文蛤過氧化氫酶的生物信息學分析

張志東，張 雨，陳愛華*，吳楊平*，曹 奕，陳素華，田 鎮(zhèn)，2，李秋潔，2

(1. 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2. 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

文蛤(Meretrixmeretrix)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibrabchia)、簾蛤目(Veneroida)、簾蛤科(Veneridae)、文蛤?qū)?Meretrix)，是我國重要的經(jīng)濟貝類之一[1]。近年來，隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，文蛤養(yǎng)殖面臨著污染、疾病等問題的困擾，因此選育抗逆性強的文蛤良種是目前行之有效的手段之一。過氧化氫酶(CAT)在文蛤抗逆性方面具有重要的指示作用。機體在逆境中，會大量產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)，其具有強烈的氧化作用，對細胞產(chǎn)生毒害[2]。過氧化氫酶(Catalase, CAT)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的活性酶，可與生物體內(nèi)的過氧化氫特異性結(jié)合，使之分解為水和氧氣，維持機體氧化還原平衡，使機體免受氧化應激(Oxidative Stress，OS)的損傷[3]。十九世紀初，Thenard首次發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶。到了20世紀，Oscar Loew將該酶正式命名為“Catalase”，即過氧化氫酶，又稱觸酶[4]。以前主要研究過氧化氫酶活性及作為生物抗逆性的標志物[5-7]。近年來，許多水生生物過氧化氫酶基因陸續(xù)被克隆出來[8-11]，Wang等[12](2012)首次克隆出文蛤過氧化氫酶基因(MmeCAT)，進一步推動了過氧化氫酶在分子生物學領域的研究。目前關于文蛤過氧化氫酶蛋白結(jié)構的研究尚未有報道，本研究在已公布的MmeCAT序列的基礎上，利用生物信息學方法對其表達產(chǎn)物理化性質(zhì)、親水性、跨膜結(jié)構域、磷酸化位點、糖基化位點、信號肽、亞細胞定位、功能結(jié)構域、二級結(jié)構以及三級結(jié)構等進行預測，旨在為文蛤過氧化氫酶的結(jié)構與功能的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

文蛤MmeCAT基因來源于GenBank，其登錄號為JQ005875.1。對該基因完整編碼蛋白質(zhì)序列進行 BLAST 分析；與其同源性較高的有織錦巴非蛤(Paphiatextile)，登錄號為KF673103.1；河蜆(Corbiculafluminea)，登錄號為KX211962.1；硬殼蛤(Mercenariasp.)，登錄號為JN671460.1；合浦珠母貝(Pinctadafucata)，登錄號為HQ703465.1；厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)，其登錄號為KX957929.1等。以上物種CAT基因均由NCBI網(wǎng)站(https: / /www.ncbi.nlm.nih.gov /)GenBank數(shù)據(jù)庫下載。

1.2 實驗方法

首先用BioEdit7.0軟件將文蛤CAT基因完整編碼蛋白序列翻譯成氨基酸序列待用。然后將氨基酸序列輸入ExPASy ProtParam在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析該蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。理化性質(zhì)包括氨基酸組成、分子式、相對分子質(zhì)量、理論等電點、消光系數(shù)、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)等，并用Excel2007整理所得數(shù)據(jù)。通過ProtScale工具(https://web.expasy.org/protscale/)預測該蛋白質(zhì)疏水性、親水性。通過TMHMM Server v 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測跨膜結(jié)構區(qū)域。通過NetPhos 3.1 Server在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對該蛋白質(zhì)的磷酸化位點進行預測。利用NetOGlyc 4.0 Server在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)對該蛋白質(zhì)進行糖基化位點預測。通過SignalP 5.0 Server軟件判斷該蛋白質(zhì)信號肽存在與否。通過PSORT Ⅱ Prediction在線軟件(https://psort.hgc.jp/form2.html)對該蛋白質(zhì)進行亞細胞定位。使用BlastP對該蛋白質(zhì)保守結(jié)構域進行分析。使用SOPMA在線工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr)分析該蛋白質(zhì)二級結(jié)構，并用SWISS-MODEL在線工具(https://www.swissmodel.expasy.org/)預測該蛋白質(zhì)三級結(jié)構。運用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設置為高置信度0.7，不限制數(shù)量，構建與CAT相互作用的蛋白網(wǎng)絡。

2 結(jié)果與分析

2.1 文蛤過氧化氫酶理化性質(zhì)分析

通過ExPASy ProtParam在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)獲得文蛤過氧化氫酶的理化性質(zhì)。文蛤過氧化氫酶由511個氨基酸組成，其中甘氨酸(Gly)有42個，含量最多占8.2%；色氨酸(Trp)和半胱氨酸(Cys)均有6個，含量最少占1.2%(見圖1)。相對分子質(zhì)量為58 181.29 Da；理論等電點為8.05；帶負電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為63個，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys) 為65個；其分子式為C2588H3928O767N730S20；假設所有半胱氨酸全部形成胱氨酸，其消光系數(shù)為63 175 mol /L， 相應的吸光度為 1.086； 假設所有的半胱氨酸均未形成胱氨酸時，消光系數(shù)為 62 800 mol /L，相應的吸光度為 1.079；其半衰期為30 h，脂肪族氨基酸指數(shù)為57.28，不穩(wěn)定系數(shù)為27.77(<40)，可知文蛤過氧化氫酶為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

圖1 文蛤過氧化氫酶氨基酸組成Fig.1 Amino acid composition of catalase in M.meretrix

2.2 文蛤過氧化氫酶疏水性與親水性分析

通過ProtScale工具得到文蛤過氧化氫酶疏水性與親水性見圖2。圖2中的負值表示親水性，該值越小說明該蛋白質(zhì)親水性越強；正值為疏水性，正值越大說明該蛋白質(zhì)疏水性越強。文蛤過氧化氫酶第311位的精氨酸(Arg)分值最高為1.767 ；第 500位的纈氨酸(Val) 和 491 位的丙氨酸(Ala)分值最低，為-3.200 。親水性總平均值為-0.732，表明過氧化氫酶為親水性蛋白。

圖2 文蛤過氧化氫酶親水性與疏水性Fig.2 Hydrophilic and hydrophobic properties of catalase in M.meretrix

2.3 文蛤過氧化氫酶糖基化與磷酸化位點預測

通過NetOGlyc 4.0 Server與NetPhos 3.1 Server在線工具對該蛋白質(zhì)進行糖基化和磷酸化位點預測。結(jié)果顯示文蛤過氧化氫酶糖基化位點有51個，磷酸化位點有71個。其中位于絲氨酸(Ser)殘基上的有23個，位于蘇氨酸(Thr)殘基上的有28個，位于酪氨酸(Tyr)殘基上的有20個(見圖3)。

2.4 文蛤過氧化氫酶跨膜區(qū)域與信號肽預測

運用TMHMM Server v 2.0軟件預測文蛤過氧化氫酶跨膜區(qū)域，結(jié)果顯示，該酶為膜外蛋白。通過SignalP 5.0 Server軟件判斷文蛤過氧化氫酶不存在信號肽。

2.5 文蛤過氧化氫酶亞細胞定位和保守結(jié)構域分析

通過PSORT Ⅱ Prediction在線軟件對文蛤過氧化氫酶進行亞細胞定位。結(jié)果表明：文蛤過氧化氫酶有69.6%可能存在于過氧化氫酶體中，有21.7%存在于細胞核中，存在于線粒體和細胞骨架的可能性均為4.3%，說明文蛤過氧化氫極可能存在于過氧化物酶體中。用Blastp在線工具比對文蛤過氧化氫酶蛋白質(zhì)序列，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)擁有血紅素結(jié)合的保守結(jié)構域(Heme binding pocket)、NADPH結(jié)合位點(NADPH binding site)以及四聚體界面(Tetramer interface)三個結(jié)構功能域，屬于典型單功能過氧化氫酶的第三分支(見圖4)，可能屬于catalase like超家族中clade 3 分支的成員。

圖3 文蛤過氧化氫酶磷酸化位點預測Fig.3 Prediction of catalase phosphorylation sites in M.meretrix

圖4 文蛤過氧化氫酶保守結(jié)構域分析Fig.4 Conservative structure domain analysis of catalase in M.meretrix

2.6 文蛤過氧化氫酶二級結(jié)構和三級結(jié)構預測

使用SOPMA在線工具預測文蛤過氧化氫酶二級結(jié)構，結(jié)果表明無規(guī)卷曲(Random coil)和α-螺旋(Alpha helix)是其主要構成元件。其中無規(guī)卷曲由266個氨基酸構成，占總氨基酸的52.05%；α-螺旋由145個氨基酸構成，占總氨基酸的28.38%；78個氨基酸形成延伸鏈(Extended strand)，占比為15.25%；β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)由22個氨基酸構成，占比最小(4.31%)。通過SWISS-MODEL在線工具預測得出文蛤過氧化氫酶三級結(jié)構(見圖5)，可見其扭曲和折疊較多，結(jié)構豐富，這對其生物學功能的發(fā)揮具有重要作用。

圖5 文蛤過氧化氫酶三級結(jié)構Fig.5 Three-dimensional model of catalase in M.meretrix

2.7 文蛤過氧化氫酶蛋白質(zhì)相互作用分析

運用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設置為高置信度0.7，不限制數(shù)量，構建與CAT相互作用的蛋白網(wǎng)絡(見圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與CAT相互作用的蛋白質(zhì)主要包括SOD1(Superoxide Dismutase 1 )、SOD2(Superoxide Dismutase 2 )、SOD3(Superoxide Dismutase 3 )、GSR(Glutathione Reductase)、AKT1(Protein Kinase B)、SCP2(Single Cell Protein 2)、HSD17B4(17β-Hydroxysteroid dehydrogenase Ⅳ)、ACOX1(Acyl Coenzyme A Oxidase 1)、HAO1(Hydroxyacid Oxidase 1)、DAO(Diamine Oxidase)。

圖6 CAT蛋白相互作用網(wǎng)絡Fig.6 Protein-protein interaction network for CAT

對以上互作蛋白的基因進行GO分析，結(jié)果表明：有4個互作基因表達產(chǎn)物具有超氧化物歧化酶活性，有6個基因參與表達氧化還原酶，有3個基因參與過氧化物代謝過程，3個基因參與去除超氧自由基，3個基因表達產(chǎn)物作為蛋白質(zhì)復合體，還有3個基因表達產(chǎn)物可能是磷蛋白質(zhì)，還有3個基因表達產(chǎn)物可能存在于細胞質(zhì)中(見圖7)。KEGG分析表明：互作基因在過氧化物酶體的形成過程顯著富集，當文蛤受氧化應激時，ACOX、SCPX、CAT等基因有上調(diào)趨勢，PRDX1基因則有下調(diào)趨勢(見圖8)。

圖7 GO注釋結(jié)果Fig.7 Results of GO annotation

3 討論與結(jié)論

利用生物信息學的方法，對文蛤過氧化氫酶蛋白結(jié)構進行分析，結(jié)果顯示文蛤過氧化氫酶由511個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為58 181.29 Da，為親水蛋白，與櫛孔扇貝(ChlamysFarreri)[13]、褶紋冠蚌(Cristariaplicata)[14]、盤鮑(Haliotisdiscusdiscus)[15]、仿刺參(Apostichopusjaponicus)[16]等過氧化氫酶的研究結(jié)果非常相似，這些酶的編碼蛋白序列都在 500～520 個氨基酸之間，說明了該酶在物種進化上具有高度的保守性。文蛤過氧化氫酶的主要二級結(jié)構是無規(guī)卷曲，屬于catalase like超家族。 根據(jù)GO分析、KEGG通路分析結(jié)果，結(jié)合亞細胞定位情況和結(jié)構分析結(jié)果，推測文蛤過氧化氫酶在文蛤細胞內(nèi)主要參與過氧化物酶體的合成及抗氧化作用。根據(jù)文蛤過氧化氫酶互作蛋白的基因GO分析和KEGG通路分析結(jié)果可知，互作基因表達產(chǎn)物具有超氧化物歧化酶活性、參與去除超氧自由基、參與過氧化物代謝過程等生物過程。當文蛤受氧化應激時，CAT等基因顯著上調(diào)(見圖8)，與蘇恩萍[17]等文蛤過氧化氫酶活力研究結(jié)果一致，該結(jié)果說明文蛤過氧化氫酶的活力不僅受外界環(huán)境的影響，同時也受基因的調(diào)控。有研究表明SOD和CAT是機體防御過氧化損害系統(tǒng)中的兩個關鍵酶，其能有效地消除活性氧，防止細胞膜系統(tǒng)過氧化作用的發(fā)生[3]。因此，CAT基因與互作蛋白中的SOD基因之間的調(diào)控關系值得深入研究。

圖8 互作基因信號通路Fig.8 Interacting gene signaling pathways

對文蛤過氧化氫酶理化性質(zhì)、親水性、磷酸化位點、糖基化位點、跨膜結(jié)構域、信號肽、亞細胞定位、二級結(jié)構、三級結(jié)構以及功能域等生物學信息進行了整理，為研究文蛤MmeCAT基因及其編碼產(chǎn)物的功能提供了更多的信息。文蛤過氧化氫酶屬穩(wěn)定性蛋白，在生物進化上具有高度的保守性，其基因可以穩(wěn)定遺傳，且具有使機體免受氧化應激的生物學功能[18]。因此，在今后文蛤抗逆性品種選育上，可將文蛤過氧化氫酶含量作為目標性狀之一。研究文蛤過氧化氫酶結(jié)構，有助于進一步研究文蛤的生物應激作用，同時為文蛤抗逆性品種選育提供理論基礎。