硫酸新霉素及相關(guān)物質(zhì)體外抗菌活性與毒性的研究*

朱曉玥，黃敏文，趙述強(qiáng)，張 玫，時(shí) 樂，袁耀佐**

1 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019；2 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品雜質(zhì)譜研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210019；3 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023

硫酸新霉素為氨基糖苷類抗生素，能有效抑制革蘭陰性菌，為國(guó)內(nèi)外臨床上常用的抗生素之一[1]。硫酸新霉素是從新霉素鏈霉菌的代謝產(chǎn)物中分離得到的混合物，主要成分為新霉素B 和C，以及少量新霉素A。新霉胺為硫酸新霉素產(chǎn)品的主要非活性雜質(zhì)，而巴龍霉素和核糖霉素作為工藝雜質(zhì)在新霉素中也有檢出[2]。硫酸新霉素有耳毒性和腎毒性，對(duì)人體健康危害較大。因此，在硫酸新霉素國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)過程中，按照雜質(zhì)譜控制（impurity profiles）理念“針對(duì)藥品中的每一個(gè)雜質(zhì)，依據(jù)其生理活性制定相應(yīng)的質(zhì)控限度”[3]，先建立用于硫酸新霉素雜質(zhì)譜的膜抑制LC-MS 方法，推定其他主要雜質(zhì)，共檢出12 個(gè)雜質(zhì)（另文發(fā)表），然后采用不同模型，考察硫酸新霉素及主要相關(guān)物質(zhì)的抗菌活性及毒性差異，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)控制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試藥

比濁儀（Densichek plus，生物梅里埃公司）；電子天平（XS205，梅特勒）；聽力檢測(cè)系統(tǒng)（TDT auditory systems，Tucker Davis Technologies Incorporated，Gainesville，F(xiàn)L，USA，軟件為powere Sig Gen32 software）；DP2-BSW 熒光顯微鏡（Olympus 公司）。

對(duì)照品：硫酸新霉素（批號(hào)130309-201512）、硫酸巴龍霉素（批號(hào)130371-200305）、硫酸核糖霉素（批 號(hào)130348-9301）、新霉胺（批 號(hào)130411-200908）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硫酸新霉素B（批號(hào)180803，純度66.007%）、硫酸新霉素C（批號(hào)180801，純度60.776%）均為宜昌三峽制藥有限公司提供。水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MHA，批號(hào)20180606）、水解酪蛋白培養(yǎng)基（MHB，批 號(hào)20180605）均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株

大腸桿菌（ATCC25922，批號(hào)E0006B）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923，批號(hào)A0246B）均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

健康SPF 級(jí)成年豚鼠（南京江寧青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0011）；斑馬魚胚胎以野生成魚交配獲得（國(guó)家斑馬魚資源中心）。

2 方法與結(jié)果

2.1 硫酸新霉素及相關(guān)物質(zhì)體外抗菌活性考察

2.1.1 常量肉湯稀釋法 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[4]，以硫酸新霉素為例：取32支無菌試管，分大腸桿菌組和金黃色葡萄球菌組，編號(hào)為1～16，各試管中供試品溶液的濃度（以主藥計(jì)）依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5、0.003 906 25 μg·mL-1。將供試菌分別先用MHB 培養(yǎng)基校正菌體濃度至0.5 麥?zhǔn)媳葷岫?，再用MHB 肉湯稀釋100倍至受試菌濃度約為5×105CFU/mL。另取兩管分別為陽性對(duì)照（不添加藥物只添加菌體）和陰性對(duì)照（只添加培養(yǎng)基，不添加藥物及菌體）。在1 至16 管和陽性對(duì)照管內(nèi)分別加入受試菌1 mL，混合均勻。將接種好的試管封口置37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察無明顯渾濁管及其相鄰澄清管所對(duì)應(yīng)的藥物濃度，即為最低抑菌濃度（MIC）區(qū)間。結(jié)果見表1。硫酸新霉素及相關(guān)物質(zhì)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性強(qiáng)弱順序均為：硫酸新霉素B＞硫酸新霉素＞硫酸新霉素C＞硫酸核糖霉素＞巴龍霉素＞新霉胺。

表1 各受試藥物最低抑菌濃度（MIC）

2.1.2 紙片擴(kuò)散法 結(jié)合CLSI 推薦的紙片擴(kuò)散法[5]及用2015 年版《中國(guó)藥典》四部抗生素微生物檢定法（通則1201）進(jìn)行抑菌效果檢測(cè)。分別將硫酸新霉素及相關(guān)物質(zhì)用MHB 肉湯配制成1.024 mg·mL-1的供試品溶液（均以主藥計(jì)）。精取上述供試品溶液2 μL 分別浸潤(rùn)藥敏紙片并晾干，將晾干后的各藥敏紙片放于含有敏感細(xì)菌的固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)18 h，測(cè)定抑菌圈直徑大?。ㄈ鐖D1）。硫酸新霉素及相關(guān)物質(zhì)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌體外抗菌活性強(qiáng)弱順序均為：硫酸新霉素B＞硫酸新霉素＞硫酸新霉素C＞硫酸核糖霉素＞巴龍霉素＞新霉胺，與常量肉湯稀釋法的結(jié)果吻合。

2.2 硫酸新霉素及成分B、C 對(duì)豚鼠聽力損傷考察

圖1 各供試品溶液的體外抗菌活性直觀對(duì)比圖（紙片擴(kuò)散法）

選體重250～350 g 雄性豚鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天，隨機(jī)分為空白組、硫酸新霉素組、硫酸新霉素B 組（下稱B 組）、硫酸新霉素C 組（下稱C 組）。各組每天分別腹腔注射，劑量為：硫酸新霉素組100mg·kg-1，B 組80mg·kg-1，C 組15mg·kg-1；給藥體積均為5mL·kg-1；空白組給予等體積的生理鹽水。各組常規(guī)飲食，避免其他聽力損傷因素的干擾，連續(xù)給藥28天。末次給藥后第2 天，受試動(dòng)物顱頂正中皮下為正極，給聲側(cè)耳廓后下為負(fù)極，接地電極于鼻翼。發(fā)出300 Hz 為主的短聲刺激信號(hào)，間隔90ms，帶通濾波50～3000Hz，疊加200 次，掃描時(shí)程20 ms。聲刺激強(qiáng)度從90 Db SPL 開始，以5 Db 逐次遞減，觀察Ⅰ波以判定兩側(cè)耳的ABR 聽閾值。結(jié)果顯示，與空白組比較，硫酸新霉素組和B 組ABR 聽閾值明顯升高，有顯著性差異（P＜0.01）；與空白組比較，C 組聽閾值未見明顯升高（P＞0.05）。與硫酸新霉素組比較，B 組ABR 聽閾值低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；C 組ABR聽閾值顯著低于硫酸新霉素組（P＜0.01）。見圖2。

圖2 硫酸新霉素及成分B、C 對(duì)豚鼠ABR 聽閾的影響

2.3 硫酸新霉素及成分B、C 對(duì)斑馬魚的毒性考察

2.3.1 斑馬魚藥物致死率研究 取成熟斑馬魚，黑暗10 h、照明14 h 條件下飼養(yǎng)，產(chǎn)卵時(shí)按雌雄1∶1 放入交配魚缸，獲取受精卵。實(shí)驗(yàn)挑選健康受精卵于6孔板中（試驗(yàn)前24 h 停止喂食）。實(shí)驗(yàn)分組同“2.2”項(xiàng)。給藥的3 個(gè)組給予系列濃度受試藥物，空白組加入小魚培養(yǎng)液。斑馬魚暴露給藥后每天以同樣濃度藥液換液1/2，分別在24、48、72 h 時(shí)間點(diǎn)觀察斑馬魚反應(yīng)及存活情況。結(jié)果顯示，在100～250μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，硫酸新霉素組與B 組在48 h 全部死亡；C組只有在濃度250 μg·mL-1下48 h 出現(xiàn)死亡，其他濃度72 h 才出現(xiàn)死亡。由于給藥3 天后幼魚基本死亡，故以72 h 為觀察終點(diǎn)。用χ2檢驗(yàn)（Fisher 精確概率法）對(duì)比各給藥組給藥72 h 后的累積死亡率，結(jié)果顯示，硫酸新霉素組的毒性與B 組相比，無顯著差異，兩組毒性均明顯高于C 組（P＜0.001，P＜0.001）。

2.3.2 斑馬魚器官毒性研究 實(shí)驗(yàn)分組同“2.2”項(xiàng)。取成熟斑馬魚，光照交替培養(yǎng)，產(chǎn)卵后選取健康胚胎，按每組給予30 枚胚胎，置于0.5、0.2、0.1 μg·mL-1不同濃度的試驗(yàn)藥物中，每天更換藥液1 次。胚胎發(fā)育至72 h 時(shí)，將測(cè)試液替換為人工海水，胚胎發(fā)育至第7 天時(shí)進(jìn)行毛細(xì)胞染色，在熒光顯微鏡下觀察毛細(xì)胞形態(tài)并拍攝。毛細(xì)胞染色結(jié)果顯示，0.5 μg·mL-1劑量的硫酸新霉素組和B 組即可對(duì)毛細(xì)胞產(chǎn)生較大破壞（毛細(xì)胞數(shù)量較少），而C 組各劑量對(duì)毛細(xì)胞影響不大。見圖3。

圖3 斑馬魚毛細(xì)胞染色結(jié)果 注：熒光點(diǎn)代表毛細(xì)胞

3 討論

3.1 體外抑菌活性的研究

常量肉湯稀釋法和紙片擴(kuò)散法為經(jīng)典的體外抗菌活性測(cè)定方法，具有操作簡(jiǎn)單、定性結(jié)果肉眼可見、無需特殊儀器判定等優(yōu)勢(shì)。本研究采用上述兩種方法研究了硫酸新霉素及成分B、C，新霉胺、核糖霉素及巴龍霉素的體外抗菌活性，獲得了它們的抗菌效果信息并相互驗(yàn)證了它們的抗菌活性的強(qiáng)弱順序。作為硫酸新霉素主要雜質(zhì)的新霉胺抗菌作用較弱，采用微生物檢定法按照平均裝量計(jì)算硫酸新霉素含量時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大偏差，提示應(yīng)該控制新霉胺的含量。而成分B、C 抗菌效果與硫酸新霉素略有差別，臨床應(yīng)用過程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注各自不良反應(yīng)，合理使用抗生素并作個(gè)體化治療。

3.2 動(dòng)物模型的毒性研究

氨基糖苷類抗生素的嚴(yán)重副作用為耳毒性，毛細(xì)胞為感受聲波刺激的感覺上皮細(xì)胞，ABR 的Ⅰ波起源于與毛細(xì)胞相連接的聽神經(jīng)樹突的突觸后電位，毛細(xì)胞的損傷會(huì)引起ABR 的Ⅰ波的變化[6]，因此ABR 是檢測(cè)聽覺系統(tǒng)損傷較為敏感的方法。在硫酸新霉素中，其成分B 約占80%，成分C 約占15%[7]，本次實(shí)驗(yàn)為客觀評(píng)估B、C 在硫酸新霉素引起的耳毒性中所帶來影響的大小，故按照此比例設(shè)定劑量。結(jié)果顯示，C 組ABR 聽閾值與空白組相當(dāng)，硫酸新霉素組和B 組ABR 聽閾值明顯升高。有理由推測(cè)，成分B 是引起硫酸新霉素耳毒性副作用的主要因素。

斑馬魚因具有與哺乳動(dòng)物相似的生物結(jié)構(gòu)及生理功能而被廣泛用于毒理學(xué)研究[8]。結(jié)合藥物致斑馬魚死亡率和器官毒性的結(jié)果，3 種物質(zhì)的毒性排序?yàn)榱蛩嵝旅顾兀綛＞C，與豚鼠聽力損傷的研究結(jié)果一致，由此可進(jìn)一步推測(cè)成分B 是硫酸新霉素中的主要毒性所在，而成分C 的毒性較弱。

3.3 對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高的一些思考

綜合體外抗菌活性及毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明新霉胺抑菌作用較弱，成分C 的毒性與空白組相當(dāng)，成分B 比硫酸新霉素毒性較低，提示可能存在其他毒性雜質(zhì)。EP9.0 版采用HPLC-PAD 法測(cè)定硫酸新霉素的有關(guān)物質(zhì)并明確了相關(guān)雜質(zhì)限度[9]。2015 年版《中國(guó)藥典》僅采用薄層色譜法對(duì)硫酸新霉素原藥中的新霉胺控制限度[10]，與國(guó)外藥典比較存在較大差距。隨著雜質(zhì)譜控制理念廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)，結(jié)合硫酸新霉素有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的啟示，建議在硫酸新霉素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加對(duì)有關(guān)物質(zhì)的控制，明確新霉素C、新霉胺、單雜及總雜的限度，提高該藥質(zhì)量。