牛NAD(+)異檸檬酸脫氫酶生物信息學(xué)分析

張志國，王 東

(葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室(喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院)，新疆 喀什 844000)

異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenases, IDH)在細(xì)胞內(nèi)主要催化D-異檸檬酸(D-isocitrate)氧化脫羧成α-酮戊二酸(α-oxoglutarate)和CO2的反應(yīng)。該酶是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，對其活性的調(diào)節(jié)將直接影響該酶生物學(xué)功能的發(fā)揮[1]。該酶具有NAD(+)與NADP(+)兩種輔助因子，根據(jù)輔助因子的不同，IDH可分為NAD(+)依賴型的IDH(NAD-IDH,EC∶1.1.1.41)和NADP(+)依賴型的IDH(NADP-IDH,EC∶1.1.1.42)[1]。IDHs廣泛分布于原核生物以及真核生物中[2-6]。在哺乳動物組織中存在3種IDHs同工酶，分別為胞質(zhì)NADP(+)依賴型IDH(IDH1)、線粒體NADP(+)依賴型IDH(IDH2)以及線粒體NAD(+)依賴型IDH(IDH3)，其中IDH3被認(rèn)為在三羧酸循環(huán)異檸檬酸脫羧反應(yīng)中起主要作用，IDH3活性受許多變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)[3]。

目前的研究表明，在各類腫瘤患者中IDH的突變率較高。IDH1與IDH2的突變會抑制宿主免疫應(yīng)答并且誘導(dǎo)α-酮戊二酸(α-KG)轉(zhuǎn)化為D型2-羥基戊二酸(D2HG)，造成D2HG大量積累進(jìn)而誘發(fā)膠質(zhì)瘤的發(fā)生[4]。IDH3β作為E3泛素連接酶后期促進(jìn)復(fù)合體(APC/C)的新型底物對癌細(xì)胞的大量增值具有較為重要的作用[7]。IDH3α在缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)介導(dǎo)的癌細(xì)胞代謝以及血管生成中發(fā)揮作用[24]。該研究還表明，IDH3α的異常表達(dá)會促進(jìn)血管瘤的生長[24]。因此對IDH家族進(jìn)行深入研究將為癌癥等疾病的治療、分子病理分析和預(yù)后提供良好的視角[8, 30]。IDH是目前國際上公認(rèn)的研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、酶的催化與調(diào)節(jié)機(jī)制以及蛋白質(zhì)分子進(jìn)化機(jī)制的最好模型之一[9]。目前有關(guān)牛IDH的研究報道較少。文獻(xiàn)報道表明，牛心的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性異檸檬酸脫氫酶(NAD-IDH)是由subunit-3/4(α)、subunit1(β)和subunit2(γ)三種亞基構(gòu)成的異四聚體, 其中各亞基占比分別為2∶1∶1[10]。后來的研究進(jìn)一步證實哺乳動物中1/β和2/γ亞基是調(diào)節(jié)性的，而包含一半四聚體的3, 4 /α亞基是催化性的[11-12]。在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究采用生物信息學(xué)方法分析了牛線粒體NAD-依賴型IDH的理化性質(zhì)、親疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測、表面電荷分布以及輔助因子結(jié)合位點，從而為進(jìn)一步研究IDH家族尤其是哺乳動物NAD(+)IDH提供了重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從Uniprot數(shù)據(jù)庫中查詢并獲得已注冊的牛NAD-IDH的三種亞基IDH3A_BOVIN(P41563)、IDH3B_BOVIN(O77784)以及IDH3G_BOVIN(Q58CP0)的蛋白序列。

1.2 方法

利用生物信息學(xué)分析工具(見表1)分析了牛NAD-IDH的理化性質(zhì)、親疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，表面電荷分布以及輔助因子結(jié)合位點。

表1 生物信息學(xué)分析工具Table 1 Bioinformatic analysis tools

2 結(jié)果與分析

2.1 牛NAD(+)IDH理化性質(zhì)分析

牛NAD(+)IDH三種亞基分析結(jié)果表明，該蛋白殘基總數(shù)為1 509個，原子總數(shù)為23 207個，分子總質(zhì)量為165 kDa，總分子式為C7259H11670N2048O2144S86。其中占比最高的殘基為Ala(9.7%)，占比最低的殘基為Trp(0.6%)。三種亞基中IDH3G_BOVIN和IDH3B_BOVIN兩個亞基呈堿性，IDH3A_BOVIN一個亞基呈酸性且正負(fù)電荷殘基僅相差一個，據(jù)此可以推斷牛NAD(+)IDH為堿性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定系數(shù)分析結(jié)果表明，三種亞基均不穩(wěn)定，據(jù)此推斷牛NAD(+)IDH蛋白為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。親水性分析結(jié)果表明，三種亞基均呈親水性，據(jù)此推斷牛NAD(+)IDH為親水性蛋白質(zhì)(見表2)。

表2 牛NAD(+)IDH理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physical and chemical properties of NAD(+)IDH in bovin

2.2 牛NAD(+)IDH親水性/疏水性分析

K-D預(yù)測算法分析的牛NAD(+)IDH親水性/疏水性結(jié)果表明，IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN三個亞基均為親水性，據(jù)此推斷牛NAD(+)IDH為親水性蛋白質(zhì)，這與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。同時分析結(jié)果表明，牛NAD(+)IDH各亞基均無明顯疏水區(qū)段，表明該蛋白很可能沒有跨膜區(qū)，為細(xì)胞游離蛋白(見圖1，表3)。

圖1 牛NAD(+)IDH的親水性/疏水性分析 (Kety and Doolittle 算法)Fig.1 Hydrophlicity/hydrophobicity analysis of NAD(+)IDH in bovin (Kety and Doolittle algorithm)

表3 牛NAD(+)IDH的親水性/疏水性分析Table 3 Hydrophlicity/hydrophobicity analysis of NAD(+)IDH in bovin

2.3 牛NAD(+)IDH跨膜區(qū)預(yù)測

運用隱馬爾可夫模型分別對三個亞基IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測分析。結(jié)果表明，該蛋白的三個亞基均無跨膜區(qū)，據(jù)此推斷牛NAD(+)IDH不是跨膜蛋白，在三羧酸循環(huán)中以游離狀態(tài)發(fā)揮作用，這與該蛋白親水性/疏水性分析結(jié)果一致(見圖2)。

圖2 牛NAD(+)IDH跨膜區(qū)預(yù)測 (隱馬爾可夫模型)Fig.2 Transmembrane structure prediction of NAD(+)IDH in bovin (Hidden Markov Models)

2.4 牛NAD(+)IDH信號肽預(yù)測

基于兩種算法(神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法和隱馬爾可夫模型)分別對牛NAD(+)IDH三個亞基IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN進(jìn)行信號肽預(yù)測分析。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法分析結(jié)果中C-score表示信號肽酶切位點值；S-score表示信號肽值；Y-score表示綜合得出的剪切位點分值。meanS-score作為判斷蛋白質(zhì)是否具有信號肽的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)meanS-score>0時可以認(rèn)為是分泌蛋白，具有信號肽，meanS-score<0時則認(rèn)為是非分泌蛋白，沒有信號肽。結(jié)合隱馬爾可夫模型的預(yù)測結(jié)果，可以推斷出IDH3A_BOVIN和IDH3G_BOVIN兩個亞基沒有信號肽，IDH3B_BOVIN亞基具有信號肽。根據(jù)文獻(xiàn)報道，信號肽一般長度為5-30個氨基酸[15]，因此排除本研究中隱馬爾可夫模型對IDH3B_BOVIN亞基的預(yù)測結(jié)果(見圖3，表4)。綜上所述，可以推斷牛NAD(+)IDH存在信號肽，并且該信號肽位于β亞基N端第1至第16位氨基酸，具體序列為MAALSRVRWLTRALVA。

圖3 牛NAD(+)IDH信號肽預(yù)測Fig.3 Signal peptide prediction of NAD(+)IDH in bovin

表4 牛NAD(+)IDH信號肽預(yù)測Table 4 Signal peptide prediction of NAD(+)IDH in bovin

2.5 牛NAD(+)IDH亞細(xì)胞定位預(yù)測

基于兩種工具的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN與IDH3G_BOVIN三個亞基均定位在線粒體中。與上述信號肽預(yù)測結(jié)果相吻合，據(jù)此推斷牛DNA(+)IDH定位在線粒體中(見表5)。

表5 牛NAD(+)IDH亞細(xì)胞定位預(yù)測Table 5 Prediction of subcellular localization of NAD(+)IDH in bovin

2.6 牛NAD(+)IDH二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測是聯(lián)系一級結(jié)構(gòu)與三級空間結(jié)構(gòu)的橋梁和紐帶[16-17]。本研究分別運用目前廣泛使用的Jpred和SOPMA兩種二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測工具對牛NAD(+)IDH的三個亞基IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

SOPMA預(yù)測結(jié)果表明，IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN三個亞基的α螺旋占比分別為49.18%、47.01%和49.23%，β折疊占比分別為10.16%、11.43%和10.71%。Jpred和SOPMA預(yù)測結(jié)果比對表明，兩種預(yù)測工具所預(yù)測的結(jié)果基本吻合，其中可靠性最強的α螺旋區(qū)在表6中以深色底紋顯示，可靠性最強的β折疊區(qū)以淺色底紋顯示(見表6，圖4)。

圖4 牛NAD(+)IDH二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 (SOPMA)Fig.4 Secondary structure prediction of NAD(+)IDH in bovin (SOPMA)

2.7 牛NAD(+)IDH三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與模型質(zhì)量評估

空間結(jié)構(gòu)預(yù)測對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究具有較為重要的作用[20]。

2.7.1 同源建模法預(yù)測三級結(jié)構(gòu)

采用SWISS-MODEL在線預(yù)測工具同源建模法分別預(yù)測了牛NAD(+)IDH三個亞基IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN的三級結(jié)構(gòu)。其中IDH3B_BOVIN亞基預(yù)測結(jié)果得到了以PDB ID 2d1c為模板的預(yù)測模型，相似度為34.03%，但該預(yù)測模型的預(yù)測結(jié)果表明IDH3B_BOVIN亞基為雙肽鏈蛋白質(zhì)(見圖5(b))，這一預(yù)測結(jié)果與文獻(xiàn)報道的經(jīng)實驗驗證的亞基大小不符合[10]，由此推斷同源建模法無法預(yù)測IDH3B_BOVIN亞基的三級結(jié)構(gòu)。相比較而言，亞基IDH3A_BOVIN與IDH3G_BOVIN分別得到了以PDB ID 5grh和PDB ID 5grf為模板的高質(zhì)量預(yù)測模型，相似度分別為97.34%和98.31%，全局模型質(zhì)量評估得分分別為0.90和0.86，均明顯高于其他預(yù)測模型。另外，QMEAN得分分別為-0.24和-0.55，比其他預(yù)測模型更接近0。進(jìn)一步分析了預(yù)測模型與同源蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的相似性散點分布圖。結(jié)果表明，IDH3A_BOVIN與IDH3G_BOVIN模型(見圖6(a)和(b)中以紅色五角星標(biāo)記)Z得分均<0，顯示該預(yù)測模型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是最佳的理想結(jié)構(gòu)(見圖6)。據(jù)此可以推斷以PDB ID 5grh為模板的預(yù)測結(jié)果可以作為IDH3A_BOVIIN亞基的最可能的三級結(jié)構(gòu)(見圖5(a))，以PDB ID 5grf為模板的預(yù)測結(jié)果可以作為IDH3G_BOVIIN亞基的最可能的三級結(jié)構(gòu)(見圖5(d))。

圖5 牛NAD(+)IDH的三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiairy structure of NAD(+)IDH predicted model

圖6 三級結(jié)構(gòu)相似性散點分布圖Fig.6 Similarity scattergram of the predicted model and the homologous protein

2.7.2 折疊識別法預(yù)測三級結(jié)構(gòu)

同源建模法預(yù)測結(jié)果表明，采用同源建模法無法精確預(yù)測IDH3B_BOVIN亞基的三級結(jié)構(gòu)，因此，本研究采用折疊識別法進(jìn)一步對IDH3B_BOVIN亞基的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測結(jié)果顯示有46個模型的準(zhǔn)確度達(dá)到了90%以上，其中一個模板的折疊子c5grhB_是人異檸檬酸脫氫酶α與γ異二聚體中的γ亞基，該折疊子與IDH3B_BOVIN亞基序列匹配性最好，準(zhǔn)確度達(dá)到了100%，相似性達(dá)到了54%，據(jù)此推斷以該折疊子X射線晶體衍射結(jié)構(gòu)折疊識別出來的三級結(jié)構(gòu)可以作為IDH3B_BOVIIN亞基最可能的三級結(jié)構(gòu)(見圖5(c))。

2.7.3 模型質(zhì)量評估

為了進(jìn)一步驗證預(yù)測模型的可靠性，將預(yù)測得到的模型PDB文件分別上傳至SAVES v5.0平臺上的Verify3D和PROCHECK進(jìn)行在線評估。拉曼圖中從白色到紅色，顏色越深的區(qū)域表明Cα的二面角越合理。拉曼圖分析結(jié)果表明IDH3A_BOVIN和IDH3G_BOVIN兩個亞基的預(yù)測模型中90%以上的殘基都位于紅色最佳允許區(qū)域，IDH3B_BOVIN亞基中87.9%的氨基酸殘基(269個)都位于紅色最佳允許區(qū)域，10.1%的氨基酸殘基(31個)位于正黃色額外允許區(qū)域(見圖7)。表明模型中所有的氨基酸殘基均形成了一種合理的二面角，構(gòu)成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。3D-1D得分結(jié)果表明，IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN三個亞基中3D-1D值大于0.2的殘基均占80%以上，且低質(zhì)量部分不明顯(見圖8)，這表明模型質(zhì)量合格。綜上所述，可以推斷出上述IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN與IDH3G_BOVIN三個亞基的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果穩(wěn)定可靠。

表6 牛NAD(+)IDH二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 (Jpred/SOPMA)Table 6 Secondary structure prediction of NAD(+)IDH in bovin (Jpred/SOPMA)

注：AA:氨基酸序列；H:α螺旋；E:β折疊；-:無規(guī)卷曲。

2.8 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測吻合度分析

將牛NAD(+)IDH三個亞基IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN與IDH3G_BOVIN三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型進(jìn)行DSSP二級結(jié)構(gòu)指認(rèn)，并將指認(rèn)結(jié)果與Jpred和SOPMA兩種二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測工具所預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行吻合度分析。結(jié)果表明，亞基IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN三級結(jié)構(gòu)模型中指認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)與Jpred和SOPMA所預(yù)測二級結(jié)構(gòu)吻合度分別為92%、88%與95%，這表明亞基IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN三級結(jié)構(gòu)模型中指認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)分布與Jpred和SOPMA所預(yù)測的三個亞基二級結(jié)構(gòu)結(jié)果是一致的，同時也進(jìn)一步表明Jpred和SOPMA所預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)信息是可信的。

圖7 拉曼圖Fig.7 Ramachandran plot of the predicted model

圖8 3D-1D得分散點圖Fig.8 3D-1D score scattergram of the model

2.9 牛NAD(+)IDH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面電荷分布及輔酶結(jié)合位點分析

研究表明，高等動物中NAD(+)IDH不能單獨發(fā)揮作用，需要各類輔助因子協(xié)同作用促進(jìn)酶與異檸檬酸的結(jié)合并形成α-酮戊二酸，亞基IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN具有ADP結(jié)合位點，兩者很可能與NAD(+)IDH蛋白活性調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，IDH3A_BOVIN亞基為催化亞基，擁有一部分異檸檬酸結(jié)合位點[9,12,23]。將獲得的IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN三個亞基三級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)利用VMD軟件進(jìn)行分析，通過該軟件中的APBS插件分別計算三個亞基的表面電荷分布。在分析的過程中，用藍(lán)色表示所分析蛋白質(zhì)帶正電荷的區(qū)域，紅色表示帶負(fù)電荷的區(qū)域，灰色表示不帶電荷的區(qū)域(見圖9)。分析結(jié)果表明，三個亞基三級結(jié)構(gòu)正面均帶有大量正電荷(見圖9(a)，(c)和(e))，在β折疊和α螺旋形成的凹槽處尤為明顯，圖中以箭頭所示，推斷該處結(jié)構(gòu)最有可能與異檸檬酸(帶負(fù)電)或ADP(帶負(fù)電)結(jié)合。與正面相比，三個亞基三級結(jié)構(gòu)背面電荷分布均不明顯，且正負(fù)電荷分布散亂，推斷這些區(qū)域不太可能與異檸檬酸或ADP結(jié)合(見圖9(b)，(d)和(f))。

圖9 牛NAD(+)IDH表面電荷分布圖Fig.9 Surface charge distribution of NAD(+)IDH in bovin

3 討 論

異檸檬酸脫氫酶(IDH)催化生物體內(nèi)的氧化脫羧反應(yīng)，具有重要的生理作用。該酶受到多種輔助因子的調(diào)節(jié)，在三羧酸循環(huán)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。自2009年首次在彌漫性膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)IDH突變以來，IDH突變在診斷、預(yù)后和膠質(zhì)瘤預(yù)測方面發(fā)揮越來越重要的作用[25]。2016年，世界衛(wèi)生組織(WHO)首次將分子參數(shù)用于腦腫瘤診斷，將IDHl與IDH2突變分子病理檢測作為膠質(zhì)瘤新的分型診斷標(biāo)準(zhǔn)[27]。本研究利用多個生物信息學(xué)工具從多個方面分析了牛NAD(+)IDH的理化性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)牛NAD(+)IDH無跨膜結(jié)構(gòu)，具有信號肽且位于β亞基N端第1-16位的氨基酸上，屬于親水性蛋白質(zhì)，整體呈堿性，亞細(xì)胞定位在線粒體中。異檸檬酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)反應(yīng)中的關(guān)鍵酶之一，在三羧酸循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。三羧酸循環(huán)在線粒體中進(jìn)行[28]，據(jù)此推斷牛NAD(+)IDH的肽鏈在核糖體上合成之后經(jīng)進(jìn)一步折疊組裝，α、β和γ亞基以2∶1∶1的比例相結(jié)合，并在β亞基N端1-16位氨基酸殘基信號肽的介導(dǎo)下進(jìn)入線粒體參與三羧酸循環(huán)反應(yīng)。這一推斷與Chen等(1990)對哺乳動物NAD(+)IDH的研究結(jié)果相吻合[13]。

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN三個亞基的二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋，并且α螺旋與β折疊排列緊湊有序，可以形成一定的結(jié)構(gòu)域。此外還發(fā)現(xiàn)β亞基與γ亞基的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋和β折疊的位置相似，這種相似性與功能的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測吻合度分析結(jié)果表明亞基IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN三級結(jié)構(gòu)模型中指認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)分布與Jpred和SOPMA所預(yù)測的三個亞基二級結(jié)構(gòu)結(jié)果相一致，同時也表明Jpred和SOPMA所預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)信息是可信的。文獻(xiàn)報道表明，Rushbrook等人在牛心線粒體中分離出NAD(+)IDH[10]，在本研究中牛NAD(+)IDH亞細(xì)胞定位在線粒體中，本研究有關(guān)牛NAD(+)IDH亞細(xì)胞定位的結(jié)果與Rushbrook等人的實驗研究結(jié)果相一致。除此之外，本研究中有關(guān)牛NAD(+)IDH的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測、親/疏水性、信號肽預(yù)測以及跨膜區(qū)預(yù)測等目前尚未發(fā)現(xiàn)實驗研究報道，對于本研究中有關(guān)牛NAD(+)IDH蛋白的預(yù)測結(jié)果有待進(jìn)一步的實驗研究。

哺乳動物中存在的NAD(+)IDH蛋白的各個亞基在進(jìn)化過程中表現(xiàn)出較高的同源性，然而有關(guān)NAD(+)IDH蛋白各個亞基殘基的改變對亞基構(gòu)象有怎樣的影響以及這種影響的生物學(xué)意義目前尚無文獻(xiàn)報道。本研究有關(guān)牛NAD(+)IDH蛋白IDH3A_BOVIN、IDH3B_BOVIN和IDH3G_BOVIN三個亞基的生物信息學(xué)分析將有助于從生化和分子角度闡明哺乳動物尤其是人的IDH如何影響腫瘤的形成。

此外，有助于闡明DH3β與APC/C的分子對接機(jī)制、IDH3α的活性結(jié)構(gòu)域的靶向調(diào)節(jié)以及腫瘤生長機(jī)制等[7, 8, 24, 30]。