釀酒酵母全基因組學及其應用研究進展

陳碧燕 文 李

(長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114)

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在人類日常生活中占據(jù)重要地位，并一直被廣泛應用于釀酒、面包生產等食品發(fā)酵工業(yè)中。自20世紀70年代起，釀酒酵母的生物學研究便受到研究者的重視，并為探討釀酒酵母的基因組積累了大量基礎知識。釀酒酵母逐漸成為研究真核生物遺傳機理及蛋白質相互作用的重要模式生物及應用工具。1989年，F(xiàn)ields等[1]建立了酵母雙雜交系統(tǒng)，并被廣泛用于蛋白質相互作用的研究[2]。1996年，釀酒酵母全基因組測序完成。釀酒酵母作為第一個完成全基因組測序的真核生物，不僅為真核生物基因組的研究提供了豐富的基因序列信息，也促使其成為基因組學和遺傳學研究的重要工具，為人類能更進一步探討高等生物基因信息打下了基礎。文章擬對釀酒酵母近年來在功能基因組學、比較基因組學、合成基因組學等方面獲得的重大研究進展進行綜述，并對其繼續(xù)深入研究的方向及應用開發(fā)的前景進行展望，旨在為釀酒酵母在工業(yè)發(fā)酵等領域的應用及深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫基本信息

釀酒酵母基因組信息匯總于酵母基因組數(shù)據(jù)庫(Saccharomyces Genome Database，SGD)，并不斷更新。釀酒酵母基因組共有16條染色體，基因組總序列為12.052 Mb，共包括6 275個基因，其中5 885個基因被鑒定為可編碼蛋白基因，即全基因組平均每隔2 kb就存在一個可以編碼蛋白質的基因。因此72%的核苷酸序列是開放閱讀框 (Open Reading Frames，ORF)，每個ORF的平均長度是1 450 bp，共483個密碼子[3]。最長的ORF位于釀酒酵母第12號染色體(ChrXⅡ)長末端，含140個編碼rRNA的基因，即4 910個密碼子。另外，40個編碼snRNA(Small Nuclear RNA)的基因以及275個編碼tRNA的基因也廣泛分布于16條染色體上。此外，編碼基因(大多數(shù)為tRNA基因)中約有4%內含子，這些內含子大部分位于靠近rRNA基因的上游，缺失突變體的覆蓋率超過90%。研究[4-6]顯示整個釀酒酵母的基因組約有31%的基因與人類基因組同源。全蛋白質組研究[7]顯示，細胞內有11%蛋白質與新陳代謝有關，3%涉及能量生成與儲存，3%參與DNA復制、修復和重組，并分別有7%，6%參與細胞核內的調控轉錄和翻譯；整體上，約有430個蛋白質參與調控胞內物質運輸及蛋白質識別標記，而另外250個蛋白質被鑒定為參與細胞結構形成。

2 釀酒酵母功能基因組學研究

功能基因組學(Functional Genomics)是一門旨在基因組和系統(tǒng)水平上研究基因功能的科學。為了更系統(tǒng)地研究基因功能，建立了以大規(guī)模數(shù)據(jù)統(tǒng)計、計算機分析和高通量為主要特征的功能基因組學，也被稱為“后基因組學”。釀酒酵母全基因組數(shù)據(jù)庫及共享平臺的建立，不僅為科研人員提供了豐富的遺傳數(shù)據(jù)信息，也為釀酒酵母的功能基因組學研究打下了良好基礎。

2.1 功能基因組學的主要研究方法

自釀酒酵母基因組測序完成后，如何將生物體中核酸序列與其發(fā)育與行為聯(lián)系起來成為科學家們的主要研究方向，因此釀酒酵母成為了研究功能基因組學的重要模式生物[8-9]。釀酒酵母的功能基因組學研究內容包括通過計算機網絡、數(shù)據(jù)庫和應用軟件等對釀酒酵母的核酸序列和蛋白質氨基酸序列進行分析，并解釋其在生物體中執(zhí)行的功能和在結構中表達的生物學信息[10]。

2.1.1 序列分析技術 生物芯片技術(DNA Microarray)是鑒定未知酵母功能基因的最基本方法[11-12]，是一種將物理半導體工業(yè)技術和生物DNA雜交探針技術相結合的技術，可以高通量檢測和分析分子雜交信號，進而能夠獲得樣本中核酸的數(shù)量和序列遺傳信息[13]。Shepard等[14]免疫沉淀RNA轉運成分，并對其相關RNA進行DNA微陣列分析，鑒定了22個位于芽尖的mRNA。Johansson等[15]對3個同步的酵母細胞微陣列數(shù)據(jù)集分別進行了分析和組合分析，認為在組合數(shù)據(jù)集中監(jiān)測的6 178個轉錄物中有455個轉錄物與細胞周期偶聯(lián)的周期性相關。Cheng等[16]提出了一種通過整合微陣列細胞周期數(shù)據(jù)與ChIP芯片數(shù)據(jù)或基序發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)以識別細胞周期調控轉錄因子的兩步方法，并鑒定出釀酒酵母中42個細胞周期調控轉錄因子，其中23個已通過實驗驗證其功能。Kim等[17]優(yōu)化了酵母陣列的雜交過程，優(yōu)化后的微陣列更適用于分析和鑒定未知功能基因的基因功能。

隨著轉錄組學的發(fā)展，科研人員對釀酒酵母的轉錄組進行基因功能注釋及基因表達數(shù)據(jù)比較分析，能夠更準確地分析目標基因的分子功能、所處的細胞位置、參與的生物過程，并能更系統(tǒng)地研究釀酒酵母多個基因或蛋白質功能及其之間的聯(lián)系與作用[18]。如Bono等[19]通過使用GO數(shù)據(jù)庫注釋釀酒酵母的基因功能，分析基因之間的協(xié)同表達。

2.1.2 功能試驗技術 酵母中的功能互補試驗是研究用于人類基因功能的一個常見方法。其研究原理為：如果一個未知功能的人類基因可以補償具有已知功能變異基因酵母突變體，說明這兩個基因具有類似的功能；反之，可以利用一些功能已知的人類基因，通過互補試驗解釋酵母中相關的基因功能及機制。如Osborn等[20]詳細描述了互補試驗所需的一些技術要求，并概述了酵母突變體與人類基因互補的研究進展。其中最典型的酵母互補試驗為：人類基因組中3個與半乳糖血癥相關的基因，即UDP-半乳糖轉移酶(GALT)、半乳糖激酶(GALK2)和UDP-半乳糖異構酶(GALE)，可分別與酵母基因組中的GAL7、GAL1和GAL10基因相互補償[21]。

2.2 釀酒酵母功能基因組學在工業(yè)中的應用

隨著酵母功能基因組的發(fā)展與基因功能鑒定信息的更新，越來越多有利于工業(yè)化生產的基因通過基因工程技術被應用于工業(yè)生產中。同時，將不利于工業(yè)應用生產的基因進行敲除處理，打破傳統(tǒng)的酵母菌株篩選技術，降低工業(yè)生產成本，從而提升發(fā)酵食品的感官風味。對釀酒酵母基因突變體的系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)基因序列微小的改變會導致相應的基因的功能改變[22]。因此，研究基因組序列的差異，找出突變基因，可為通過基因工程指導優(yōu)良新型菌株的構建提供依據(jù)，并應用于現(xiàn)代乙醇發(fā)酵工業(yè)生產中。如利用DNA重組技術使酵母中脅迫耐受性基因表達上調，重新編程促進乙醇代謝途徑，可以實現(xiàn)耐受性酵母菌株的開發(fā)[23]。經不同種類的酵母發(fā)酵所生產酒的風味不同，所以對產生獨特風味基因的鑒定并實施改造具有重要意義。Sun等[24]研究鑒定TIR1和GAP1基因是酵母中乙醇代謝的關鍵調控基因，該研究闡明了乙醇的代謝途徑，并為提高小麥啤酒中乙醇含量的研究提供了新策略。

3 釀酒酵母比較基因組學研究

比較基因組學(Comparative Genomics)是在基因序列和基因組圖譜基礎上，對已知物種的基因組序列或結構進行比較，分析解讀基因的功能、表達機理以及闡明在物種基因組之間序列和結構上的同源性，進而揭示物種進化過程的內在聯(lián)系的科學[25]。酵母比較基因組學研究有助于生物學家深入了解真核生物基因組的進化過程；物種間的基因組差異和表型差異分析可為基因功能的鑒定研究提供更多數(shù)據(jù)支持[26]。

3.1 釀酒酵母比較基因組研究現(xiàn)狀

Clayton等[27]比較了釀酒酵母、古菌及細菌的全基因組，發(fā)現(xiàn)這幾種非親緣生物共有53個相同的COGs(Clusters of Orthologous Groups)。Tatusov等[28-30]對蛋白組序列進行了更深入的同源分析，發(fā)現(xiàn)有720個COGs；通過對7種高等真核生物全基因組的進一步深入比較發(fā)現(xiàn)，其可歸類為5個系統(tǒng)發(fā)育系，并建立了KOGs(Eukaryotic Orthologous Groups)數(shù)據(jù)庫，為真核生物轉錄組和蛋白組的功能鑒定及研究提供了數(shù)據(jù)平臺。

Souciet等[31]對釀酒酵母中被稱為“原倍體”的5種酵母基因組進行比較，鑒定出原倍體酵母的核心遺傳庫(核心蛋白質組)是由大約3 300個蛋白質家族組成，其分布在酵母蛋白組大約5 000個家族的泛蛋白質組中，并且具有高度保守的同源性。Gallone等[32]比較分析了157種工業(yè)釀酒酵母的基因組和表型，并將當今工業(yè)酵母分為5個亞系，且在遺傳和表型上均與野生菌株發(fā)生分離；其起源于少數(shù)祖先，通過復雜馴化和局部分化進化為現(xiàn)代工業(yè)酵母。Marsit等[26]通過總結大量釀酒酵母比較基因組學及進化過程相關的研究，發(fā)現(xiàn)酵母進化過程中積累了基因組變化及可能導致的生殖隔離；并論述了雜交在物種形成機制中的作用，以及基因組變化的長期進化后果。Rhind等[33]對4種已知的裂變酵母(即裂殖酵母、日本裂殖酵母、裂殖酵母和八面裂殖酵母)的基因組進行比較，發(fā)現(xiàn)盡管裂殖酵母在形態(tài)上相似，但裂殖酵母分支的進化距離比脊椎動物之間的更大，而這種巨大的進化距離為真核基因組的進化研究提供了新思路。

大約10億年前，人類和釀酒酵母分別與其共同祖先的基因分道揚鑣，但這兩個基因組共有數(shù)千個同源基因，占酵母基因組的1/3以上[34]。酵母和人類的基因具有不少同源序列，但其差異較大。氨基酸同源比例從9%～92%不等，全基因組平均同源比例為32%[4]。因此，釀酒酵母作為一種真核模式生物，對人類基因組的研究有著重大貢獻。通過與人類基因組進行比較，發(fā)現(xiàn)酵母與人類之間的全基因組序列的同源性可揭示高等生物和簡單生物物種間進化的內在關系[35]。如人類中3個半乳糖血癥相關基因均能在酵母中找到相互補償?shù)幕騕21]。

3.2 釀酒酵母比較基因組學在工業(yè)中的應用

比較基因組學研究對發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵菌株的選取和改良具有重要意義，可以為工業(yè)生產中菌株篩選與改造提供科學依據(jù)。在酒類行業(yè)中，Borneman等[36]通過對不同葡萄酒酵母菌株的基因組進行比較分析，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄酒酵母菌株之間的遺傳變異，并將其應用于菌株開發(fā)；釀酒師也可根據(jù)此發(fā)現(xiàn)快速改良優(yōu)質酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，為不斷變化的新市場提供量身定制的葡萄酒感官特性。Li等[37]從中國黃酒中分離釀酒酵母菌株YHJ7，通過比較其與實驗室菌株S288c、日本清酒菌株K7及中國工業(yè)生物乙醇菌株YJSH1的基因組，發(fā)現(xiàn)YHJ7菌株的許多差異基因組序列，這些差異在菌株之間的基因組進化中起重要作用，為基因工程改良工業(yè)釀酒用菌株提供了寶貴的資源。Souciet等[31]比較分析了157種工業(yè)釀酒酵母的基因組和表型，發(fā)現(xiàn)這些菌種在脅迫耐受性、糖利用及風味產生等方面進行各自特定的生存選擇，為工業(yè)生產深入選擇優(yōu)質菌株提供了資源。

4 釀酒酵母合成基因組學研究

近年來，大量測序數(shù)據(jù)有助于發(fā)現(xiàn)新的酶及其相關代謝途徑，也加快了異源宿主中代謝途徑的從頭構建的研究[38-39]；同時由于CRISPR-Cas9基因組編輯的發(fā)展[40]，極大地增強了對一個或幾個特定基因組位點進行改變的能力。此外，DNA從頭合成技術的進步使合成基因組學(Synthetic Genomics)這一門科學快速興起，即可通過大規(guī)模的工程化設計及遺傳操作，將人工合成的DNA序列進行組裝拼接，合成具有生物學功能的新基因組，創(chuàng)造出全新的生命體。

4.1 釀酒酵母基因組合成計劃

1970年，Agarwal等[41]成功合成了77 bp雙鏈DNA編碼的酵母tRNA，打開了合成基因組學的領域。2002年，小型病毒基因組[42]合成后，同時隨著DNA組裝和重寫技術的進步，使細菌基因組的合成成為可能。2008年完成了生殖支原體(M.genitalium)基因組的化學合成[43]；2010年，Gibson等[44]采用合成基因組構建了細菌細胞。上述研究為真核生物基因組的合成打下了基礎。

釀酒酵母基因組合成計劃(Sc.2.0)是人類首次嘗試人工合成單細胞真核生物基因組的計劃，由分別來自中國、英國、美國、法國、澳大利亞和新加坡等國家的科學家共同合作推動并分工完成合成計劃。該合成計劃的目的主要是對釀酒酵母的全部染色體進行重新設計并人工合成，進而得到人工合成的釀酒酵母細胞，助于科學家們更深入地了解染色體以及基因組的結構功能[45]。

SwAP-In的基因組構建策略的發(fā)明及實施，完成了功能性的272 871個堿基對的真核染色體synIII的設計合成[46-47]，并得到了僅有兩條染色體的釀酒酵母[48]； Shao等[49]通過端粒敲除和染色體融合，將含16條線性染色體的釀酒酵母改造成一個全新的功能性的單染色體釀酒酵母，該合成生物學的研究成果為探索真核生物的染色體結構和功能提供了一條新途徑。

4.2 釀酒酵母合成基因組的應用

在釀酒酵母基因組計劃中，化學合成的酵母染色體過程中有一項設計特征，即在每一個非必需基因的終止密碼子之后插入loxP位點，可引起基因重組，這個過程稱為SCRaMbLE(Synthetic Chromosome Rearrangement and Modification by LoxP-mediated Evolution，SCRaMbLE)。Dymond等[46]展示了SCRaMbLE作為組合誘變的一種新方法的實用性，其能夠產生復雜的基因型和表型，完全合成的基因組將允許酵母基因組的大規(guī)模重組如單基因區(qū)段缺失、復制、易位等，這種基于基因含量和拷貝數(shù)的隨機變化為遺傳學的研究提供了豐富的研究材料。Shen等[50]進一步證明了SCRaMbLE重排僅發(fā)生在設計的loxP位點，沒有關于異位點重排或涉及其他合成區(qū)域，因此不會引起野生型的基因重組；并對64種synIXR SCRaMbLE菌株進行了基因測序，發(fā)現(xiàn)每一種SCRaMbLE菌株的重排形式都不一樣，從而驗證了SCRaMbLE具有探索基因組多樣化空間的潛力。

由于SCRaMbLE系統(tǒng)這種能快速產生大量因組結構進而產生具有基因組多樣性的菌株的特點，使其成為一種有助于快速篩選特定表型菌株的有效工具。在現(xiàn)代工業(yè)實際生產過程中，酵母在工業(yè)發(fā)酵時經常需要承受各種不同的環(huán)境壓力，因此可以通過SCRaMbLE基因組重排系統(tǒng)，促進工業(yè)菌株快速進化，提高菌株對各種環(huán)境壓力的承受能力。如Luo等[51]基于兩個營養(yǎng)缺陷型標記的loxP介導的開關，描述了使用有效選擇的SCRaMbLEd細胞的報告基因的ReSCuES系統(tǒng)，使用ReSCuES揭示了SCRaMbLE具有產生對某些脅迫因素(例如乙醇、熱和乙酸)具有更高耐受性的菌株的能力，通過進一步分析耐性菌株鑒定出轉錄因子ACE2作為乙醇耐受性的負調節(jié)劑。

Xie等[52]構造了一個含有環(huán)狀synV染色體的釀酒酵母衍生物，并發(fā)現(xiàn)該衍生物在所有測試條件下具有釀酒酵母完全功能，但在細胞減數(shù)分裂過程中的孢子活力表現(xiàn)為較低；環(huán)狀synV染色體的發(fā)現(xiàn)是對Sc2.0設計方向的一種擴展，并為科學家們研究基因組重排、環(huán)狀染色體進化以及人類環(huán)狀染色體遺傳疾病提供了一個模型。Truong等[53]合成一株用人類核小體代替酵母核小體酵母，揭示了人源化的核小體是如何根據(jù)內源性酵母DNA序列和染色質來重塑網絡定位的，并對核小體的功能有了進一步的認識。目前關于釀酒酵母合成基因組大多數(shù)研究依舊停留在實驗室階段，與真正的工業(yè)化推廣應用仍有一定的距離，但是可以預測其具有推動醫(yī)學和發(fā)酵行業(yè)發(fā)展的巨大潛力。

5 總結與展望

釀酒酵母基因組研究的巨大進步，尤其是合成基因組學研究領域所取得的科研成果，不僅快速推動了基因組學的發(fā)展，并且為工業(yè)生產和人類疾病預防打下了堅實基礎。釀酒酵母基因組在工業(yè)上的應用具有巨大的潛力，功能基因組學、比較基因組學、基因工程及雜交技術等相結合，可以加深對現(xiàn)代化工業(yè)生產有利的基因的研究與開發(fā)，并最終通過生物工程技術將其廣泛應用于生產實踐中，實現(xiàn)對可再生資源的充分利用，緩解全球能源緊張問題以及使工業(yè)生產成本有效降低。而在與生物科學相關的領域，釀酒酵母全基因組的研究均不同程度地推動了各類基因組學的快速發(fā)展，對基因組同源性以及追溯物種進化過程的研究有重要意義，也為高等生物的遺傳研究提供了良好的參考模型和研究平臺。隨著計算機信息技術和測序技術等高通量技術的發(fā)展，以及合成生物學研究的興起，釀酒酵母基因組將繼續(xù)在工業(yè)發(fā)酵等領域展現(xiàn)巨大潛力。