1株抗煙草青枯病菌拮抗菌的篩選及鑒定

王磊 王興蘭 郭瑞

摘 要：在黔南煙區(qū)煙草青枯病嚴(yán)重發(fā)病的田塊采集健康煙草根際土壤進(jìn)行分離、純化和培養(yǎng)后共獲得35株細(xì)菌，通過(guò)抑菌圈法篩選出2株對(duì)煙草青枯病菌具有良好拮抗效果的菌株S3-1和S3-2，抑菌圈直徑分別為1.3cm和1.4cm，抗青枯病的模式菌FZB抑菌圈為1.3cm;通過(guò)對(duì)目標(biāo)菌株S3-2開展16S rDNA序列測(cè)定，并對(duì)測(cè)序結(jié)果開展BLAST比對(duì)，初步鑒定出S3-2菌株屬于芽孢桿菌屬。

關(guān)鍵詞：煙草青枯病菌;根際細(xì)菌;拮抗菌;分子生物學(xué)鑒定

Abstract：Collecting healthy tobacco rhizosphere soil from fields with severe incidence of tobacco bacterial wilt in Qiannan tobacco area，35 strains of bacteria were obtained after isolation，purification，and cultivation. Two strains were screened out with good antagonistic effects against tobacco bacterial wilt by the inhibition zone method. The diameters of the inhibition zone of the strains S3-1 and S3-2 are 1.3cm and 1.4cm，respectively. The inhibition zone of bacterial wilt resistance model FZB is 1.3cm. By sequencing the 16S rDNA of the target strain S3-2 and comparing the sequencing results with BLAST，the strain S3-2 was preliminarily identified as bacillus.

Key words：Tobacco bacterial wilt;Rhizosphere bacteria;Antagonistic bacteria;Molecular biological identification

由青枯雷爾氏菌引起的細(xì)菌性土傳性病害煙草青枯病危害范圍廣泛，對(duì)我國(guó)煙草種植業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。通過(guò)篩選有效的生物防治細(xì)菌進(jìn)行生物防治是一種安全無(wú)害且長(zhǎng)效的方法[2]。微生物有機(jī)肥不僅可以降低青枯病的發(fā)病率，而且還能為煙株提供營(yíng)養(yǎng)，改善土壤環(huán)境[3]。與常用的化學(xué)防治方法相比，生物防治具有成本低、效果持久以及無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)[4]。畢濤[5]在山東煙區(qū)根際土壤中分離出3株具有最佳抑菌效果的菌株Cla、Tsb、C2c，經(jīng)鑒定均為多粘類芽孢桿菌;董昆明等[6]從黔江煙區(qū)根際土壤中分離得到的5B18菌株經(jīng)鑒定是解淀粉芽孢桿菌。由此可見(jiàn)，篩選抗性菌株對(duì)青枯病等病害進(jìn)行生物防治是當(dāng)前熱門的研究課題之一。本研究從發(fā)病田塊的健康煙草植株根際土壤樣品中篩選出2株對(duì)青枯病菌具有良好抗性的菌株，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以期為開發(fā)綠色生物肥料、防治病害、改良土壤環(huán)境提供物質(zhì)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 試驗(yàn)所用的煙草青枯病病原菌來(lái)源于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室，從黔南煙區(qū)的健康植株根際土壤中分離得到所需的煙草根際細(xì)菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 煙草根際細(xì)菌分離、培養(yǎng)、篩選均使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，瓊脂15g，水1000mL，pH 7.0～7.2[7];青枯病病原菌培養(yǎng)使用TCC培養(yǎng)基：蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，加入1%TTC，瓊脂15g，水1000mL，pH 7.0～7.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種初篩 按梯度稀釋土壤樣品。取1g土壤樣品置于裝有9mL無(wú)菌水的滅菌試管內(nèi)，并將其混合均勻得到10-1土壤稀釋溶液;取1mL該土壤稀釋液，轉(zhuǎn)移至裝有9mL無(wú)菌水的新試管內(nèi)，充分混合得到10-2土壤稀釋溶液[8];以此類推，同樣操作得到10-5、10-6、10-7土壤稀釋溶液。分別吸取100μL 10-5、10-6、10-7土壤稀釋液涂布到NA固體培養(yǎng)基內(nèi)，將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后挑取形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 高效生防菌的篩選 取1mL濃度為1×[106]CFU/mL的煙草青枯病菌懸浮液，在TTC培養(yǎng)基滅菌后且溫度冷凝到一定程度后混合均勻倒平板，制成含煙草青枯病菌的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基平板背面距離中心2.5cm處做上標(biāo)記，每個(gè)平板4個(gè)角落各做1個(gè)標(biāo)記，然后將滅好菌的牛津杯（孔直徑為6mm）置于背面做好位置標(biāo)記的培養(yǎng)基上，分別取150μL提前制備好的煙草根際細(xì)菌菌懸液置于牛津杯孔內(nèi)并做好標(biāo)記，將FZB生防菌菌懸液放入第4個(gè)牛津杯中作為對(duì)照。置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后測(cè)定抑菌圈大小。每個(gè)處理重復(fù)3次。通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑，篩選出對(duì)煙草青枯病菌拮抗效果較好的細(xì)菌。

1.3 菌種分子鑒定 16S rDNA PCR擴(kuò)增[9]：PCR擴(kuò)增引物用27F和1492R，PCR擴(kuò)增體系：滅菌去離子2l?L，GoTaq?Green Master Mix 25?L，DNA模板2?L，2個(gè)引物各1?L，體系共計(jì)50?L;PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變3min，94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸100s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min;PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)：取5?L的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用移液槍在提前配制好的已經(jīng)凝固的1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，之后進(jìn)行電泳，25min左右在紫外燈下對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，記錄目的片段擴(kuò)增情況;將擴(kuò)增的樣品送測(cè)序公司測(cè)序，結(jié)合測(cè)序結(jié)果在NCBI官網(wǎng)開展BLAST比對(duì)，進(jìn)而對(duì)篩選出來(lái)的菌株進(jìn)行初步鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌菌株的分離篩選 經(jīng)過(guò)稀釋涂布法篩選共獲得35株細(xì)菌，通過(guò)抑菌圈法篩選出2株細(xì)菌S3-1、S3-2，對(duì)煙草青枯病病原菌均具有拮抗作用，其中S3-1抑菌圈為1.3cm，S3-2抑菌圈為1.4cm，抗青枯病模式菌FZB抑菌圈為1.3cm（圖1）。因此選擇S3-2進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.2 16S rDNA基因序列測(cè)定以及分子學(xué)鑒定 通過(guò)對(duì)菌株S3-2進(jìn)行16S rDNA基因序列測(cè)定，對(duì)測(cè)序結(jié)果開展BLAST比對(duì)，初步鑒定菌株為芽孢桿菌屬。

3 結(jié)論與討論

本次研究采取梯度稀釋分離法和平板涂布純化法對(duì)煙草根際土壤進(jìn)行分離和純化培養(yǎng)，共得到35株疑似生防菌，通過(guò)抑菌圈法發(fā)現(xiàn)其中2株具有抑菌效果，分別是S3-1菌株和S3-2菌株，S3-2抑菌能力優(yōu)于抗青枯病模式菌FZB，因此使用S3-2作為后續(xù)試驗(yàn)鑒定的主要菌株。通過(guò)對(duì)目標(biāo)菌株開展16S rDNA序列測(cè)定，并對(duì)測(cè)序結(jié)果開展BLAST比對(duì)，初步鑒定出S3-2菌株屬于芽孢桿菌屬。在后續(xù)試驗(yàn)中，S3-2的發(fā)酵液經(jīng)初步純化后應(yīng)用于青枯病菌的防控中，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果，因此可作為生物防治手段防治青枯病，同時(shí)也有助于改良土壤環(huán)境[10]。

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（責(zé)編：徐世紅）