中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

陳玉年，顧兵，李華南

中性粒細(xì)胞是人體血液中的主要白細(xì)胞群，在非特異性免疫機(jī)制中起重要作用。2004 年，Brinkmann等［1］首次證明，中性粒細(xì)胞可通過(guò)形成一種帶有強(qiáng)大負(fù)電荷的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)捕獲病原體，并將該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)命名為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）。中性粒細(xì)胞受多種病原微生物、脂多糖、豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol myristate acetate，PMA）、活化的血小板及一些炎性介質(zhì)刺激后，發(fā)生染色質(zhì)解聚，核膜崩解。髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、α 防御素和抗菌肽等顆粒蛋白黏附于解聚染色體，并釋放到胞外形成NETs。其形成通常伴隨著中性粒細(xì)胞破壞和病原體的死亡，這一過(guò)程稱之為網(wǎng)捕死亡（NETosis）［2］。NETs 概念的提出打開(kāi)了中性粒細(xì)胞在免疫學(xué)研究中的新紀(jì)元，當(dāng)前有關(guān)NETs 的關(guān)注焦點(diǎn)在于NETs與疾病的相關(guān)性和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成的治療潛力。

NETs與多種疾病的發(fā)病和治療存在密切關(guān)聯(lián)，表現(xiàn)為“雙刃劍”作用。一方面它既能在感染性疾病中防止病原微生物的擴(kuò)散和起殺滅作用，如金黃色葡萄球菌［3］、肺炎鏈球菌［4］、結(jié)核分枝桿菌［5］和呼吸道合胞體病毒［6］等；另一方面NETs是引起部分免疫性疾病的發(fā)病因素，如小血管炎［7］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［8］等自身免疫缺陷性疾病。此外，在急性痛風(fēng)性炎癥反應(yīng)中，聚集性NETs可通過(guò)絲氨酸蛋白酶誘捕和降解白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等促炎細(xì)胞因子緩解炎癥反應(yīng)［9］。目前對(duì)NETs在機(jī)體不同生理及病理狀態(tài)下的形成及作用認(rèn)識(shí)仍較局限，但已經(jīng)相繼開(kāi)展了關(guān)于NETs在微生物感染的治療、自身免疫性疾病的防治等方面的研究，這將可能為感染、自身免疫性疾病及血栓性疾病提供潛在治療方向。因此，熟悉檢測(cè)NETs的方法并合理運(yùn)用有利于保證NETs檢測(cè)的準(zhǔn)確性，從而有助于對(duì)疾病的診斷以及探索一些新的治療靶點(diǎn)。鑒于目前尚未建立完整的標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)價(jià)系統(tǒng)，本文擬對(duì)國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的各種NETs檢測(cè)方法進(jìn)行分類，評(píng)價(jià)其優(yōu)缺點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 形態(tài)學(xué)觀察

電鏡掃描正常中性粒細(xì)胞顯示細(xì)胞核呈桿狀或2～5分葉狀，葉與葉間有細(xì)絲相連，胞漿內(nèi)含多種小顆粒物質(zhì)。Brinkmann 等［1］利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）、透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察到中性粒細(xì)胞在PMA 或脂多糖的刺激作用下形態(tài)發(fā)生變化。SEM圖像顯示，中性粒細(xì)胞被激活后，細(xì)胞扁平化，細(xì)胞核分葉結(jié)構(gòu)消失，核膜溶解，核內(nèi)物質(zhì)釋放到胞質(zhì)中，隨后質(zhì)膜崩解，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到胞外形成纖維狀結(jié)構(gòu)，其TEM 圖像證實(shí)了NETs 無(wú)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)包裹。單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體是誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的主要誘因。Schauer 等［10］采用視頻時(shí)差顯微鏡記錄了MSU 晶體體外誘導(dǎo)NETs 的形成過(guò)程，中性粒細(xì)胞的胞核失去原有結(jié)構(gòu)，在此分解過(guò)程中，染色質(zhì)外化，形成與微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生類似的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，證實(shí)了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中存在NETs。Borenstein等［11］利用TEM觀察了細(xì)菌刺激口腔中性粒細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，深化了對(duì)口腔健康和中性粒細(xì)胞活化狀態(tài)差異性的理解。利用顯微技術(shù)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察方便、快捷，但判斷過(guò)程存在主觀性，且NETs 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)脆弱，增加了標(biāo)本制作和保存的難度。此外，嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞受刺激后也會(huì)產(chǎn)生胞外誘捕網(wǎng)［12］。因此，形態(tài)學(xué)觀察只適合對(duì)NETs進(jìn)行初步判斷，作簡(jiǎn)單定性。

2 游離DNA/NETs組分檢測(cè)

在NETs 發(fā)現(xiàn)之前，游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）的檢測(cè)早已在臨床上應(yīng)用于診斷瀕危細(xì)胞或組織。cfDNA作為一種危險(xiǎn)相關(guān)分子模式可以激活機(jī)體自身免疫應(yīng)答反應(yīng)，故cfDNA/NETs常用作評(píng)價(jià)機(jī)體感染程度的指標(biāo)［13］。此外，隨著對(duì)cfDNA 構(gòu)成NETs基本骨架的認(rèn)識(shí)，檢測(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中釋放的cfDNA可用于有效評(píng)價(jià)NETs。

2.1 電泳技術(shù) 按相對(duì)分子質(zhì)量大小分離DNA 的凝膠電泳技術(shù)包括瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳2種方法，其能夠用于分離、鑒定和純化DNA 片段。cfDNA 是高度碎裂的雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）片段，利用電泳雖不能排除其他方式產(chǎn)生dsDNA 的干擾，但血清中其他方式產(chǎn)生的dsDNA量所占比例較網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中產(chǎn)生的量低，因此依然可有效鑒定核酸情況。國(guó)內(nèi)有研究人員以PMA 誘導(dǎo)外周血中性粒細(xì)胞形成NETs，對(duì)樣品分別給予RNA 酶、DNA 酶處理、兩者兼有以及不處理，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證核酸的形成，結(jié)果顯示網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的核酸為dsDNA；進(jìn)一步采用熒光染色法測(cè)定DNA 含量，發(fā)現(xiàn)NETs 中的DNA 常以DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物存在［14］。Yu等［15］采用非變性聚丙烯凝膠電泳分析尿路感染中樣本的活性蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物，分別用考馬斯亮藍(lán)G-250 測(cè)定蛋白質(zhì)，溴化乙錠測(cè)定DNA，比較兩者顯色區(qū)域，結(jié)果證實(shí)在NETs 中富集DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，隨后用質(zhì)譜技術(shù)驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。電泳技術(shù)鑒定cfDNA 簡(jiǎn)單、快速，能夠有效分解DNA 片段，其缺陷是不能確認(rèn)cfDNA 是否完全來(lái)自于NETs，無(wú)法排除如組織損傷、細(xì)胞凋亡和壞死導(dǎo)致的其他cfDNA 的干擾，因此，電泳技術(shù)常在實(shí)驗(yàn)室中用于定性分析NETs。

2.2 熒光染色法 利用特殊熒光染料與雙鏈DNA特異性結(jié)合，熒光分析儀在特定波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)度，可定量分析cfDNA/NETs。傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增后的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，其時(shí)間消耗和多個(gè)人為操作步驟導(dǎo)致該過(guò)程存在易污染、重復(fù)性差等缺點(diǎn)，這可能限制了NETs的檢測(cè)準(zhǔn)確性，熒光PCR技術(shù)利用熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)量化進(jìn)程，簡(jiǎn)化操作流程，克服了傳統(tǒng)PCR 的缺點(diǎn)。隨著熒光顯微鏡的普及，免疫熒光標(biāo)記的方法也日益應(yīng)用廣泛，尤其是熒光雙標(biāo)或多標(biāo)法。在急性痛風(fēng)性炎癥反應(yīng)中，Mitroulis等［16］采用DNA 和MPO 雙重染色對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型滑液內(nèi)的中性粒細(xì)胞進(jìn)行共定位分析，在免疫熒光顯微鏡下觀察到了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（首次在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中證實(shí)NETs），并提出白細(xì)胞介素-1β 參與了NETs 的形成。隨著急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)自發(fā)消退機(jī)制的提出，Schauer 等［10］利用DNA 和NE 雙重染色免疫熒光圖像分析證實(shí)：在慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中，NETs可通過(guò)降解趨化因子和細(xì)胞因子緩解炎癥反應(yīng)。為克服單通道免疫熒光顯微分析存在的主觀性，Brinkmann等［17］采用雙通道熒光染色和自動(dòng)圖像分割的方法來(lái)確定染色質(zhì)解聚。該方法簡(jiǎn)化了操作步驟，且利用染色強(qiáng)度對(duì)cfDNA進(jìn)行量化，適用于簡(jiǎn)單的顯微設(shè)備和借助微量滴定板的高通量篩選技術(shù)，但病原體DNA 會(huì)干擾熒光信號(hào)分割，導(dǎo)致偏差較大。Vong 等［18］在雙通道熒光染色基礎(chǔ)上利用DNA、NE和瓜氨酸化組蛋白（H3Cit）的疊加顯色，建立了三通道熒光免疫染色，該方法可用作量化和可視化NETs 的補(bǔ)充方法，但分析過(guò)程復(fù)雜，標(biāo)記缺乏靈活性。此外，免疫熒光技術(shù)普遍存在熒光淬滅現(xiàn)象，因此樣品不能長(zhǎng)期保存。由于抗體不純或交叉反應(yīng)等原因，還可產(chǎn)生非特異性熒光干擾。Rebernick等［19］在免疫熒光分析法的基礎(chǔ)上，以類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑液中的NETs為研究對(duì)象，建立了DNA 面積與NETosis 分析法。它是一種基于Image J/Java程序的半自動(dòng)量化網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和DNA區(qū)域的方法，可解決分割多個(gè)細(xì)胞和消除細(xì)胞碎片所產(chǎn)生的限制問(wèn)題，避免樣品間的偏差，降低個(gè)體差異。該法還具有易用性和靈活性等優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件和細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 共聚焦顯微技術(shù) 在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上，共聚焦顯微技術(shù)以激光作為光源，紫外光或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，再利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理。采用共聚焦顯微鏡可在細(xì)胞、組織切片以及亞細(xì)胞水平上觀察生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化，它還可進(jìn)行單色/多色熒光、z 軸采集、三維重構(gòu)、時(shí)間序列成像和熒光強(qiáng)度測(cè)量等多種檢測(cè)［20］。研究表明NETs 中含有大量的內(nèi)源性抗生素：陽(yáng)離子抗菌肽LL-37，基于LL-37 的陽(yáng)離子特性，可與網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的DNA 結(jié)合，從而保護(hù)DNA不被核酸酶降解［21］。在利用熒光染料作為DNA 結(jié)合物檢測(cè)NETs 的分析方案中，染料與dsDNA 通過(guò)插層、靜電作用等方式結(jié)合而使熒光顯著增加，LL-37 與DNA 的結(jié)合，減弱了DNA 小片段（當(dāng)dsDNA 用核酸酶處理時(shí)）與熒光染料的相互作用，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，從而阻礙熒光染色的可視化［22］。因此，以酶及其抗體為基礎(chǔ)的免疫熒光共定位技術(shù)是NETs可視化和定量分析的第一選擇［23］。石蠟切片能較好地保存組織結(jié)構(gòu)，是常用的免疫組織化學(xué)常規(guī)制備切片方法之一。Brinkmann 等［24］采用石蠟包埋后的組織切片，使用未標(biāo)記的初級(jí)抗體及特異性次級(jí)抗體的結(jié)合抗體，與宿主血清蛋白交叉吸收，避免了由于交叉標(biāo)記而產(chǎn)生的假陽(yáng)性染色。此外，該研究還比較了不同抗原提取方法和對(duì)不同抗體的檢測(cè)效果，結(jié)果顯示組蛋白H2B 抗體和H3Cit抗體在55°C孵育時(shí)均與致密或解聚染色體發(fā)生強(qiáng)烈結(jié)合，且染色效果最佳。Santos 等［25］在MPO與H3Cit 共定位的基礎(chǔ)上，采用共聚焦顯微鏡鑒定血栓樣本中的NETs 結(jié)構(gòu)，證實(shí)了MPO 在NETs 形成過(guò)程中與NE 協(xié)同促進(jìn)染色質(zhì)解聚。這兩種蛋白質(zhì)的共定位能較好地將NETosis 與其他細(xì)胞死亡形式區(qū)分開(kāi)來(lái)，在NETs的鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。為進(jìn)一步探究NETs 的信號(hào)調(diào)節(jié)通路，Desai 等［26］以MSU晶體誘導(dǎo)小鼠氣囊炎模型，進(jìn)行NE、H3Cit 和DNA共染色，證實(shí)了受體相互作用蛋白激酶1/3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白參與MSU 晶體誘導(dǎo)的NETs 形成，且是信號(hào)通路中的重要分子靶點(diǎn)。隨后，Ginley等［27］設(shè)計(jì)了一種結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞成像的方法，其基于使用共定位標(biāo)記NETs 組分，通過(guò)設(shè)定閾值依次消除不符合條件的像素。這一方法可重復(fù)性較好，敏感度和特異度較高，但在不同疾病環(huán)境條件下對(duì)量化NETs的效果有待進(jìn)一步證明。

共聚焦免疫熒光顯微鏡技術(shù)是一種重復(fù)性好，能對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室樣本結(jié)果進(jìn)行比較，可直接研究NETs 固定樣品結(jié)構(gòu)的有效方法。但免疫熒光共定位對(duì)圖像掃描參數(shù)有著嚴(yán)格的要求，且樣本制作要進(jìn)行多重染色，步驟繁多，成本昂貴。

3 蛋白質(zhì)組分檢測(cè)

MPO 和NE 等顆粒蛋白是組蛋白參與染色質(zhì)去致密化過(guò)程最重要的蛋白酶，存在于中性粒細(xì)胞的嗜苯胺藍(lán)顆粒中。此外，組蛋白翻譯后的修飾，如乙酰化、磷酸化和甲基化，可調(diào)節(jié)各種染色質(zhì)功能，如染色質(zhì)縮合/解聚，故H3Cit 作為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的生物標(biāo)志物常用作NETs 的檢測(cè)指標(biāo)［28］。因此，分析NETs中的典型蛋白質(zhì)類組分可有效檢測(cè)NETs 的形成和相關(guān)的生理變化。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 通過(guò)底物的顏色變化判定相關(guān)免疫反應(yīng)的發(fā)生，顏色的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原含量呈正比，ELISA 以此達(dá)到定量分析。肽?；彼崦搧啺泵福╬eptidylarginine deaminase，PAD）4 在粒細(xì)胞中高度表達(dá)，通過(guò)介導(dǎo)H3Cit 參與NETs 形成。Th?lin 等［29］用脂多糖誘導(dǎo)缺血性腦卒中患者血漿樣品，以PAD4-H3Cit 為對(duì)照組，通過(guò)ELISA 法定量分析H3Cit 和游離瓜氨酸在450 nm 波長(zhǎng)處的光密度值，其結(jié)果顯示游離瓜氨酸劑量對(duì)光密度值影響較低，兩者呈線性關(guān)系，排除了血漿中游離瓜氨酸對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，由此建立了一種快速、可靠地檢測(cè)血漿中H3Cit 的方法。該研究還發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)石中通常存在多種蛋白質(zhì)組分，如白細(xì)胞介素-1β、抗炎蛋白和促炎蛋白以及MPO 等酶類等。Sil 等［30］采用ELISA 法檢測(cè)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中MPO 和NE 的表達(dá)情況，提出巨噬細(xì)胞受MSU 晶體刺激后通過(guò)分泌白細(xì)胞介素-1β促進(jìn)NETs形成，隨后，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果證實(shí)了這一結(jié)論。研究人員在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了活細(xì)胞成像的熒光標(biāo)記試驗(yàn)，呈現(xiàn)了中性粒細(xì)胞釋放DNA 的動(dòng)態(tài)過(guò)程，同時(shí)記錄了DNA 的結(jié)構(gòu)變化［31］。ELISA 作為一種特異性檢測(cè)NETs 的方法，快捷方便，不需要特殊儀器設(shè)備，但受環(huán)境因素影響多，且仍存在非特異性免疫熒光的影響。

3.2 蛋白質(zhì)印跡法 蛋白質(zhì)印跡法又稱免疫印跡試驗(yàn)，結(jié)合凝膠電泳和免疫性標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)分析特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的樣品著色位置和深度，獲得特定蛋白質(zhì)在樣品中的表達(dá)情況。Chatfield 等［32］利用此法對(duì)比MSU 晶體和PMA 誘導(dǎo)形成的NETs中蛋白質(zhì)組分表達(dá)情況，結(jié)果顯示MSU晶體誘導(dǎo)產(chǎn)生的NETs中富含肌動(dòng)蛋白，提出兩者通過(guò)不同途徑形成NETs，這一說(shuō)法在臨床得以證實(shí)，患者痛風(fēng)石中檢測(cè)到了富含肌動(dòng)蛋白的晶體。NETs可能限制了痛風(fēng)患者持續(xù)性炎癥反應(yīng)的發(fā)展，這也符合臨床癥狀中炎癥自發(fā)消散現(xiàn)象［33］。炎癥小體作為激活痛風(fēng)性炎癥發(fā)作的開(kāi)關(guān)，其活化機(jī)制與細(xì)胞自噬有關(guān)［34］。在MSU 晶體刺激中性粒細(xì)胞一定時(shí)間后，采用蛋白質(zhì)印跡法結(jié)合共聚焦顯微技術(shù)分析細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ的變化情況，證實(shí)痛風(fēng)中NETs的激活與白細(xì)胞介素-1β和細(xì)胞自噬信號(hào)通路有關(guān)［16］。PAD4 可加重炎癥性關(guān)節(jié)炎，是NETs形成的關(guān)鍵，PAD2對(duì)健康組織中的瓜氨酸化至關(guān)重要，但其在炎癥性關(guān)節(jié)炎和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的作用尚不清楚。Bawadekar 等［35］分析小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中的PAD2、PAD4 和免疫球蛋白G的表達(dá)水平，結(jié)果顯示PAD2 對(duì)腫瘤壞死因子-α 誘導(dǎo)的瓜氨酸化和關(guān)節(jié)炎炎癥有促進(jìn)作用，但不是NETs 形成所必需。NETs 中含有高濃度、多種類的蛋白質(zhì)組分，免疫印跡法可從分析蛋白組分方面解決網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的定性和定量問(wèn)題，其應(yīng)用范圍廣。但因樣品制備過(guò)程中易存在人為失誤，使定量分析結(jié)果偏差大，故常用作定性分析。

3.3 流式細(xì)胞術(shù) 基于DNA的熒光標(biāo)記示蹤NETs敏感度低，而流式細(xì)胞術(shù)可通過(guò)檢測(cè)懸液中帶有標(biāo)記的單細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)顆粒物（如DNA、MPO、NE 等）熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)高速、逐一的細(xì)胞定量分析。Masuda 等［36］基于流式細(xì)胞術(shù)，使用Sytox 染料對(duì)DNA 和MPO 共染色，鑒定了PMA 體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但此方法不能識(shí)別細(xì)胞質(zhì)膜完全破裂的細(xì)胞，相比顯微成像分析數(shù)量有限，無(wú)法觀察到細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及定位熒光信號(hào)到特定部位等缺陷。 多譜段成像流式細(xì)胞儀（multispectral imaging flow cytometry，MIFC）是綜合了熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)的一種新型成像流式細(xì)胞儀，它可在多段波長(zhǎng)同時(shí)捕獲高速、高分辨率的圖像，并進(jìn)行大量懸浮細(xì)胞圖像的采集，精確量化NETs形成中的細(xì)胞核形態(tài)變化，兼具量化分析和成像 的 優(yōu) 點(diǎn)。Zhao 等［37］利 用MIFC 檢 測(cè)DNA 染 色（Hoechst 染料）和MPO 的核位移，成功描述了NETs中細(xì)胞核的形態(tài)變化。以此為基礎(chǔ)，Carmona-Rivera等［38］在研究脂多糖誘導(dǎo)形成NETs過(guò)程中，進(jìn)一步描述了DNA解聚和MPO的核易位過(guò)程，結(jié)果顯示在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中細(xì)胞核面積增加，熒光強(qiáng)度降低。利用MIFC 檢測(cè)NETs 具有清晰度高、敏感度高等優(yōu)勢(shì)，此外，還可提供明場(chǎng)、暗場(chǎng)的熒光圖像、熒光強(qiáng)度和大量的細(xì)胞圖像定量數(shù)據(jù)。但該法具有一定局限性，其一，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成期間的突出特征是核形態(tài)的變化，其直徑通過(guò)染色質(zhì)的解聚而顯著增大，最終核物質(zhì)幾乎完全占據(jù)細(xì)胞質(zhì)。在此過(guò)程中，染料插入DNA的強(qiáng)度降低，此方法依賴于細(xì)胞核在NETs 形成早期的形態(tài)變化。因此應(yīng)避免對(duì)中性粒細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間的刺激。其二，MIFC檢測(cè)系統(tǒng)更注重于形變過(guò)程中的細(xì)胞，從而忽視已經(jīng)溶解或處于形變后期的細(xì)胞。其三，在樣品制備過(guò)程中，離心等操作會(huì)造成細(xì)胞核的伸長(zhǎng)或質(zhì)膜的破裂，導(dǎo)致完整的細(xì)胞核從細(xì)胞中釋放，影響檢測(cè)結(jié)果。

4 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前主要通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、游離DNA/NETs 和組蛋白、MPO、NE、細(xì)胞因子等蛋白質(zhì)組分的量化分析對(duì)NETs進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)體系通常采用多種方法聯(lián)合分析。其中，蛋白質(zhì)印跡法和ELISA 常用于輔助鑒定NETs，隨著顯微技術(shù)和免疫熒光新技術(shù)的發(fā)展，免疫熒光分析、共聚焦顯微技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等方法在體外活細(xì)胞成像的運(yùn)用使得纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的可視化程度大大提高。它們?cè)诹炕疦ETs 方面應(yīng)用廣泛，對(duì)網(wǎng)捕死亡及其他細(xì)胞死亡機(jī)制如凋亡或壞死的鑒別也最為可靠。目前，量化NETs的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)程序尚不完善，仍然缺少明確區(qū)分NETs與其他細(xì)胞死亡形式殘余物的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。因此，更需要建立一種有效評(píng)價(jià)NETs的自動(dòng)定量分析評(píng)價(jià)體系，這對(duì)深入探索不同疾病狀態(tài)的NETs 結(jié)構(gòu)特征和生理病理機(jī)制尤為重要。