蛋白翻譯后修飾與腸易激綜合征

王玥梅，朱遠(yuǎn)冰，吳巧鳳，2，3△

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種胃腸道功能障礙性疾病，以反復(fù)腹痛、腹脹、糞便形態(tài)異?；蚺疟阋?guī)律改變等為主要臨床表現(xiàn)［1］。IBS由多種因素引發(fā)，腸道反應(yīng)性變化（包括運(yùn)動功能和分泌功能異常）、腸道感染和菌群失調(diào)、內(nèi)臟高敏感性、腦-腸軸功能紊亂、心理壓力等因素可能與IBS有關(guān)或參與IBS的發(fā)病機(jī)制［2］。蛋白翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs）是蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的一種重要方式，指蛋白質(zhì)在翻譯后發(fā)生的化學(xué)變化，主要由識別特定蛋白質(zhì)中特定靶序列的酶催化［3］，與許多重要的生命活動、疾病發(fā)生密切相關(guān)［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，人類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)存在不同類別的PTMs，在生理和病理條件下，PTMs能夠影響蛋白的穩(wěn)定性、活性、定位以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同方面，迅速調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生命活動，同時豐富蛋白功能的多樣性［6-7］。多種PTMs如乙?；⒘姿峄?、甲基化等通過對相關(guān)蛋白分子的修飾及通路的活化在調(diào)節(jié)IBS內(nèi)臟超敏、腸黏膜屏障、腸道免疫細(xì)胞等方面起重要作用。深入探索PTMs與IBS的關(guān)系對明確該疾病發(fā)生機(jī)制、治療靶標(biāo)等方面均有重要意義?，F(xiàn)就幾種蛋白修飾類型及其在IBS中作用的研究進(jìn)展概述如下。

1 乙?；揎椗cIBS

乙?；揎検菍⒁阴；D(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上的過程。蛋白乙?；揎椫饕l(fā)生在賴氨酸NH3

+基團(tuán)上，作為一種可逆的PTMs，它通常由賴氨酸乙?；福╨ysine acetyltransferase，KAT）和賴氨酸去乙?；福╨ysine deacetyltransferase，KDAT）調(diào)控，目前研究顯示組蛋白上的賴氨酸殘基乙酰化修飾主要在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和核小體動力學(xué)的調(diào)節(jié)中起重要作用［8］。乙酰化修飾最先在組蛋白上被發(fā)現(xiàn)，兩種催化酶也被稱作組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）。在HAT或HDAC的催化下，乙?；鶊F(tuán)可在組蛋白賴氨酸殘基上添加或去除，分別增強(qiáng)或抑制DNA的轉(zhuǎn)錄水平。乙酰化修飾主要在核內(nèi)或胞內(nèi)發(fā)揮各自功能，在細(xì)胞生長、衰老、炎性反應(yīng)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。

研究發(fā)現(xiàn)，乙?；揎椗cIBS的相關(guān)性主要體現(xiàn)在內(nèi)臟超敏性方面。內(nèi)臟高敏感性是IBS重要發(fā)病因素，IBS患者中33%～90%表現(xiàn)為以痛覺過敏和異常性疼痛為特征的內(nèi)臟超敏反應(yīng)［10］。在反復(fù)應(yīng)激或皮質(zhì)酮水平改變誘導(dǎo)的內(nèi)臟超敏反應(yīng)中，通過改變大腦和脊髓中的組蛋白乙?；?，可導(dǎo)致促傷害性和抗傷害性基因表達(dá)產(chǎn)生特定變化，且HDAC抑制劑有可能成為IBS相關(guān)的內(nèi)臟超敏反應(yīng)癥狀的潛在治療方法［11］。

組蛋白乙?；揎椩谛尤屎私閷?dǎo)的應(yīng)激性內(nèi)臟超敏機(jī)制中有重要作用，這一作用與下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）有密切關(guān)系。HPA軸在下丘腦啟動，下視丘室旁核有可以進(jìn)行神經(jīng)內(nèi)分泌的神經(jīng)元，該神經(jīng)元可合成并分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），作用于垂體前葉，促進(jìn)促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）的釋放。腎上腺皮質(zhì)在ACTH的作用下合成糖皮質(zhì)激素（主要是皮質(zhì)醇）釋放入循環(huán)后，皮質(zhì)醇與糖皮質(zhì)激素受體（GR）結(jié)合，作用于下丘腦和垂體（分別抑制CRH和ACTH的合成與分泌），形成反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。相反，皮質(zhì)醇與杏仁核GR的結(jié)合可促進(jìn)HPA軸，從而導(dǎo)致持續(xù)的應(yīng)激活化，不僅誘導(dǎo)內(nèi)臟產(chǎn)生超敏反應(yīng)，而且使GR啟動子處組蛋白3的乙酰化水平下降［11］。GR啟動子區(qū)域組蛋白乙?；慕档蛯?dǎo)致杏仁核中央核（CeA）內(nèi)GR表達(dá)減少，隨后由于GR介導(dǎo)的抑制作用喪失，使CRH的表達(dá)增加［11］。而通過雙側(cè)CeA灌注HDAC抑制劑如三環(huán)素A或亞甲酰苯胺氫肟酸可減輕內(nèi)臟超敏反應(yīng)［12］。同時在IBS患者中發(fā)現(xiàn)，GR表達(dá)水平改變或杏仁核中CRH分泌的增加對杏仁核介導(dǎo)的HPA軸具有促進(jìn)作用［13］。生命早期應(yīng)激（early life stress，ELS）引起的新生兒內(nèi)臟痛敏反應(yīng)與CeA中CRH表達(dá)水平的增加密切相關(guān)［14］。Louwies等［15］發(fā)現(xiàn)ELS增加了成年雌性大鼠CeA中組蛋白3賴氨酸9（H3K9）乙酰化水平，CRH啟動子上的H3K9乙酰化增加，GR結(jié)合減少。CeA中組蛋白乙酰化失調(diào)與CRH啟動子GR結(jié)合失調(diào)是早期應(yīng)激介導(dǎo)成年內(nèi)臟痛敏的重要機(jī)制。因此ELS可能通過增加CRH啟動子處的H3K9乙酰化水平，導(dǎo)致CeA中CRH的上調(diào)，從而導(dǎo)致內(nèi)臟超敏反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射HDAC抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸可減輕應(yīng)激引起的雌性大鼠內(nèi)臟超敏反應(yīng)，改善其排便情況［16］。有研究表明使用該抑制劑后可增加脊髓谷氨酸受體（glutamate receptors）mGluR2和mGluR3的表達(dá)，揭示組蛋白乙?；揎椏烧{(diào)節(jié)脊髓中mGluR2/3的表達(dá)，以緩解應(yīng)激誘發(fā)的內(nèi)臟超敏反應(yīng)［17-18］。此外，組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹經(jīng)腦室給藥可顯著抑制成年大鼠多次避水脅迫后所致的IBS內(nèi)臟超敏反應(yīng)［19］。由此可見，乙?；揎椩贗BS疾病發(fā)生發(fā)展中有不可忽視的地位。

2 甲基化修飾與IBS

生物體中甲基化經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶催化，共同參與形成和維系不同的甲基化狀態(tài)，涉及基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)及RNA加工等生命活動，與炎癥、腫瘤、阿爾茨海默病等許多疾病發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。常見的甲基化分類主要包括DNA甲基化和組蛋白甲基化，以及逐漸作為研究熱點(diǎn)之一的RNA甲基化。組蛋白甲基化一般發(fā)生在H3和H4組蛋白N端精氨酸或者賴氨酸殘基上，賴氨酸甲基化主要由包含SET結(jié)構(gòu)域的甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成，常發(fā)生在組蛋白H3賴氨酸第4、9、27、36、79位殘基（H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79）和組蛋白H4賴氨酸第20位殘基（H4K20）。同時，H3K4、H3K36、H3K79的甲基化常與基因轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，而H3K9、H3K27、H4K20的甲基化與基因轉(zhuǎn)錄抑制作用相關(guān)［20］。精氨酸甲基化主要由蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）催化完成。Chen等［21］研究發(fā)現(xiàn)基因組某一啟動子組蛋白H3第4位賴氨酸殘基三甲基（H3K4me3）可增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄，而同一組蛋白H3的第9和27位賴氨酸殘基上三甲基化（H3K9me3和H3K27me3）抑制了基因的表達(dá)。在IBS甲基化全基因組分析研究中發(fā)現(xiàn)，和空白對照組相比，IBS模型組差異表達(dá)基因中Notch信號明顯增強(qiáng)，黏著斑明顯增加，并且在它們的啟動子區(qū)域中共有541個基因的甲基化水平明顯較低，而626個基因的甲基化水平明顯較高［22］。Mahurkar等［23］檢測IBS患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）DNA甲基化水平，鑒定出133個差異性甲基化位點(diǎn)，類型主要與氧化應(yīng)激和神經(jīng)肽激素活性有關(guān)。同時研究人員通過測序驗證了谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶mu5（GSTM5）和促進(jìn)蛋白基因聚合的微管蛋白的甲基化水平差異性，且GSTM5中2個啟動子CpG的甲基化與表觀遺傳沉默相關(guān)。由此可見，在IBS發(fā)生發(fā)展過程中，甲基化修飾有著十分重要的地位。

甲基化參與基因表達(dá)調(diào)控在持續(xù)影響IBS內(nèi)臟高敏性的潛在機(jī)制研究中有重要作用，應(yīng)激誘導(dǎo)的IBS內(nèi)臟痛與腦內(nèi)DNA甲基化改變有關(guān)，導(dǎo)致前傷害性神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)增加［24］。兒童早期創(chuàng)傷作為壓力應(yīng)激也是影響IBS內(nèi)臟高敏性因素之一，其通過促使糖皮質(zhì)激素受體基因的高度甲基化，降低糖皮質(zhì)激素受體的表達(dá)，從而降低HPA軸應(yīng)對壓力的有效調(diào)控。在IBS的動物模型中發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體啟動子發(fā)生甲基化，糖皮質(zhì)激素受體基因表達(dá)降低，皮質(zhì)酮水平持續(xù)升高［25］。研究發(fā)現(xiàn)，在IBS大鼠結(jié)腸組織中，甲基化CpG結(jié)合蛋白（methyl-CpG binding protein）MeCP2隨著血漿同型半胱氨酸和腸上皮細(xì)胞緊密連接（tight junctions，TJ）蛋白claudin-1基因甲基化程度的升高而升高，說明MeCP2可能和claudin-1基因甲基化共同抑制了基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［26］。因此，甲基化修飾在IBS內(nèi)臟高敏發(fā)生中有著重要的作用。

3 磷酸化修飾與IBS

磷酸化修飾具有可逆地修飾真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的特性。目前發(fā)現(xiàn)在人類細(xì)胞中已有超過500種蛋白激酶產(chǎn)生巨大的磷酸化蛋白質(zhì)組，其中包括約20萬個單獨(dú)的磷酸化位點(diǎn)，并且這個數(shù)字還在不斷增加［27］。磷酸化修飾通過蛋白質(zhì)激酶和磷酸酶分別參與蛋白磷酸化與去磷酸化，參與調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯調(diào)控以及新陳代謝等重要生命活動［28］。蛋白質(zhì)激酶可催化腺苷三磷酸（ATP）中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到氨基酸側(cè)鏈上的蛋白底物上，而磷酸酶則可催化磷酸基團(tuán)的移除，磷酸基團(tuán)帶有負(fù)電荷，因此磷酸化與常染色質(zhì)松弛相關(guān)，可促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄［29］。磷酸化修飾與炎癥、免疫、腫瘤等密切相關(guān)，Western blot是檢測蛋白表達(dá)較為靈敏和特異的方法，隨著同位素標(biāo)記、免疫印跡-化學(xué)發(fā)光等作為核心的磷酸化蛋白質(zhì)分析方案的不斷完善和更新，對磷酸化修飾在疾病中的機(jī)制研究也更為清晰與深入［30-31］。

在IBS模型小鼠腦腸軸，即在下丘腦、垂體、結(jié)腸中辣椒素受體（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）的表達(dá)增多，TRPV1上調(diào)及磷酸化被認(rèn)為是介導(dǎo)痛覺敏化并引發(fā)IBS內(nèi)臟高敏感性的關(guān)鍵性事件之一，蛋白酶激活受體2-蛋白激酶C（PAR2-PKC）通路可通過調(diào)控TRPV1磷酸化，激活TRPV1，使TRPV1開放閾值下降，Ca2+內(nèi)流增加，導(dǎo)致神經(jīng)末梢去極化，釋放神經(jīng)肽類和興奮性氨基酸，從而引發(fā)內(nèi)臟疼痛感知異常，最終導(dǎo)致IBS內(nèi)臟高敏感性的發(fā)生［32］。同時TRPV1可被磷酸鈣酶（包括鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶）負(fù)調(diào)節(jié)。Matsui等［33］發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑他克莫司可使TRPV1介導(dǎo)的脊髓細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）磷酸化水平升高，從而加重小鼠TRPV1依賴性結(jié)腸超敏反應(yīng)。此外，腸屏障功能障礙是IBS的關(guān)鍵病因，Rodi?o-Janeiro等［34］研究發(fā)現(xiàn)腹瀉型腸易激綜合征患者空腸中睪丸特異激酶1（TESK1）介導(dǎo)的編碼肌動蛋白1（CFL 1）磷酸化降低，這可能是女性IBS患者腸上皮功能障礙易感性增加的原因。Li等［35］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍干預(yù)可抑制IBS大鼠結(jié)腸組織肥大細(xì)胞活化，從而降低PAR-2表達(dá)，抑制絲氨酸位點(diǎn)的ERK活化和腸上皮細(xì)胞TJ蛋白claudin-4磷酸化，減輕結(jié)腸擴(kuò)張所致的內(nèi)臟超敏反應(yīng)，說明磷酸化修飾可能參與二甲雙胍改善IBS腸黏膜屏障功能的機(jī)制。此外，一項含麩質(zhì)飲食（gluten-containing diet，GCD）改善IBS-D（腹瀉型）患者癥狀與腸道通透性的研究顯示，使用GCD干預(yù)后，患者小腸上皮肌球蛋白Ⅱ調(diào)節(jié)輕鏈（MLC）磷酸化增加，并與結(jié)腸通透性增高相關(guān)［36］。Zhang等［37］發(fā)現(xiàn)與健康對照者相比，IBS患者結(jié)腸黏膜層中熱休克蛋白27（HSP27）高表達(dá)，而脂多糖（LPS）刺激可促使HSP27在結(jié)腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)，并且使HSP27在絲氨酸78和82位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，隨后采用沉默小干擾RNA驗證了HSP27的磷酸化可能通過調(diào)節(jié)NF-κB通路來保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受損害。因此，磷酸化修飾在IBS內(nèi)臟高敏性和腸屏障功能障礙的機(jī)制研究中有著重要作用。

4 糖基化修飾與IBS

糖基化修飾是常見的PTMs方式之一，也是蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要的加工過程［38］。蛋白糖基化是在肽鏈合成的同時或合成后，通過糖基轉(zhuǎn)移酶催化，使糖與多種蛋白質(zhì)氨基酸殘基結(jié)合形成糖苷鍵，而后形成糖蛋白，參與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞黏附、分子識別以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，其起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，結(jié)束于高爾基體，對蛋白質(zhì)行使生物學(xué)功能起著重要作用［39-40］。糖基化修飾根據(jù)糖蛋白糖側(cè)鏈與蛋白氨基酸基團(tuán)的不同連接方式，主要分為N-連接糖基化（N-linked glycosylation）和O-連接糖基化（O-linked glycosylation）兩大類，而O-連接糖基化又包括OGalNAc、O-GlcNAc、O-Man、O-Fuc、O-Xyl、O-Gal、O-Glc等，以O(shè)-GalNAc、O-GlcNAc的研究較為深入。蛋白糖基化在IBS疾病中的研究較少，而在腸道細(xì)胞研究中較為廣泛，有研究表明糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）及其受體（eceptor for advanced glycation end products，RAGE）在腸道L細(xì)胞中有重要作用，AGE與RAGE結(jié)合后激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶），通過p38MAPK/NF-κB途徑促進(jìn)腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6的分泌，使腸道L細(xì)胞出現(xiàn)炎性損傷反應(yīng)［41］。此外，腸上皮細(xì)胞表面表達(dá)和分泌的糖基有獨(dú)特的功能。腸上皮聚糖在宿主-微生物交互作用中有不可或缺的作用，腸道糖基化在調(diào)控微生物的同時也受微生物刺激和腸道免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)［42］。關(guān)于腸道微生物的蛋白質(zhì)糖基化研究也較多，其大多發(fā)生于鞭毛蛋白和黏附素等表層結(jié)構(gòu)中，能調(diào)控細(xì)菌蛋白的穩(wěn)定性與活性、宿主的免疫反應(yīng)，在腸道微生物的生命活動中發(fā)揮著重要作用［43］。

研究表明調(diào)節(jié)腸內(nèi)多糖水平可以改善IBS腸道動力障礙，IBS患者攝入半乳糖基轉(zhuǎn)移低聚糖（一類多糖）治療4周后，其糞便黏稠度、胃腸脹氣、復(fù)合癥狀評分和主觀整體評估等方面有顯著改善［44］。而在IBS內(nèi)臟高敏性方面，研究者發(fā)現(xiàn)給予小鼠口服含低聚糖、二糖、單糖和多元醇（FODMAP）的飲食可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IBS內(nèi)臟高敏反應(yīng)，這與結(jié)腸肥大細(xì)胞數(shù)量增加和結(jié)腸上皮細(xì)胞晚期RAGE表達(dá)增加有關(guān)［45］。而口服抗糖化劑吡哆胺后能減輕小鼠內(nèi)臟高敏性癥狀，表明抑制糖基化反應(yīng)可以減輕FODMAPs引起的IBS內(nèi)臟高敏反應(yīng)［45］。在腸道黏膜屏障方面，腸道黏液層主要由分泌細(xì)胞（如杯狀細(xì)胞）分泌形成，黏蛋白是腸道黏液層的重要組成部分。Da Silva等［46］發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，IBS模型大鼠腸道黏蛋白Muc2表達(dá)無明顯差異，而黏蛋白的O-連接糖基化改變明顯，出現(xiàn)含有O-聚糖結(jié)構(gòu)的細(xì)長的聚氨基葡糖鏈，影響?zhàn)さ鞍桌w維之間的物理化學(xué)作用，與黏液層缺損和功能缺失密切相關(guān)。

5 小結(jié)和展望

IBS是復(fù)雜的胃腸功能紊亂性疾病，其多種臨床癥狀對患者的日常學(xué)習(xí)、生活、工作和心理等方面造成困擾，給患者生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響。PTMs與IBS內(nèi)臟高敏性、腸黏膜屏障等方面關(guān)系密切，這為深入研究PTMs在IBS中的作用奠定了基礎(chǔ)，為明確IBS的發(fā)病機(jī)制、臨床診斷、治療提供了更多的潛在靶點(diǎn)。此外，更多種類的蛋白修飾類型被發(fā)現(xiàn)以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展將有助于深入研究PTMs與IBS的關(guān)系，進(jìn)而更好地揭示IBS的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療IBS提供新的思路。