聯(lián)合有氧-抗阻運動對2型糖尿病小鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞血管生成功能的影響及其可能機制▲

黃燕鳳 翟 露 劉玉花 馬 翠 戴 霞

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院護理部，南寧市 530021，電子郵箱：1319376554@qq.com)

糖尿病是以血糖升高為特征的代謝性疾病，其可引起血管內(nèi)皮損傷和功能異常，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致冠心病、缺血性腦卒中及下肢動脈閉塞等的發(fā)生，并發(fā)癥的發(fā)生是糖尿病患者致死致殘的主要原因[1-2]。而這種血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生與內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)密切相關(guān)[3]。EPCs是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，在生理或病理因素刺激下，EPCs可從骨髓向靶部位動員、歸巢及分化，參與血管新生及損傷血管的再內(nèi)皮化[4]。然而，糖尿病發(fā)生時機體EPCs數(shù)量減少、功能受損，不能有效地發(fā)揮內(nèi)皮修復(fù)作用[5-6]。因此，探尋改善糖尿病狀態(tài)下EPCs血管生成功能的方法及其相關(guān)機制，對治療糖尿病血管病變有重要意義。

有研究表明，有氧運動能提高中老年大鼠的EPCs增殖功能，促進損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)[7]。但目前關(guān)于運動影響糖尿病患者或者動物模型EPCs功能作用的研究較少，尚未發(fā)現(xiàn)有研究報告聯(lián)合抗阻-有氧運動(簡稱聯(lián)合運動)對2型糖尿病患者EPCs功能的影響，其相關(guān)機制尚不十分明確。有學(xué)者報告，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號通路參與血管修復(fù)和生成過程，激活PI3K/AKT信號通路可以改善糖尿病小鼠EPCs血管生成能力[8]。聯(lián)合運動是否能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT的表達水平，進而改善EPCs的血管生成功能有待進一步研究。本研究對2型糖尿病小鼠實施為期8周的聯(lián)合運動干預(yù)，體外分離培養(yǎng)骨髓源EPCs，探討聯(lián)合運動對EPCs血管再生功能的影響及其相關(guān)機制，為運動治療糖尿病、防治糖尿病血管并發(fā)癥提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物及分組 選擇20只2型糖尿病db/db小鼠[品系名稱：BKS-DB/Nju；購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，許可證號：SYXK(蘇)2016-0012]，8周齡，均為雄性，平均血糖為28 mmol/L，平均體重為42 g。按照隨機數(shù)字表法，將小鼠分為聯(lián)合運動組和空白組，每組10只。

1.2 運動訓(xùn)練 空白組小鼠不進行任何運動干預(yù)。聯(lián)合運動組采取有氧運動與抗阻運動相交替的訓(xùn)練方式，每周運動6 d，即周一、三、五進行抗阻運動，周二、四、六進行有氧運動，共8周。其中，抗阻運動為在小鼠的尾部纏繞一定重量的水球促其進行爬梯訓(xùn)練，具體干預(yù)方案見表1；有氧運動為小鼠在坡度均為0度的8跑道小鼠跑臺(北京東西儀器科技有限公司，型號：WDW-1)上跑步，第1周時有氧運動速度為10 m/min，30 min/d，逐漸增加至15 m/min，30 min/d，第2～8周速度為15 m/min，60 min/d。

表1 抗阻運動方案

注：BW為自身體重。

1.3 主要試劑及儀器 淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號：LTS1092)，EGM-2MV培養(yǎng)基(Lonza公司，批號：CC-3162)，纖維粘連蛋白(RD公司，批號：1918-FN-02M)，T25細胞培養(yǎng)瓶(Corning公司，批號：430168)，DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-labelled acetylated low density lipoprotein,DiI-ac-LDL；Molecular Probes公司，批號：L3484)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的荊豆凝集素Ⅰ(fluorescein isothiocyanate-labelled ulex europaeus agglutinin Ⅰ,FITC-UEA-Ⅰ；Sigma公司，批號：L9006)，PI3K/AKT通路特異性抑制劑LY294002(MedChemExpress公司，批號：B524631337769)，BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)(Corning公司，批號：354230)，μ-Slide Angiogenesis板(ibidi公司，批號：81506)，cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，批號：K1622)，實時熒光定量PCR試劑盒(QIAGEN公司，批號：208054)，放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(碧云天公司，批號：P0013B)，苯甲基磺酰氟溶液(索萊寶公司，批號：P8340)，蛋白磷酸酶抑制劑(索萊寶公司，批號：P1260)。一抗：抗β-肌動蛋白單克隆抗體(索萊寶公司，批號：K200058M)、AKT抗體(CST公司，批號：9272s)、PI3Kp85(19H8)兔單克隆抗體(CST公司，批號：4257s)；二抗：兔抗小鼠IgG(碧云天公司，批號：P0023D)。激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司，型號：OLYMPUS CKX53)。

1.4 EPCs體外分離培養(yǎng)及鑒定 運動干預(yù)第8周結(jié)束后處死小鼠進行取材。無菌分離小鼠肱骨、股骨及脛骨并離斷，以含雙抗的無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline,PBS)充分沖洗骨髓腔，沖洗時間至少5 min，將收集的骨髓腔沖洗液輕柔吹打均勻后，按1 ∶1體積比緩慢滴加于淋巴細胞分離液上，4℃下2 000 r/min離心20 min后用巴氏吸管吸取出中間白色云霧狀細胞層，加入PBS清洗細胞以去除殘留的淋巴細胞分離液，4℃下2 000 r/min離心5 min獲取細胞沉淀，加入EGM-2MV培養(yǎng)基重懸細胞。將細胞培養(yǎng)物接種于包被了纖維粘連蛋白的T25細胞培養(yǎng)瓶中，放置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃恒溫培養(yǎng)。每天觀察細胞生長情況，每3天換液1次，去除非貼壁細胞。待細胞匯合度達到80%，進行細胞傳代培養(yǎng)并進行EPCs的鑒定。取EPCs以2.5×105個/孔的密度平鋪于24孔培養(yǎng)板，加入1 mL DiI-ac-LDL，使Dil-ac-LDL最終濃度為10 μg/mL，5% CO2、95%飽和濕度培養(yǎng)箱孵育4～6 h，1×PBS緩沖液沖洗3次；再取1 mL FITC-UEA-Ⅰ加入24孔板中，使FITC-UEA-Ⅰ最終濃度10 μg/mL，5% CO2、95%飽和濕度培養(yǎng)箱孵育1～2 h后，1×PBS緩沖液沖洗3次。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，Dil-ac-LDL、FITC-UEA-Ⅰ雙染色陽性的細胞被認為是正在分化的EPCs。隨機選取10個視野，進行細胞計數(shù)并計算EPCs雙陽性率。

1.5 PI3K/AKT特異性抑制劑處理細胞 將聯(lián)合運動組細胞分為聯(lián)合運動組和聯(lián)合運動+抑制劑組，對照組細胞分為對照組和對照+抑制劑組。將EPCs接種于12孔板，加入1 μL、濃度為0.7 μmol/L的LY294002至各抑制劑組，于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，聯(lián)合運動組與對照組不給予任何處理。

1.6 EPCs體外血管生成功能實驗 用BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)包被μ-Slide Angiogenesis板，鋪板完成后，將其置于4℃冰箱平衡30 min后于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h使BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)凝固。取1.5干預(yù)后的EPCs，加入0.5 mL的0.25%胰蛋白酶消化細胞，使其脫壁后常溫下以1 000 r/min離心3 min，棄上清，以完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞密度調(diào)整至5×104個/mL，分別取100 μL加入BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)包被的μ-Slide Angiogenesis板中，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板，并進行拍照。采用Image J圖像分析軟件對形成的完整管腔進行計數(shù)(每3個分叉處記為1個血管腔)。以體外新生血管的主干長度和節(jié)點作為評價體外血管生成功能的標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 實時熒光定量PCR檢測PI3K、AKT mRNA的表達 用TRIzol法提取各組細胞的總RNA并檢測RNA純度,按cDNA合成試劑盒操作說明步驟進行擴增,設(shè)置反應(yīng)條件：42℃ 60 min，70℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄后，取適量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按實時熒光定量PCR試劑盒操作說明進行擴增,反應(yīng)體系共10 μL，包括2×綠色熒光實時聚合酶鏈反應(yīng)混合液5 μL、熒光染料0.05 μL、終濃度為0.5 μmmol/L的上下游引物各0.5 μL、cDNA 1 μL，加無RNA酶水至10 μL；設(shè)置擴增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min后，95℃ 5 s，60℃ 30 s擴增40個循環(huán)。各樣品均重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法計算相對表達水平，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參，各基因引物見表2。

表2 基因引物序列

1.8 Western blot檢測AKT、p-AKT蛋白的表達 取各組細胞置于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加入RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟溶液、蛋白磷酸酶抑制劑混合液以裂解EPCs，使用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，將蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。將聚偏二氟乙烯膜置于含有5%脫脂奶粉的玻璃皿上封閉1 h后，1×洗滌緩沖液(tris buffered saline/tween，TBST)溶液洗滌3次，加入一抗室溫搖床孵育2 h，1×TBST溶液洗滌3次(20 min/次)后加入二抗進行室溫搖床孵育1 h，最后用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)掃描，選擇800通道，調(diào)節(jié)明亮度，記錄各組蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs形態(tài) 骨髓分離后獲得的EPCs在纖維粘連蛋白包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，4 d后EPCs大多呈圓形、短梭形，部分為長梭形；7 d后圓形細胞數(shù)量減少，梭形細胞數(shù)量漸漸增多，可出現(xiàn)細胞集落；10 d后EPCs大量增殖，并有梭形貼壁細胞在細胞集落邊緣不斷生成，可出現(xiàn)“鋪路石”樣改變。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下EPCs的形態(tài)(×100)

注：A為體外培養(yǎng)第48 h后，部分細胞開始貼壁，少量細胞呈梭形；B為7 d后，EPCs處于貼壁狀態(tài)，多呈梭形或者類圓形；C為12 d后，梭形細胞增多，逐漸長滿培養(yǎng)瓶底部，可見有“鋪路石”狀改變。

2.2 EPCs的鑒定結(jié)果 在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到，胞漿攝取DiI-ac-LDL，顯示紅色，胞膜結(jié)合FITC-UEA-Ⅰ，顯示綠色，雙染色陽性細胞為黃色，為正在分化的EPCs。DiI-ac-LDL及FITC-UEA-Ⅰ雙染陽性率為(73.50±7.47)%。見圖2。

圖2 DiI-ac-LDL及FITC-UEA-Ⅰ雙染試驗結(jié)果(×200)

注： DiI-ac-LDL染色陽性細胞發(fā)紅色熒光(D)，F(xiàn)ITC-UEA-Ⅰ染色陽性細胞發(fā)綠色熒光(E)，兩者雙染陽性細胞呈黃色熒光(F)。

2.3 各組EPCs的體外血管生成功能 對照組與對照+抑制劑組EPCs的主干長度和節(jié)點比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而聯(lián)合運動組EPCs的主干長度和節(jié)點均長于或多于對照組及聯(lián)合運動+抑制劑組(均P<0.05)，見圖3和表3。

圖3 各組EPCs體外血管生成功能情況(×100)

注：H為對照組，I為對照+抑制劑組，J為聯(lián)合運動組，K為聯(lián)合運動+抑制劑組。

表3 各組EPCs的血管生成主干長度和節(jié)點比較(x±s)

注：與聯(lián)合運動組比較，#P<0.05。

2.4 各組EPCs的PI3K、AKT mRNA表達情況 與對照組比較，對照+抑制劑組的PI3K、AKT mRNA相對表達水平均降低，而聯(lián)合運動組的PI3K、AKT mRNA相對表達水平均升高(均P<0.05)；聯(lián)合運動+抑制劑組的PI3K、AKT mRNA相對表達水平均低于聯(lián)合運動組(均P<0.05)。見表4。

表4 各組細胞AKT和PI3K的mRNA相對表達水平比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與聯(lián)合運動組比較，#P<0.05。

2.5 各組EPCs的AKT、p-AKT蛋白表達情況 與對照組比較，對照+抑制劑組AKT蛋白的相對表達水平降低，聯(lián)合運動組的AKT、p-AKT蛋白的相對表達水平均升高(均P<0.05)；聯(lián)合運動+抑制劑組AKT、p-AKT蛋白的相對表達水平均低于聯(lián)合運動組(均P<0.05)。見表5。

表5 各組EPCs的AKT和p-AKT蛋白相對表達水平比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與聯(lián)合運動組比較，#P<0.05。

3 討 論

研究表明，當(dāng)血管內(nèi)皮受損時，EPCs可以從骨髓動員，并遷移、整合到血管網(wǎng)絡(luò)，通過分化為成熟的內(nèi)皮細胞從而修復(fù)損傷血管和生成新的血管[4]。而2型糖尿病會導(dǎo)致EPCs血管生成功能減弱，影響損傷內(nèi)皮的修復(fù)[9]。有文獻報告，聯(lián)合運動較單純有氧或抗阻運動能更有效地改善糖尿病前期人群的糖代謝[10]。然而，目前聯(lián)合抗阻-有氧運動對2型糖尿病患者EPCs血管生成功能的作用尚未十分明確，相關(guān)機制也尚未清楚。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合運動組EPCs的主干長度和節(jié)點均長于或多于對照組(P<0.05)，即聯(lián)合運動組呈現(xiàn)更強的血管修復(fù)能力，提示聯(lián)合運動訓(xùn)練可增強骨髓EPCs的體外血管生成功能。

為了明確聯(lián)合運動改善EPCs功能活性的可能相關(guān)機制，本研究對EPCs上參與血管修復(fù)和生成的PI3K/AKT通路進一步探究。PI3K的活化很大程度上依賴于靠近其質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的底物，即多數(shù)生長因子和信號傳導(dǎo)復(fù)合物，包括成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、人生長因子等，都能啟始PI3K的激活過程[11]。AKT是一類蛋白激酶家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶，當(dāng)組織損傷后，受損部位能夠釋放某些細胞因子如血管內(nèi)皮生長因子，從而激活PI3K/AKT信號通路[12]。有研究表明，PI3K/AKT的激活與EPCs的體外血管生成功能密切有關(guān)，參與血管損傷修復(fù)過程[8]。Dai等[13]發(fā)現(xiàn)阻斷PI3K/AKT的磷酸化激活，可抑制下肢缺血模型糖尿病小鼠的EPCs體外血管生成能力，減少新生血管長度。而其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)，為期14天的游泳干預(yù)可促進小鼠EPCs從骨髓動員到外周血，增加了外周血EPCs的數(shù)量，新生血管密度升高，并上調(diào)PI3K和AKT的表達水平；而使用PI3K/AKT通路抑制劑，可抑制小鼠的EPCs動員和血管生成功能[14]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，聯(lián)合運動組AKT、p-AKT蛋白相對表達水平上調(diào)(P<0.05)，EPCs血管生成主干長度和節(jié)點較對照組增加，這表明聯(lián)合運動可通過上調(diào)AKT，改善2型糖尿病小鼠EPCs血管生成功能。本研究進一步使用PI3K/AKT抑制劑進行干預(yù)觀察，結(jié)果顯示，與對照組比較，對照+抑制劑組的PI3K、AKT的 mRNA下調(diào)(P<0.05)，AKT、p-AKT蛋白相對表達量下降(P<0.05)，而兩者EPCs的主干長度和節(jié)點差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，即PI3K/AKT抑制劑可有效抑制2型糖尿病小鼠EPCs AKT蛋白的表達，但對其血管生成功能無明顯影響。與未加入PI3K/AKT抑制劑的聯(lián)合運動組相比，聯(lián)合運動+抑制劑組PI3K、AKT的 mRNA下調(diào)(P<0.05)，AKT、p-AKT蛋白相對表達量下降(P<0.05)，同時EPCs主干長度和節(jié)點減少(P<0.05)，即抑制AKT的表達水平，可削弱聯(lián)合運動對2型糖尿病小鼠EPCs體外血管生成能力的干預(yù)效果。

總之，8周的聯(lián)合運動能有效改善2型糖尿病小鼠EPCs的血管生成能力，其機制可能與上調(diào)AKT密切相關(guān)，抑制AKT的表達可削弱其干預(yù)效果。本研究為運動防治糖尿病血管并發(fā)癥提供新的基礎(chǔ)研究依據(jù)和干預(yù)靶點，有關(guān)聯(lián)合運動調(diào)節(jié)EPCs改善血管內(nèi)皮損傷的具體機制還有待進一步研究。