黏附等步驟。Dawei等[40]總結(jié)了這些過程所涉及的細(xì)胞及相關(guān)分子機(jī)制：組織損傷后向血液中釋放VEGF、SDF-1等細(xì)胞因子，通過SDF-1/CXCR4軸或eNOS/NO/MMP-9/kitL軸使骨髓造血系EPCs與骨髓間質(zhì)細(xì)胞脫離，并向外周血遷移；EPCs順SDF-1濃度梯度向損傷組織處遷移，通過整聯(lián)素和P選擇素黏附和定植于損傷的血管內(nèi)皮，進(jìn)一步通過旁分泌作用促進(jìn)血管生成。阿卡波糖、維生素D等藥物可通過直接或間接增強(qiáng)以上途徑來增強(qiáng)EPCs的促血管新生作用[41]。總之，骨髓來源的EPCs是修復(fù)組織損傷的先驅(qū)，為ECFCs和其他EPCs提供了增殖和分化的有利環(huán)境，且同時(shí)促進(jìn)原有ECs的遷移和增殖。

圖1 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分化過程及促進(jìn)出生后血管新生機(jī)制

4 總結(jié)與展望

EPCs的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了出生后血管新生領(lǐng)域的空白。隨后，其來源、作用和促進(jìn)血管新生的機(jī)制逐漸獲得深入研究。大量動(dòng)物缺血和組織損傷模型驗(yàn)證了EPCs修復(fù)組織和血管再生的能力，為臨床上基于EPCs的治療性血管新生提供了理論依據(jù)。由于近年來發(fā)現(xiàn)單純的EPCs移植常達(dá)不到預(yù)期的治療目標(biāo)，在此基礎(chǔ)上加強(qiáng)EPCs的促血管新生作用的方法逐漸被探討，如在移植前缺氧預(yù)處理EPCs[42]或采用微應(yīng)力刺激促進(jìn)EPCs增殖[43]。隨著EPCs研究的不斷深入，相信EPCs在臨床上將得到更廣泛的應(yīng)用。