HPLC-DAD法同時測定冠心康膠囊中4種活性成分的含量

黃潔文，陳燕霞，譚漢添

0 引言

冠心康膠囊是由丹參、赤芍、降香、紅花和川芎等藥材組成，目前的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ06522009，具有活血化瘀，行氣止痛等作用，臨床主要用于血瘀氣滯、心脈痹阻引起的冠心病、心絞痛等癥狀[1-4]。丹參中的脂溶性成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA具有舒張冠脈和動脈、保護心肌、抗氧化的作用[5-7]，赤芍中的芍藥苷也具有明顯的擴張心血管、改善微循環(huán)的作用[8-10]，二者的作用與其臨床藥效作用一致，但是現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對赤芍中的芍藥苷進行含量控制，對丹參只進行薄層鑒別，沒有對其含量進行質(zhì)量控制。冠心康膠囊處方中，丹參用量最大，且為方中君藥，在該方的活血化瘀藥效中發(fā)揮重要作用。目前，對冠心康膠囊的研究主要是針對赤芍中芍藥苷或者丹參中丹參酮ⅡA的單個含量測定[11-12]，尚未有對其多成分含量的同時測定，因此，筆者參考中國藥典和目前的文獻報道[13-16]，建立HPLC-DAD色譜法同時測定冠心康膠囊中芍藥苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量的方法，來更好地全面控制冠心康膠囊的質(zhì)量，為其進一步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實驗參考。

1 儀器與試藥

LC-2030高效液相色譜儀(日本島津儀器公司)；LC labsolution 工作站；SPD-M10A檢測器，Mettler AE240分析電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-700VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器公司)；冠心康膠囊(西安大唐制藥集團有限公司,規(guī)格：0.45 g/粒，批號：20170601、20170802、20180601)，對照品：芍藥苷(批號：110736-201136，質(zhì)量分數(shù)95.7%)，隱丹參酮(批號：110852-200305)，丹參酮ⅡA(批號：110766-200619，質(zhì)量分數(shù)98.9%)；丹參酮Ⅰ(批號：110867-201607，含量為99.3%)，對照品均購于中國食品藥品檢定研究院，乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為超純水(美國Mili-Q超純水機)；磷酸、甲醇等均為分析純(上海國藥集團化學(xué)試劑公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫0～12 min(15%～20%A)，12～20 min(20%～40%A)，20～30 min(40%～60%A)，30～50 min(60%～90%A)；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm(0～30 min)、270 nm(30～55 min)，進樣量：10 μl。在上述色譜條件下分別測定對照品、供試品溶液及陰性樣品溶液，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)、供試品溶液(B)、缺赤芍的陰性樣品(C)、缺丹參藥材的陰性樣品(D)的HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品12.28 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品儲備溶液Ⅰ，精密稱取丹參酮ⅡA 5.15 mg和隱丹參酮5.09 mg置同一25 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品儲備溶液Ⅱ，另精密稱取丹參酮Ⅰ對照品5.94 mg，置10 ml棕色容量瓶中，加二氯甲烷1 ml使溶解，然后用甲醇稀釋至刻度，作為對照品儲備溶液Ⅲ，分別精密吸取上述對照品儲備溶液I 5 ml、儲備溶液Ⅱ 2 ml、儲備溶液Ⅲ 1 ml置同一10 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液(每1 ml含芍藥苷245.6 μg、隱丹參酮40.72 μg、丹參酮Ⅰ 59.4 μg、丹參酮ⅡA 41.2 μg)。

2.3 供試品溶液的制備 取冠心康膠囊10粒，混勻研細，精密稱取粉末1.0 g置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理30 min(頻率：45 kHz，功率：280 W)，取出，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性樣品的制備 按照冠心康膠囊處方量的1/10，分別制備缺丹參藥材和赤芍藥材的陰性樣品，按照“2.3”項下的供試品溶液制備方法制備，按照“2.1”項的色譜條件測定，測定結(jié)果見色譜圖1，結(jié)果表明，陰性樣品對冠心康膠囊中4種成分的測定無干擾。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 將“2.2”項下的對照品混合溶液作為5號對照品溶液，另分別精密吸取“2.2”項下的對照品溶液各1 ml，分別置10、25、50 ml和100 ml 4個容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品4號、3號、2號和1號溶液，分別注入液相色譜儀，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，以待測成分進樣量的質(zhì)量(ng)為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 4種成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.6 精密度 取“2.2”項下的對照品儲備溶液，連續(xù)進樣6次，進樣量10 μl，測定各成分的峰面積，分別計算得芍藥苷峰面積RSD為0.36%，隱丹參酮峰面積RSD為0.52%，丹參酮Ⅰ峰面積RSD為0.41%。丹參酮ⅡA峰面積RSD為0.66%，結(jié)果表明，該儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗 穩(wěn)定性：取同一批供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、12、16、24 h進行測定，進樣量10 μl，連續(xù)考察24 h，記錄各成分的色譜峰面積，結(jié)果顯示，芍藥苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積RSD為1.22%、1.05%、1.56%、1.37%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗：取同一批號的冠心康膠囊樣品，按照“2.3”項下的方法制備6份供試品溶液，然后分別注入液相色譜儀進行測定，進樣量10 μl，結(jié)果顯示，芍藥苷峰含量的RSD為0.40%，隱丹參酮含量的RSD為0.36%，丹參酮Ⅰ含量的RSD為1.21%。丹參酮ⅡA含量的RSD為0.31%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的冠心康膠囊樣品0.50 g，共6份，另精密稱取芍藥苷42.26 mg，置10 ml量瓶中，精密吸取丹參酮Ⅰ對照品儲備溶液5 ml置上述同一10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為待加溶液1。精密稱取丹參酮ⅡA 18.13 mg和隱丹參酮6.03 mg置同一25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為待加溶液2。分別精密吸取上述待加溶液1和待加溶液2各1 ml置上述6份供試品中，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行含量測定，分別計算4個成分的回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，RSD均小于3.0%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 4個成分的加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.9 樣品的測定 取3個不同批號的冠心康膠囊樣品，按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法，每個批號分別制備3份，用“2.1”項下的色譜條件進行測定，結(jié)果求平均值，分別計算不同批次樣品中4個成分的含量，測定結(jié)果見表3。

表3 4種成分含量測定結(jié)果(n=3，mg/g)

3 討論

3.1 供試品制備的選擇 本實驗采用正交實驗對不同的提取溶劑(甲醇、50%甲醇、70%乙醇)對供試品溶液制備方法、不同的超聲時間(20、30、40 min)和不同的超聲功率(120、280、320 W)進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同溶劑對不同組分含量的影響較大，對超聲功率和時間基本影響不大，故選擇超聲時間30 min和頻率280 W。由于甲醇提取時隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量較大，50%甲醇提取時，丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量都下降50%；70%乙醇提取時，芍藥苷的含量稍大，丹參酮Ⅰ含量依舊比較低。由于處方中丹參占比較大，丹參中所測成分較多，且為方中主藥，綜合考慮選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2 流動相和檢測波長的選擇 實驗分別采用乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸，對流動相進行了考察。結(jié)果顯示，甲醇-0.1%磷酸作為流動相時，出峰時間較長，芍藥苷峰形較差，乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸作為流動相均可以洗脫分離，基線平穩(wěn)。但是乙腈-水作為流動相，芍藥苷峰形有拖尾現(xiàn)象。當(dāng)采用乙腈-0.1%磷酸作為流動相時，色譜峰形良好，對稱因子較高，拖尾現(xiàn)象明顯減少，最后確定乙腈-0.1%磷酸作為本實驗的流動相系統(tǒng)。同時，本實驗采用DAD檢測器對4個共有峰進行光譜掃描，結(jié)果顯示，芍藥苷在230 nm下具有最大吸收，隱丹參酮在265 nm、丹參酮Ⅰ在246 nm、丹參酮ⅡA在270 nm下具有最大吸收。筆者分別比較了230、250、270 nm下的結(jié)果，結(jié)果顯示，在230 nm下芍藥苷含量最高，270 nm下隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量之和最高，并與藥典中檢測波長一致，因此，本實驗選擇變化波長進行測定，從而保證各成分的靈敏度最高。

3.3 結(jié)果的判定 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，芍藥苷的含量為每粒不得少于2.6 mg。本實驗建立的3批樣品中，芍藥苷的含量折算成每粒均大于2.6 mg，均符合規(guī)定。丹參藥材在處方中占35.29%，2015年版《中國藥典》一部項下規(guī)定丹參藥材中含丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的總量不得少于0.25%，折算后本品每粒應(yīng)不得少于0.397 mg，轉(zhuǎn)移率按40%計算，本品每粒含3種丹參酮類化合物的總量應(yīng)不得少于0.159 mg，本實驗所測3批樣品含量均符合規(guī)定。

3.4 小結(jié) 本文建立了HPLC-DAD法同時測定冠心康膠囊中芍藥苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA 4種成分含量的方法，比現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅通過芍藥苷的含量進行控制更加全面，更能有效反映藥品的質(zhì)量，該方法經(jīng)方法學(xué)驗證，具有專屬性強、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點，可以用于冠心康膠囊中4種成分的含量測定。