椰子組培研究四十年

穆治華　李志瑛　劉蕊　范海闊

摘 ?要：組織培養(yǎng)對(duì)于椰子快速繁殖以及全球椰子產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本文就40年來國內(nèi)外在椰子組培快繁技術(shù)，包括椰子組培技術(shù)的重要性，不同外植體如胚芽、花序、子房等在組織培養(yǎng)中的應(yīng)用與優(yōu)劣，不同培養(yǎng)基和培育環(huán)境對(duì)組培效果的影響等要素，進(jìn)行了詳細(xì)的總結(jié)和討論。同時(shí)總結(jié)了椰子組培快繁技術(shù)的進(jìn)展，分析了目前限制椰子組培快繁技術(shù)發(fā)展的因素，提出了應(yīng)對(duì)策略與具體建議。本文對(duì)椰子快繁技術(shù)及椰子種質(zhì)資源保存具有參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：椰子;組織培養(yǎng);外植體;激素

中圖分類號(hào)：S667.4 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

The Development of Coconut （Cocos nucifera L.） Tissue Culture Technology in the Past 40 Years： a Review

MU Zhihua1，2， LI Zhiying1， LIU Rui1， FAN Haikuo1*

1. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Germplasm Repository of Coconut， Wenchang City， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wenchang， Hainan 571339， China; 2. The University of Queensland， Brisbane， 4343， Australia

Abstract： Coconut tissue culture is an important technology for the future of the coconut industry. This paper has reviewed many valuable studies in the recent four decades. The importance of coconut tissue culture， differences and advantages of varies of explants （plumule， inflorescence， ovary）， the influence of different medium compositions and environmental conditions were presented in detail. A brief summary of many protocols created worldwide and China has been made. Subsequently， the restrains of coconut tissue culture were identified and listed， and some suggestions were made to overcome the limits. This literature review could help the coconut tissue-culturists to further discover the potential of coconut tissue culture.

Keywords： coconut; tissue culture; explant; hormone

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.027

椰子（Cocos nucifera L.）屬棕櫚科椰子屬，是一種高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的多年生單子葉喬木[1]。作為一種熱帶油料作物和食品原料，椰子在93個(gè)國家和地區(qū)均有分布[2]。目前，椰子種植業(yè)面臨很多嚴(yán)重的威脅，如生物性和非生物性脅迫及市場不穩(wěn)定等[3]。作為最難以在體外繁殖的植物之一，傳統(tǒng)營養(yǎng)繁殖手段，如扦插、壓條、嫁接等很難用于椰子的培育繁殖。但是，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，通過多種外植體誘導(dǎo)能夠批量獲得椰子的再生苗。本文總結(jié)了近40年（1980—2020年）國內(nèi)外椰子組培工作的研究現(xiàn)狀及存在問題。

1 ?椰子及其重要性

椰子是棕櫚科椰子屬中唯一的物種[4]。很多學(xué)者認(rèn)為椰子源自于波利尼西亞或者印度群島[5]。作為一種經(jīng)濟(jì)作物，椰子遍布世界熱帶地區(qū)，在全球超過90個(gè)國家均有分布[6]。生長在不同地域的椰子，具有多樣遺傳學(xué)特性[4]。椰子是滿足熱區(qū)人民食品和油料需求的重要生存資源[7]，也被稱為“生命之樹”“大自然的超級(jí)市場”或“天堂之樹”[8]，在全世界熱帶地區(qū)尤其是亞太國家民生保障和食品安全中具有重要作用[9]，每年有大量的椰果及相關(guān)加工產(chǎn)品進(jìn)入世界商品市場[8]。據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO）2016年統(tǒng)計(jì)，世界椰子總產(chǎn)量為5900萬t，其中91%產(chǎn)自東南亞地區(qū)[10]。2014年，僅印度尼西亞就生產(chǎn)椰子1800萬t[9]。在菲律賓，椰子產(chǎn)業(yè)的農(nóng)業(yè)人口從業(yè)比例和農(nóng)業(yè)用地為各行業(yè)內(nèi)第一[11];在印度，有1200萬人從事椰子種植、加工或銷售產(chǎn)業(yè)[9];在馬來西亞，超過90%的椰子種植戶是風(fēng)險(xiǎn)抵御能力相對(duì)較弱的中小型農(nóng)戶[12]。由此可見，椰子生產(chǎn)對(duì)各椰子生產(chǎn)國的社會(huì)穩(wěn)定、人民生活和經(jīng)濟(jì)發(fā)展都有著巨大的影響。

2 ?椰子組培——椰子產(chǎn)業(yè)潛在的“助推器”

目前，世界椰子產(chǎn)業(yè)面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。斯里蘭卡出口發(fā)展委員會(huì)在2018年預(yù)測，2020年之前，世界椰子市場規(guī)模的增長幅度可達(dá)27%[13]，相應(yīng)椰果等加工原材料的需求也將大幅度增加。但椰子產(chǎn)量自2010年就處于平臺(tái)期，未出現(xiàn)明顯增長[14]，這表明椰子供需平衡的局面被打破。而產(chǎn)量高、品種優(yōu)良的椰苗將是椰子產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、椰農(nóng)收入提升的關(guān)鍵[15]。目前每年生產(chǎn)的椰

苗只能達(dá)到市場需求的20%，種植戶需要更多的種苗用于更新老化和遭受病害的椰樹[16]。傳統(tǒng)椰苗培育方法使用種果繁殖，繁殖系數(shù)較低，異花授粉導(dǎo)致后代性狀分離而個(gè)體差異大，無法保持親本優(yōu)良性狀;種果體積大，休眠期短，難以大批量遠(yuǎn)距離運(yùn)輸。而椰子莖干孤立，頂芽為營養(yǎng)芽，側(cè)芽分化為花序，一般無分枝，因此扦插、嫁接、高空壓條方法無法應(yīng)用于椰子的無性繁殖[2]。椰子從種子到第1次結(jié)果往往需要5～6 a[17]，最長可達(dá)8 a[18]。因此，傳統(tǒng)椰子繁殖方式無法持續(xù)提供穩(wěn)定高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的種苗，更無法為世界椰子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供足夠的動(dòng)力[19]。為了彌補(bǔ)此劣勢(shì)，組培快繁技術(shù)被應(yīng)用于椰子繁殖并快速發(fā)展[17]。過去60年里，椰子組培研究集中于胚培養(yǎng)（embryo culture）、體細(xì)胞再生（somatic embryogenesis）、花藥培養(yǎng)（anther culture）以及種質(zhì)的低溫保存（cryopreservation）和遺傳轉(zhuǎn)化（genetic transformation）[3]。成熟的椰子組培快繁技術(shù)可在較短時(shí)間內(nèi)，以較低的成本培育大量性狀優(yōu)良或抗性強(qiáng)的椰子品種，從而提升椰農(nóng)的收入[3， 19]。

椰子組培的目標(biāo)是獲得能夠發(fā)育成完整植株的體胚，而體胚發(fā)生途徑是一種適用于與母體無維管連接的非合子細(xì)胞（組織）的組培方法，通過培養(yǎng)可形成具有兩極性、類似合子胚的組織結(jié)構(gòu)[4， 20]。體胚發(fā)生途徑如下（見圖1）：外植體啟動(dòng)、愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷組織生成、體胚誘導(dǎo)及萌發(fā)[21]。與傳統(tǒng)種苗生產(chǎn)、胚培養(yǎng)等方式不同的是，利用組培技術(shù)，一個(gè)外植體理論上最多可產(chǎn)生98 000株椰子種苗[4]。早在20世紀(jì)70年代，科學(xué)家就認(rèn)為椰子體胚發(fā)生途徑是一種可行的試管椰苗生產(chǎn)方式[18]。

3 ?椰子組培簡史

在科研人員的不斷探索中，椰子組培技術(shù)在40年內(nèi)快速發(fā)展。20世紀(jì)70年代早期英國Wye College第1次嘗試椰子組培后，多種外植體被用于椰子組培中，具體分為體細(xì)胞組織和合子組織。其中，體細(xì)胞組織的外植體包括嫩葉、未成熟花序、根、頂端生長點(diǎn)等，合子組織包括未成熟/成熟合子胚和胚芽[22-23]。此外還有子房、花藥等其他外植體[24]。20世紀(jì)八九十年代，上述外植體開始被用于椰子組培[25]，其中以完整胚、胚芽、花序、子房為誘導(dǎo)材料的較為常見，但試驗(yàn)重復(fù)性不佳[16， 26]。1998年之前，大多使用花序作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體[27-28]。Blake等[29]和Hornung[30]最早使用椰子胚芽，但在得到胚性愈傷組織后未見后續(xù)報(bào)道[31]。1998年，墨西哥科學(xué)家報(bào)道了以胚芽為外植體獲得體胚的具體操作方法，該項(xiàng)技術(shù)使得從整胚中提取的胚芽成為最適用于產(chǎn)生胚性愈傷組織和體胚的外植體[30]?？茖W(xué)家們意識(shí)到作為一種分生組織，胚芽比未成熟花序?qū)τ谡T導(dǎo)條件更敏感、誘導(dǎo)效率更高[23， 30]。此后，研究者從操作方法、基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分、植物生長調(diào)節(jié)劑如生長素、油菜素內(nèi)酯[32]、赤霉素[25]等方面對(duì)該方法進(jìn)行了改良。盡管椰子組培研究起步較早，但由于椰子的體細(xì)胞組織對(duì)于試管培養(yǎng)環(huán)境的敏感性較差，取得成果有限，使得椰子成為最難以通過實(shí)驗(yàn)室方法生產(chǎn)的植物之一[16， 33-34]，目前尚未發(fā)展出能夠被普遍接受的組培技術(shù)[22]。因此，開發(fā)更高效率的椰子組培技術(shù)，尤其是探索通過體胚發(fā)生途徑生產(chǎn)大量優(yōu)良品種椰子苗的技術(shù)是非常必要的[4]。椰子組織培養(yǎng)時(shí)間線見表1和圖2。

4 ?體細(xì)胞培養(yǎng)體系

4.1 ?以花序?yàn)橥庵搀w

目前認(rèn)為，體細(xì)胞及其組織可產(chǎn)生保持親本性狀的后代。未成熟花序及其花序軸（rachilla tissues）是早期椰子組培的常用外植體[25]。早在1977年，Eeuwens等[35]就嘗試使用椰子花序穗軸和幼嫩花序，并首次使用了Y3培養(yǎng)基。花序穗軸和幼嫩花絮經(jīng)過誘導(dǎo)后產(chǎn)生的“膠質(zhì)體”（colloids）去分化后形成愈傷組織[65]，最終形成體胚并在適宜環(huán)境內(nèi)萌發(fā)形成完整幼苗[27， 66]。早期，使用穗軸的誘導(dǎo)方法再生能力有限，效果相對(duì)較差，經(jīng)過培養(yǎng)基組分及激素濃度的改良后

誘導(dǎo)效率提高[27]。Verdeil等[27]使用含有0.2%活性炭和（1.5～3.5）×10?4 mol/L 2，4-D的固體培養(yǎng)基[18]。Magnaval等[67]以MS培養(yǎng)基中的大量元素、Nitsch培養(yǎng)基中的微量元素、MW培養(yǎng)基中的維生素組成的改良基礎(chǔ)養(yǎng)基，添加2，4-D后誘導(dǎo)獲得愈傷組織。Vidhana等[68]嘗試了4種不同的培養(yǎng)基，在含有24 μmol/L 2，4-D和0.25%活性炭的培養(yǎng)基中獲得了愈傷組織。

Perera等[34]認(rèn)為，可用于誘導(dǎo)愈傷組織的花序的最佳取樣時(shí)間難以判斷，且取樣過程可能會(huì)對(duì)樹的莖尖造成致死性損傷。此外，花序的愈傷組織誘導(dǎo)率通常低于30%，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性差[30]。Vidhana等[68]的研究中約有30%的花序產(chǎn)生了高度胚性的愈傷組織，但誘導(dǎo)出的椰子組培苗莖尖

無頂端分生組織，部分組培苗雖長出花枝，但有發(fā)育不正常的小花[1]。國內(nèi)學(xué)者在試驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象[1]。因此椰子未成熟花序作為外植體存在諸多限制。

4.2 ?花藥、子房作為外植體

20世紀(jì)80年代至今，Kovoor[69]、Iyer等[70]、Thanh-Tuyen等[56]、Monfort[71]等科學(xué)家嘗試誘導(dǎo)花藥，但均未獲得完整植株。Thanh-Tuyen等[56]在Blaydes培養(yǎng)基中加入6%～9%蔗糖，15%椰子水，0.5%活性炭以及2 mg/L NAA，體胚形成率低于1%[72]。Monfort[71]利用花粉獲得了少量的體胚，體胚萌發(fā)形成根尖和葉原基，但未發(fā)育成完整植株。Perera等[73]將產(chǎn)生的愈傷組織依次轉(zhuǎn)接至含有66 μmol/L 2，4-D的Y3培養(yǎng)基，無激素Y3培養(yǎng)基和含有5 μmol/L BAP和0.35 μmol/L GA3的Y3培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，通過100顆花藥產(chǎn)生的125個(gè)愈傷組織或胚性愈傷組織，獲得了20株組培苗[49]。同時(shí)Perera等[73]也發(fā)現(xiàn)kinetin和2iP可以提高愈傷組織的發(fā)生率。

子房源于親本體細(xì)胞，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Perera等[50]以椰子幼嫩雌花中未受精子房為外植體，在含有100 μmol/L 2，4-D和0.1%活性炭的培養(yǎng)基上獲得愈傷組織，誘導(dǎo)率為41%，愈傷組織在含有5 μmol/L ABA的培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)后產(chǎn)生體胚。Perera等[50]還發(fā)現(xiàn)體胚在含有5 μmol/L BAP的培養(yǎng)基中可正常萌發(fā)形成芽。進(jìn)一步試驗(yàn)表明，當(dāng)子房外植體接種在CRI72培養(yǎng)基（含有100 μmol/L 2，4-D和0.1%活性炭）時(shí)，可以穩(wěn)定地產(chǎn)生愈傷組織;9 μmol/L TDZ可提高愈傷組織誘導(dǎo)率;從愈傷組織轉(zhuǎn)變至體胚的過程需要GA3激活;含有5 μmol/L 6BA和2iP的培養(yǎng)基能夠增加體胚成苗率。產(chǎn)生的體胚可繼代于含有66 μmol/L 2，4-D的培養(yǎng)基，但使用Y3培養(yǎng)基成長的體胚不需要任何植物生長調(diào)節(jié)劑也可以正常生長發(fā)育[50]。目前已建立較為完整的椰子子房再生體系，多種植物激素如TDZ、ABA、2iP、GA3被用于誘導(dǎo)試驗(yàn)中[50]，效果不一。Perera等[50]利用該體系誘導(dǎo)出83株完整植株。Bandupriya等[75]根據(jù)前人經(jīng)驗(yàn)，歸納出完整的椰子子房再生體系，試驗(yàn)流程見表2。

經(jīng)過數(shù)十載的努力，椰子花藥、子房作為一種可行的組培外植體，擁有了較為完整的誘導(dǎo)體系。但相比之下，以花藥和子房作為外植體，只能獲得少量組培苗，繁殖系數(shù)較低[35]，遠(yuǎn)不能滿足商業(yè)需求[75-76]。

4.3 ?其他體細(xì)胞作為外植體

已有研究表明，種苗或成熟椰子樹上的幼葉均可誘導(dǎo)出胚性愈傷組織[36]。以5 a樹齡的椰子樹幼葉為外植體，最短可在6個(gè)月內(nèi)生成胚性愈傷組織。但剝?nèi)∮兹~會(huì)對(duì)樹體產(chǎn)生破壞，同時(shí)愈傷組織形成率非常低（低于20%）[36， 77]，現(xiàn)已不再使用。

5 ?胚和胚芽作為外植體

外植體中較為成功的有穗軸（未成熟花序）、花藥、未受精子房，但在產(chǎn)生愈傷組織和體胚方面，胚和胚芽優(yōu)于其他幾種外植體[23， 30， 74]。根據(jù)Pérez-Nú?ez等[4]的計(jì)算，使用一個(gè)胚芽理論上可產(chǎn)生98 000個(gè)體胚，與直接使用體細(xì)胞進(jìn)行培育相比，其效率高出約五萬倍。因此，椰子胚芽使得開發(fā)更高效的組培技術(shù)成為可能[23， 78]。使用胚芽進(jìn)行椰子無性繁殖多選用具有優(yōu)良表現(xiàn)型（抗病等）的親本[23]。近10年，學(xué)者將椰子無性繁殖的研究重點(diǎn)逐漸由難以操作的體細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)向簡單易行的合子細(xì)胞培養(yǎng)[3]。目前，愈傷組織誘導(dǎo)、體胚形成、體胚萌發(fā)和成苗等已成為研究熱點(diǎn)[25]。

合子胚的成熟度是影響愈傷組織誘導(dǎo)、體胚生成的重要因素。5～6月齡的胚愈傷組織誘導(dǎo)率低，但8月齡及以上的胚多已萌發(fā)，無法使用[40]。未成熟合子胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率約為50%，遠(yuǎn)高于成熟胚的3%[25]。

植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑等會(huì)顯著影響椰子組培的效率。Karunaratne等[40]使用開花后6～7個(gè)月的胚，在12～20 μmol/L 2，4-D誘導(dǎo)下可產(chǎn)生白色、完整的、可產(chǎn)生體胚的愈傷組織，繼續(xù)使用8 μmol/L 2，4-D誘導(dǎo)，一半的愈傷組織產(chǎn)生了球狀體胚，繼而在10 μmol/L kinetin和BAP的刺激下，22%的體胚萌芽。除此之外，滲透壓調(diào)節(jié)物（osmoticum）、ABA、GA3對(duì)于椰子胚的萌發(fā)和成熟也有一定作用[79-80]。使用與Karunaratne等[40]相同的方法誘導(dǎo)愈傷組織后，F(xiàn)ernando等[46]使用2.5～7.5 μmol/L ABA誘導(dǎo)，在3～7周后可得到體胚。該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為含有ABA的培養(yǎng)基可誘導(dǎo)大量胚性愈傷組織、嫩芽以至完整植株，其質(zhì)量甚至高于在低濃度2，4-D培養(yǎng)基中得到的植株。

在使用椰子胚芽作為外植體進(jìn)行無性繁殖時(shí)，2，4-D可以快速誘導(dǎo)出愈傷組織。Hornung[30]使用400 μmol/L 2，4-D，約一年后得到成熟體胚。油菜素甾醇及抗細(xì)胞分裂素（anticytokinins）也可以使體胚誘導(dǎo)率增加1.5～2.5倍[32]。Rajesh等[16]在誘導(dǎo)初級(jí)愈傷組織時(shí)使用4.54 μmol/L TDZ，在繼代培養(yǎng)時(shí)使用100 μmol/L精氨（spermine）和1000 μmol/L腐胺（putrescine），結(jié)果顯示外源多胺類可以提高椰子體胚發(fā)生率。

早期，科學(xué)家多使用整胚（成熟或不成熟的）作為椰子組培的外植體。此后，嘗試胚不同部位的切片用作外植體[45， 81]。后期驗(yàn)證，從胚的中心取得的切片最適于產(chǎn)生胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率為58%，當(dāng)使用遠(yuǎn)離胚中軸的組織時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率會(huì)急劇下降[25]。隨著時(shí)間的推移，胚切片技術(shù)已不再用于愈傷組織的誘導(dǎo)，取而代之的是直接從胚中分離胚芽[47]。目前掌握該技術(shù)的研究機(jī)構(gòu)主要有澳大利亞昆士蘭大學(xué)（The University of Queensland）和墨西哥尤卡坦科學(xué)研究中心（Unidad de Biotecnología， Centro de Investigación Científica de Yucatán， CICY）等。該技術(shù)可對(duì)次級(jí)體胚（secondary somatic embryos）進(jìn)行數(shù)次重復(fù)分割并繼代以增加體胚的產(chǎn)量，尤其對(duì)組培低敏感型的植物（例如椰子）來說是快速增殖的方法之一[82]。幾十年內(nèi)，以胚芽為外植體的椰子組培快繁技術(shù)快速發(fā)展，并被廣泛使用。但使用椰子胚芽作為外植體也有限制，例如異花傳粉導(dǎo)致胚芽可能為雜合子，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生的組培苗表現(xiàn)型無法確定，可能出現(xiàn)與親本性狀不一致現(xiàn)象而產(chǎn)生后代異質(zhì)性（heterogeneity）[74]。此外，該體系還存在組織褐化、反應(yīng)不敏感、體胚誘導(dǎo)率低、個(gè)體特異導(dǎo)致的組織變異等問題[16， 26]。

6 ?中國椰子組培研究進(jìn)展

相比世界椰子主產(chǎn)國，中國椰子組培快繁技術(shù)起步較晚。究其原因，椰子并非中國的主要經(jīng)濟(jì)作物，全國只有海南省能夠規(guī)?；⑸虡I(yè)化生產(chǎn)椰果，因此國內(nèi)市場動(dòng)力不足，研究投入較少，椰子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展相對(duì)滯后，所以與世界椰子主產(chǎn)國相比，椰子相關(guān)的科學(xué)研究也較少。

國內(nèi)椰子組培研究最早報(bào)道于1991年。陳幸華[83]以3%蔗糖和0.5%瓊脂的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入NAA、KT、BA和2，4-D和不同劑量的活性炭研究椰子胚的離體培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果表明，活性炭不僅能防止褐變，還可以提高成苗率。1997年，國內(nèi)學(xué)者開始探索椰子幼嫩花序離體培養(yǎng)的器官發(fā)生途徑，誘導(dǎo)幼嫩花序產(chǎn)生愈傷組織，后期花序軸的根部長出嫩芽，繼續(xù)培養(yǎng)后形成了具有根、葉結(jié)構(gòu)的完整植株[1]。在以離體胚為外植體進(jìn)行培養(yǎng)的過程中，研究發(fā)現(xiàn)5%蔗糖濃度的培養(yǎng)基最適于進(jìn)行椰子合子胚的離體培養(yǎng)[84]。2010年，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所以椰子成熟胚和幼嫩花序?yàn)檎T導(dǎo)材料研究了愈傷組織誘導(dǎo)及其褐變的控制，研究結(jié)果表明長度為16.5 cm佛焰苞（幼花序）誘導(dǎo)效果最好;含有25 mg/L 2，4-D、2.5 g/L活性炭和5 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的Y3培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高且對(duì)材料褐變有抑制作用[85]。在愈傷組織誘導(dǎo)和體胚誘導(dǎo)中，通常以添加2，4-D、麥草畏、NAA等激素的Y3培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基。2014年，國內(nèi)學(xué)者使用布迪椰子（Butia capitata或凍子椰子）種子成熟胚和含有0.5 mg/L NAA，0.5 mg/L 2，4-D，0.5 mg/L BAP，60 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)出的愈傷組織效果最好[86]。

綜上所述，國內(nèi)的椰子組培快繁研究起步較晚。從研究的主體來看，主要集中于培養(yǎng)基的研究，缺乏對(duì)于椰子組培快繁的全過程研究以及基于組培技術(shù)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究;從外植體的角度來看，主要采用比較簡便易行的體細(xì)胞培養(yǎng)（如花序）或整胚作為外植體進(jìn)行試驗(yàn)，缺乏使用主流高產(chǎn)外植體如胚芽進(jìn)行研究。國內(nèi)的椰子無性繁殖研究與此領(lǐng)域內(nèi)的領(lǐng)先國家，如墨西哥、澳大利亞、印度尼西亞、越南、印度、斯里蘭卡等國仍有明顯差距。

7 ?存在問題與展望

7.1 ?存在問題

40年來國內(nèi)外對(duì)椰子組織培養(yǎng)進(jìn)行了大量的研究，在理論、操作等方面取得了進(jìn)步并初步建立了組培快繁體系，但尚未成熟，未被廣泛推廣和應(yīng)用[2]。目前還有很多部分解決或未解決的問題，例如外植體對(duì)于組培的響應(yīng)不同、試管苗生長緩慢、移栽田間的試管苗缺乏活力等[3]。Gichner等[87]認(rèn)為組培技術(shù)無法推廣的原因主要有以下五點(diǎn)：技術(shù)不成熟、時(shí)間長且成本高;長期無法解決工程學(xué)、生物學(xué)對(duì)組培的限制;無性繁殖植株質(zhì)量極低;復(fù)合人才缺乏。針對(duì)椰子組培來說，有以下技術(shù)難點(diǎn)：首先合子胚的培育效率較高但合子胚多為雜合子，無法在早期確定組培苗的性狀，需等待數(shù)年至結(jié)果才可觀測;其次親本基因型、人員技術(shù)、內(nèi)源及外源污染、生長微環(huán)境變化、組織褐化、不成熟的煉苗技術(shù)均對(duì)椰子組培的結(jié)果產(chǎn)生巨大影響，損失率高;技術(shù)重復(fù)性較差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大。不同批次的椰果、試劑、操作人員、操作環(huán)境等因素的差異都有可能導(dǎo)致試驗(yàn)無法重復(fù)。同時(shí)其他棕櫚類組培結(jié)果顯示，組培苗移栽大田后可能會(huì)出現(xiàn)大量未知變異。憑借目前的技術(shù)，此類變數(shù)在組培階段無法預(yù)測。

在椰子組培技術(shù)的回報(bào)率與商業(yè)化推廣目前尚不明確的情況下，如何推廣現(xiàn)有成熟的椰子組培技術(shù)（如胚培養(yǎng)技術(shù)）是目前行業(yè)存在的主要問題之一。當(dāng)下組培技術(shù)成本較高，對(duì)于發(fā)展中國家更是如此。椰子十大主產(chǎn)國為印度尼西亞、菲律賓、印度、巴西、斯里蘭卡、越南、巴布亞新幾內(nèi)亞、墨西哥、泰國和馬來西亞，這些國家多為發(fā)展中國家，科研水平較低、科研投資較少，部分國家不具備獨(dú)立完成椰子組培工作的軟、硬件實(shí)力和經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)。商業(yè)組培的成本主要包含組培實(shí)驗(yàn)室建筑及內(nèi)部布置費(fèi)用、試劑耗材費(fèi)用和基本的水電運(yùn)行費(fèi)用。國際原子能機(jī)構(gòu)（IAEA）與世界糧農(nóng)組織（FAO）對(duì)印度調(diào)研后發(fā)現(xiàn)，在印度設(shè)立一家低成本、中等規(guī)模（可生產(chǎn)儲(chǔ)存20萬株左右的組培苗）的組培工廠（195 m2），土地費(fèi)用和改建費(fèi)用可達(dá)6.25萬美元，設(shè)備租用費(fèi)為5000美元/年[88]。因此組培技術(shù)只能用于具有高價(jià)值的植物種類[89]。一些發(fā)展中國家的學(xué)者采取試劑替代品希望能在硬件方面降低成本，如Bhattacharya等[90]采用2種印度常見植物西谷椰子（Metroxylon sagu Rottb.）和卵葉車前（Plantago ovata Forsk.）的提取物作為瓊脂的廉價(jià)替代物，同時(shí)使用濾紙、尼龍布、聚苯乙烯泡沫（polystyrene）和玻璃棉（glass wool cloth）作為支撐材料。Shivakumar等[91]提出使用殼聚糖（chitosan）作為一種低成本抗菌劑以減少內(nèi)生菌的污染。但對(duì)于成本占比最高的人工成本（如技術(shù)員、勞工、檢測員、銷售市場人員）及人員招募、培訓(xùn)費(fèi)用目前仍無有效的解決辦法[92]。Gichner等[87]也認(rèn)為在組培過程中轉(zhuǎn)移體胚、嫩芽、植株等植物組織的步驟對(duì)實(shí)操技術(shù)要求較高。不僅如此，目前組培技術(shù)商業(yè)化產(chǎn)生的高額運(yùn)營成本[89]也導(dǎo)致該技術(shù)無法廣泛使用。

7.2 ?未來展望

包括生物反應(yīng)器（bioreactor）在內(nèi)的各種新型生物技術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于植物的組培快繁技術(shù)，但是目前在椰子組培中還未見報(bào)道。Nguyen等[3]認(rèn)為，未來的椰子組培研究方向應(yīng)著重于改良培養(yǎng)基和建立懸浮培養(yǎng)體系（suspension culture system），以提升生產(chǎn)體胚的效率，同時(shí)在煉苗步驟中也應(yīng)更多地關(guān)注間歇浸沒系統(tǒng)（temporary immersion system）與光能自養(yǎng)系統(tǒng)（photoau-to?trophic systems）。目前已出現(xiàn)一些專門針對(duì)植物組織培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，如筏式/噴霧式生物反應(yīng)器，其中間歇浸沒系統(tǒng)使用較為廣泛[93]。與固體、半固體、液體培養(yǎng)相比，間歇式浸沒培養(yǎng)可提高繁殖系數(shù)，同時(shí)減少勞動(dòng)力、提高試管苗質(zhì)量、增加馴化成活率，但其勞動(dòng)力成本僅為固體培養(yǎng)的一半[94]，總成本可降低20%[95]。將組培苗從試管環(huán)境中轉(zhuǎn)移至室外環(huán)境是勞動(dòng)密集型的工作，使用大批量生產(chǎn)技術(shù)可減少12%的成本支出，使用改良的組培方法可以減少24%，而使用半自動(dòng)設(shè)備的成本降低幅度可達(dá)35%[87]。Nguyen[3]認(rèn)為，在未來可以嘗試使用含有多種有益成分的“液體胚乳”——椰子水作為液體培養(yǎng)基。同時(shí)，可通過研究體胚生成的相關(guān)基因來實(shí)現(xiàn)椰子組培技術(shù)效率的提升。通過了解椰子體胚發(fā)生基因的作用機(jī)理，可以篩選出更適于椰子組培的親本材料以減少組培工作對(duì)于椰子種果的需求。

國際合作在椰子組培以及相關(guān)領(lǐng)域的作用越來越重要。通過各國間的椰子種質(zhì)資源互換和組培技術(shù)交流，椰子組培技術(shù)在全世界很多國家生根發(fā)芽。目前墨西哥尤卡坦科學(xué)研究中心（CICY）、澳大利亞昆士蘭大學(xué)（The University of Queensland）掌握了使用胚芽誘導(dǎo)愈傷組織生成植株的核心技術(shù);法國農(nóng)業(yè)國際合作研究發(fā)展中心（Centre de coopération internationale en recherche agronomique pour le développement， CIRAD）在胚培養(yǎng)技術(shù)以及生物反應(yīng)器等方面處于領(lǐng)先;斯里蘭卡椰子研究所（Coconut Research Institute of Sri Lanka）則掌握了以子房和花藥為外植體的椰子組織培養(yǎng)的核心技術(shù)。通過與以上這些研究機(jī)構(gòu)的學(xué)術(shù)交流，可以增強(qiáng)椰子組培技術(shù)的通用性。目前包括中國在內(nèi)的39個(gè)椰子生產(chǎn)國加入了國際椰子遺傳資源網(wǎng)（International Coconut Genetic Resources Network， COGENT）致力于椰子產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展以及椰子繁殖技術(shù)的推廣。包括椰子組培在內(nèi)的國際技術(shù)合作已經(jīng)引起了各國的重視，將來國際合作一定會(huì)為椰子組培事業(yè)帶來全新的動(dòng)力。

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