差示掃描量熱法在對照品純度分析中的應(yīng)用—以大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為例

翟鐵偉

0 引言

熱分析技術(shù)是指采用如等速升降溫、恒溫等程序控溫手段來檢測物質(zhì)的溫度和物理化學(xué)性質(zhì)關(guān)系的一種技術(shù)[1-2]。此項(xiàng)技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高、快速等優(yōu)點(diǎn)，而且可以與其他分析方法聯(lián)合對物質(zhì)相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行測定。使用該技術(shù)可以檢測藥物在冷卻或加熱過程中所發(fā)生的物理或化學(xué)變化并予以分析，能夠提供可靠的參數(shù)供藥物分析使用[3-5]。

差示掃描量熱法(Differential scanning calorimetry，DSC) 是指對輸給參比物質(zhì)和供試品熱量差和溫度間的關(guān)系進(jìn)行測量的一項(xiàng)技術(shù)，屬于熱分析技術(shù)的一種，其在測定藥物的純度、熔點(diǎn)和多晶型等多個檢測項(xiàng)目中發(fā)揮著重要的作用[6-9]。定值是化學(xué)藥品對照品研究中最重要的部分，通常采用質(zhì)量平衡法。其中最關(guān)鍵的部分是對主要雜質(zhì)進(jìn)行分析，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中也常被稱為純度分析。色譜法是檢測化學(xué)藥品對照品純度最常用的方法，但當(dāng)樣品存在未知雜質(zhì)而其檢測響應(yīng)值出現(xiàn)差異或色譜法分離效果有限時，則雜質(zhì)含量可能無法被準(zhǔn)確測定[10]。需要檢測總雜質(zhì)絕對含量時，尤其是含有一定雜質(zhì)的低共熔體系，采用屬于熱分析技術(shù)的DSC是一種準(zhǔn)確可靠的技術(shù)方法。其具有操作簡單、所需試樣量少、快速、不需溶劑以及適合高純物分析等特點(diǎn)，尤其適用于化學(xué)藥品對照品的純度分析[11-13]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討DSC在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(克拉霉素,羅紅霉素)對照品純度分析中的應(yīng)用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 克拉霉素(批號:100507-201802)、羅紅霉素(批號:100504-201802)、二氫脫氧青蒿素(批號:100184-201802)和巰嘌呤(批號:100197-201803) 均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 主要儀器 熱重/差示(TGA/DSC1)同步熱分析儀、DSC823e 差示掃描量熱儀、ME-T 電子分析天平、標(biāo)準(zhǔn)鋁坩鍋40 μl：瑞士梅特勒-托利多(Mettler Toledo)公司；LC 16 高效液相色譜儀(配有Class VP 色譜工作站、島津二極管陣列檢測器)：日本島津公司；916 型電位滴定儀：瑞士萬通(Metrohm)公司。

1.2 方法

1.2.1 差示掃描量熱分析 在標(biāo)準(zhǔn)鋁坩鍋內(nèi)放入克拉霉素及羅紅霉素樣品各約1～5 mg，升溫速率設(shè)定為10 ℃/min和0.5 ℃/min，控制氮?dú)饬魉贋?0 ml/min,以10 ℃/min的寬溫度范圍進(jìn)行掃描分析，由Mettler Toledo 公司的STARe分析軟件計(jì)算樣品純度。

1.2.2 高效液相色譜分析 參考國家藥品標(biāo)準(zhǔn)，克拉霉素：系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與色譜條件下填充劑使用十八烷基硅烷鍵合硅膠；以乙腈-磷酸鹽緩沖液(稱量磷酸二氫鉀9.11 g，加水溶解并稀釋至1 000 ml，加三乙胺2 ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.5)(60∶40)為流動相；柱溫45 ℃；檢測波長為210 nm。理論板數(shù)不低于3 000；拖尾因子不得超過2.0；克拉霉素峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)良好。測定法：精密稱取適量克拉霉素，用流動相溶解稀釋制成濃度為0.35 mg/ml的待測溶液，精密吸取20 μl注入高效液相色譜儀，進(jìn)行純度分析。羅紅霉素：系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與色譜條件下填充劑使用十八烷基硅烷鍵合硅膠；以乙腈-磷酸鹽緩沖液(配制方法同上)(65∶35)為流動相；柱溫45 ℃；檢測波長為210 nm。理論板數(shù)不低于3 000；拖尾因子不得超過2.0；羅紅霉素峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)良好。測定法：精密稱取適量羅紅霉素，用流動相溶解稀釋制成濃度為0.35 mg/ml的待測溶液，精密吸取20 μl注入高效液相色譜儀，進(jìn)行純度分析。

1.2.3 熱重/差示掃描量熱同步分析(TGA/DSC) 在標(biāo)準(zhǔn)鋁坩鍋內(nèi)放入二氫脫氧青蒿素和巰嘌呤樣品各約2.0 mg，設(shè)置溫度范圍30～500 ℃，升溫速率為10 ℃/min，控制氮?dú)饬魉贋?0 ml/min，采用TGA/DSC1 同步熱分析儀進(jìn)行掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 差示掃描量熱分析結(jié)果 10 ℃/min的寬溫度范圍掃描分析，結(jié)果顯示，克拉霉素和羅紅霉素均為單一熔融吸熱峰(圖1)；隨后進(jìn)行針對性溫度窗口試驗(yàn)(圖2)，使用DSC純度分析軟件對克拉霉素熔融吸熱峰進(jìn)行分析，升溫速度0.5 ℃/min，總面積500.6 mJ，起始熔點(diǎn)213 ℃，峰頂溫度220 ℃，測得純度為99.9%。對羅紅霉素熔融吸熱峰進(jìn)行純度分析，升溫速度0.5 ℃/min，總面積218.1 mJ，起始熔點(diǎn)203 ℃，峰頂溫度210 ℃，測得純度為99.8%。

圖1 克拉霉素和羅紅霉素的DSC 圖

圖2 克拉霉素和羅紅霉素的DSC 圖

2.2 高效液相色譜分析結(jié)果 HPLC 分析結(jié)果顯示，克拉霉素及羅紅霉素的純度均為100.0% (圖3、圖4)。

圖3 克拉霉素的HPLC圖

圖4 羅紅霉素的HPLC圖

2.3 熱重/差示掃描量熱同步分析結(jié)果 由二氫脫氧青蒿素的TGA/DSC 熱分析曲線可以發(fā)現(xiàn)，樣品在溫度為140 ℃左右因分解放熱而導(dǎo)致顯著失重，且在出現(xiàn)降解前無明顯的熔融過程，因此，二氫脫氧青蒿素樣品無法進(jìn)行DSC純度分析(圖5)。由巰嘌呤的TGA/DSC熱分析曲線可以發(fā)現(xiàn)，樣品起始熔點(diǎn)253.0 ℃，達(dá)峰溫度258.5 ℃，樣品于256 ℃因熱降解出現(xiàn)顯著失重，以及于259 ℃發(fā)生熔融同時分解放熱，因此，巰嘌呤樣品熱穩(wěn)定性較差，也不適合再進(jìn)行DSC純度分析(圖6)。

圖5 二氫脫氧青蒿素的TGA/DSC圖

圖6 巰嘌呤的TGA/DSC圖

3 討論

在通常情況下對化學(xué)藥品對照品進(jìn)行定值定量應(yīng)采用質(zhì)量平衡法，即測得的主成分含量加上無機(jī)、有機(jī)雜質(zhì)、水分及殘留溶劑之和應(yīng)為100%[14]。在純度分析中，對有機(jī)雜質(zhì)的含量進(jìn)行分析通常采用色譜法，但如果有未知雜質(zhì)存在于樣品中時，由于不同物質(zhì)響應(yīng)值存在著一定差別，或因分離效果有限，那么有機(jī)雜質(zhì)的含量將很可能無法被準(zhǔn)確測定，導(dǎo)致所測得的結(jié)果可能與真值相比偏倚較大。研究表明，對于高純物質(zhì)的分析，尤其是化學(xué)藥品對照品的純度分析，DSC 法尤其適用，其檢測結(jié)果與其他方法(例如色譜法)測得的結(jié)果基本一致，其結(jié)果可能優(yōu)于其他方法[15-17]。

有機(jī)雜質(zhì)，在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中又被稱為有關(guān)物質(zhì)，是化學(xué)藥品對照品中的主要雜質(zhì)。有機(jī)雜質(zhì)主要為化學(xué)藥品對照品合成過程中所摻入的原料藥、副產(chǎn)物和降解產(chǎn)物等，這些相關(guān)物質(zhì)通常與主成分具有相似的理化性質(zhì)，給純度分析工作帶來了一定困難[18]。當(dāng)DSC適用時，能給化學(xué)藥品對照品的純度分析提供一種簡便的方法，而且能夠給其他分析手段提供一個有益的補(bǔ)充。當(dāng)面對品量稀少、價格昂貴的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的品種時，DSC 法相比于其他純度分析方法更具有獨(dú)特的優(yōu)勢。因?yàn)殡s質(zhì)會影響物質(zhì)的熔融行為，多數(shù)有機(jī)物都為低共熔體系，在此體系中低共熔雜質(zhì)越多，熔程越寬，熔點(diǎn)越低。一般來說，純度越高，DSC曲線峰形越敏銳。采用DSC 技術(shù)進(jìn)行純度分析就是利用物質(zhì)的DSC 熔融曲線計(jì)算該物質(zhì)的雜質(zhì)含量。物質(zhì)純度與DSC 峰形存在一定的相關(guān)性，峰形在一定程度上能反映純度，純度能決定峰形，任何能夠影響峰形的因素都將會影響物質(zhì)的純度測定結(jié)果[19]。隨著對化學(xué)藥品對照品DSC 純度分析研究的不斷深入，化學(xué)藥品對照品的量值結(jié)果分析將會更加精確。

熱重/差示掃描量熱同步分析發(fā)現(xiàn)部分化學(xué)藥品對照品熱穩(wěn)定性較差，存在熱分解前無明顯熔融過程或熔融分解等(如圖4和圖5)，因此，此類化學(xué)藥品對照品不適合進(jìn)行DSC 純度分析。此外，在克服干擾因子(水分、多晶型等)前，在進(jìn)行純度分析時也不宜采用DSC。但采用DSC進(jìn)行純度分析具有操作簡單、所需試樣量少、快速、無需溶劑以及適合高純物分析等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于化學(xué)藥品對照品的純度分析[20]。

在本研究中，克拉霉素及羅紅霉素的DSC純度分析結(jié)果與HPLC純度分析沒有明顯差異，基于熱力學(xué)原理的DSC 與HPLC 色譜的紫外純度分析結(jié)果基本一致，DSC 純度分析為該大環(huán)內(nèi)酯類抗生素量值和質(zhì)量分析研究提供了可靠的技術(shù)支持，可見屬于熱分析技術(shù)的DSC 純度分析在抗生素對照品研究中有著廣闊的應(yīng)用前景。